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摘 要 以红掌品种‘樱桃红’正常株及其疑似变异株为试验材料，采用形态学特征比较、流式细胞仪检测及染色体计数法对其进行鉴定。结果表明： 疑似变异株与正常株在叶片宽度、叶片长度/叶片宽度、叶片厚度、叶柄长度、叶柄粗细、花梗粗细、佛焰苞厚度方面差异显著，疑似变异株的气孔长度和花粉粒直径显著高于正常株，气孔密度显著低于正常株；疑似变异株的叶片单细胞DNA含量是正常株的2倍，根尖细胞染色体数目为2n=4x=60，为正常株2n=2x=30的2倍。结果证实了该疑似变异株为四倍体，是作为研究红掌的遗传变异和进行多倍体育种的较好材料。
关键词 红掌品种‘樱桃红’；变异株；多倍体鉴定
中图分类号 S682.3 文献标识码 A
Abstract The morphology， flow cytometric analysis and chromosome counting were used to identify the suspected polyploid in Anthurium andraeanum‘Cherry red’. The results showed that： comparing with the normal diploid plants， the variant showed significant differences on the morphological indicators of leaf width， leaf length/width， leaf thickness， petiole length， pedicel thick coarse and spathe thickness.， the stomatal length and pollen diameter were increased， and the stomatal density was decreased significantly. Both the DNA content and chromosome number（2n=4x=60）were twice of that diploid plants. These results showed that the tested suspected variant was a tetraploid plant， which provides a novel material for the research of Anthurium genetic variation and ploidy breeding.
Key word Anthurium andraeanum‘Cherry Red’； Variant； Polyploid identification
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.007
染色体加倍是真核生物（尤其是有花植物）进化的主要原动力[1]，也是植物育种的重要手段[2]。多倍体常常表现茎粗、叶厚、花瓣变厚、变多，抗性改变以及育性恢复等[3-5]，因此，多倍体材料在研究物种的遗传进化以及新品种培育中具有重要的利用价值。多倍体鉴定的方法主要有形态学鉴定、生理生化指标鉴定、细胞学鉴定、流式细胞仪鉴定和染色体计数等，各种鉴定方法经常综合应用，相互印证。目前在白掌、月季、山茶、文心兰、鹤顶兰[2，6-10]等观赏植物中通过人工诱导和鉴定，获得多倍体种质。
红掌（Anthurium andraeanum）是世界重要的切花和盆花。目前红掌育种方法主要采用杂交育种，染色体加倍技术也有一些报道，红掌品种‘Pink Champion’、‘Tropical’、‘Arizona’等通过人工诱导和鉴定获得了同源四倍体植株[11-12]，少数多倍体红掌新品种已经被选育和应用。要选育出更多的多倍体红掌新品种需要一定的红掌多倍体亲本材料，而对红掌倍性的鉴定是比较重要的步骤。在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所红掌种质资源圃中发现一株红掌品种‘樱桃红’（‘Cherry Red’）疑似倍性变异株，与正常株相比，该植株粗壮、叶片短圆、肉穗花序短粗，具有多倍体的形态特征。本研究以该疑似变异株和正常株为试验材料，采用形态学特征比较、流式细胞仪检测及染色体计数法对其进行鉴定，旨在建立红掌多倍体鉴定技术体系，确定其倍性水平，为红掌多倍体育种奠定技术和材料基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所种植的红掌品种‘樱桃红’疑似变异株及正常株。
1.2 方法
1.2.1 形态学特征比较 外观形态特征比较：取正常植株与变异株，按花烛属DUS测试指南[13]来测量叶片长度、叶片宽度、叶柄长度、花梗长度、花梗粗细、佛焰苞长度、佛焰苞宽度、肉穗花序长度、肉穗花序粗细。叶片厚度、叶柄粗细、佛焰苞厚度用游标卡尺测量。
叶片气孔大小和密度比较：取正常植株与变异株完全展开的成熟叶片，在叶片下表皮均匀涂上一层透明指甲油，待指甲油干后，用镊子挑取其表皮置于有蒸馏水的载玻片上，吸取多余的水分，加盖玻片后在Leica DM2500生物显微镜下观察测量。每片至少观察10个视野，记录每个视野内气孔器的个数，每个片选取30个气孔，测量每个气孔器的长度和宽度。
花粉粒大小比较：取成熟花粉粒置于载玻片上，滴一滴醋酸洋红后加盖玻片在Leica DM2500生物显微镜下测量。每制片取30个花粉粒，测量其直径。
1.2.2 倍性检测 流式细胞仪检测：取正常植株与变异株未完全展开的嫩叶0.10 g，置于含1 mL WPB缓冲液（0.2 mol/L Tris-HCl，86 mmol/L NaCl，10 mmol/L 焦亚硫酸钠，4 mmol/L MgCl2-6H2O，2 mmol/L EDTA-Na2·2H2O，1% PVP-10，1%（V/V）Triton X-100，pH7.5）[14]的培养皿中用刀片剁碎，2 min后用300目尼龙网过滤，滤液加入50 μL 10 mg/mL DAPI，5 min后上机检测，仪器为美国贝克曼公司的Cell Lab Quanta SC，软件为仪器自带，设置正常植株在200通道。 染色体观察：按朱澂[15]的方法，取成熟植株新长出的根尖，冲洗干净后，用饱和的对二氯苯溶液于4 ℃冰箱中预处理3～5 h，蒸馏水洗2～3次，后用卡诺固定液（95%乙醇 ∶ 冰乙酸=3 ∶ 1）于4 ℃固定4～20 h，1 mol/L盐酸于60 ℃解离2～3 min，改良的石炭酸品红染色压片。Leica DM2500生物显微镜镜检拍照并统计染色体数目。
1.3 试验数据处理
采用Excel和dps 8.1统计分析软件进行统计和分析。
2 结果与分析
2.1 红掌品种‘樱桃红’变异株与正常株的形态学特征比较
红掌品种‘樱桃红’的变异株与正常株相比，植株松散（图1-A），叶片短圆（图1-B）、佛焰苞也更短圆及更有光泽（图1-C）；花不高于叶片。对两者器官的形态学特征比较结果如表1所示：变异株在叶片长度、叶片宽度、叶片厚度、叶柄长度等性状上都高于正常株，叶片长度/宽度小于正常株。其中叶片宽度、叶片长度/宽度、叶片厚度、叶柄长度、叶柄粗细差异显著。花梗长度、佛焰苞长度、佛焰苞长度/宽度、肉穗花序长度低于正常株，但差异不显著，花柄粗细、佛焰苞宽度、佛焰苞厚度、肉穗花序粗细高于正常株，其中花柄粗细、佛焰苞厚度差异显著。
红掌品种‘樱桃红’变异株与正常株的气孔比较见图2，花粉粒比较见图3。从表2可见，变异株气孔长度和宽度为36.44 μm和22.13 μm，大于二倍体气孔的长度（29.33 μm）和宽度（21.38 μm）。经方差分析比较，二者气孔长度存在显著差异，气孔宽度差异不显著。变异株单位面积气孔数为55.50个，显著低于二倍体植株单位面积的气孔数。变异株的花粉粒直径为27.08 μm，显著大于二倍体花粉粒直径。
2.2 红掌品种‘樱桃红’变异株与正常株的染色体分析
由叶片单细胞DNA含量分布（图4）可以看出，变异株的峰值在荧光强度为400通道的位置，二倍体植株的峰值在荧光强度为200通道的位置，这说明变异株叶片单细胞DNA含量是二倍体的2倍。
对变异株和正常二倍体植株根尖染色体制片发现，对照二倍体根尖细胞染色体数为2n=2x=30（图5-G1）；变异株2n=4x=60（图5-G2）。变异株根尖细胞染色体数目为二倍体植株的2倍。可以确定该变异株为四倍体。
3 讨论与结论
植物多倍体的形成有自然发生和人工诱导两种方式。自然发生常见的途径有植物受内外因素变化的影响，孢母细胞在减数分裂过程中产生未减数配子，未减数配子受精结合，使染色体加倍[16]；或者生长点体细胞突变形成多倍体。自然发生多倍体在植物界普遍发生，并在植物有性多倍化中起到非常重要的作用，但该发生方式频率较低[17-18]。人工诱导途径是指在人为条件下，利用物理、化学等方法诱导产生未减数配子和生长点突变产生多倍体，或者利用体细胞杂交、胚乳培养、不同倍性杂交等生物学途径产生多倍体[19]。本试验材料为田间发现的变异株，这可能是在红掌种苗生产过程中，由于培养激素的累积，或者生长点由于切割的原因，产生机械损伤，分生组织细胞有丝分裂异常，导致体细胞染色体加倍，经过多次的增殖与分化后，形成多倍体植株。这是人工诱导产生多倍体的方式之一。 相较于二倍体来说，多倍体在植株外部形态上会有所改变，如叶片变短圆、厚度增加、叶色加深、花瓣变厚、气孔变大、气孔密度降低、花粉粒变大等[3-4，20]。外部形态的变化可以作为初步鉴定多倍体的方法，枣树、狼尾草、紫薇、泡桐、杨树等多倍体植株的鉴定，形态学特征和气孔指数就作为一个鉴定指标[21-25]。本试验结果亦表明红掌品种‘樱桃红’的多倍体与二倍体相比，植株形态差别较大，可以作为筛选多倍体的重要参数，与张志胜等[11]对人工诱导红掌多倍体植株的研究结果一致。
但是单靠形态上的参数来确定植物倍性是不够准确的，需要进一步倍性鉴定，流式细胞仪检测和染色体计数法是植株倍性水平直接可靠的方法。Zhang等[23]对紫薇多倍体鉴定时发现，根据形态特征初筛出的多倍体疑似植株经过流式细胞仪检测发现仅有50%为四倍体，其他为混倍体，李豆豆等[10]对人工诱导鹤顶兰多倍体鉴定时发现，部分变异植株在外部形态上发生变化，经染色体鉴定后为嵌合体。本研究对红掌品种‘樱桃红’疑似变异株进行经流式细胞仪检测和染色体计数确定为四倍体，未发现混倍体的存在。因此，本研究通过植株外部形态进行初筛，选出疑似多倍体，进一步通过流式细胞仪和染色体计数法确定其倍性，这对于红掌进行多倍体鉴定是可行的，为红掌多倍体育种后代倍性鉴定提供了可靠的方法。
参考文献
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关键词 红掌品种‘樱桃红’；变异株；多倍体鉴定
中图分类号 S682.3 文献标识码 A
Abstract The morphology， flow cytometric analysis and chromosome counting were used to identify the suspected polyploid in Anthurium andraeanum‘Cherry red’. The results showed that： comparing with the normal diploid plants， the variant showed significant differences on the morphological indicators of leaf width， leaf length/width， leaf thickness， petiole length， pedicel thick coarse and spathe thickness.， the stomatal length and pollen diameter were increased， and the stomatal density was decreased significantly. Both the DNA content and chromosome number（2n=4x=60）were twice of that diploid plants. These results showed that the tested suspected variant was a tetraploid plant， which provides a novel material for the research of Anthurium genetic variation and ploidy breeding.
Key word Anthurium andraeanum‘Cherry Red’； Variant； Polyploid identification
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.007
染色体加倍是真核生物（尤其是有花植物）进化的主要原动力[1]，也是植物育种的重要手段[2]。多倍体常常表现茎粗、叶厚、花瓣变厚、变多，抗性改变以及育性恢复等[3-5]，因此，多倍体材料在研究物种的遗传进化以及新品种培育中具有重要的利用价值。多倍体鉴定的方法主要有形态学鉴定、生理生化指标鉴定、细胞学鉴定、流式细胞仪鉴定和染色体计数等，各种鉴定方法经常综合应用，相互印证。目前在白掌、月季、山茶、文心兰、鹤顶兰[2，6-10]等观赏植物中通过人工诱导和鉴定，获得多倍体种质。
红掌（Anthurium andraeanum）是世界重要的切花和盆花。目前红掌育种方法主要采用杂交育种，染色体加倍技术也有一些报道，红掌品种‘Pink Champion’、‘Tropical’、‘Arizona’等通过人工诱导和鉴定获得了同源四倍体植株[11-12]，少数多倍体红掌新品种已经被选育和应用。要选育出更多的多倍体红掌新品种需要一定的红掌多倍体亲本材料，而对红掌倍性的鉴定是比较重要的步骤。在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所红掌种质资源圃中发现一株红掌品种‘樱桃红’（‘Cherry Red’）疑似倍性变异株，与正常株相比，该植株粗壮、叶片短圆、肉穗花序短粗，具有多倍体的形态特征。本研究以该疑似变异株和正常株为试验材料，采用形态学特征比较、流式细胞仪检测及染色体计数法对其进行鉴定，旨在建立红掌多倍体鉴定技术体系，确定其倍性水平，为红掌多倍体育种奠定技术和材料基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所种植的红掌品种‘樱桃红’疑似变异株及正常株。
1.2 方法
1.2.1 形态学特征比较 外观形态特征比较：取正常植株与变异株，按花烛属DUS测试指南[13]来测量叶片长度、叶片宽度、叶柄长度、花梗长度、花梗粗细、佛焰苞长度、佛焰苞宽度、肉穗花序长度、肉穗花序粗细。叶片厚度、叶柄粗细、佛焰苞厚度用游标卡尺测量。
叶片气孔大小和密度比较：取正常植株与变异株完全展开的成熟叶片，在叶片下表皮均匀涂上一层透明指甲油，待指甲油干后，用镊子挑取其表皮置于有蒸馏水的载玻片上，吸取多余的水分，加盖玻片后在Leica DM2500生物显微镜下观察测量。每片至少观察10个视野，记录每个视野内气孔器的个数，每个片选取30个气孔，测量每个气孔器的长度和宽度。
花粉粒大小比较：取成熟花粉粒置于载玻片上，滴一滴醋酸洋红后加盖玻片在Leica DM2500生物显微镜下测量。每制片取30个花粉粒，测量其直径。
1.2.2 倍性检测 流式细胞仪检测：取正常植株与变异株未完全展开的嫩叶0.10 g，置于含1 mL WPB缓冲液（0.2 mol/L Tris-HCl，86 mmol/L NaCl，10 mmol/L 焦亚硫酸钠，4 mmol/L MgCl2-6H2O，2 mmol/L EDTA-Na2·2H2O，1% PVP-10，1%（V/V）Triton X-100，pH7.5）[14]的培养皿中用刀片剁碎，2 min后用300目尼龙网过滤，滤液加入50 μL 10 mg/mL DAPI，5 min后上机检测，仪器为美国贝克曼公司的Cell Lab Quanta SC，软件为仪器自带，设置正常植株在200通道。 染色体观察：按朱澂[15]的方法，取成熟植株新长出的根尖，冲洗干净后，用饱和的对二氯苯溶液于4 ℃冰箱中预处理3～5 h，蒸馏水洗2～3次，后用卡诺固定液（95%乙醇 ∶ 冰乙酸=3 ∶ 1）于4 ℃固定4～20 h，1 mol/L盐酸于60 ℃解离2～3 min，改良的石炭酸品红染色压片。Leica DM2500生物显微镜镜检拍照并统计染色体数目。
1.3 试验数据处理
采用Excel和dps 8.1统计分析软件进行统计和分析。
2 结果与分析
2.1 红掌品种‘樱桃红’变异株与正常株的形态学特征比较
红掌品种‘樱桃红’的变异株与正常株相比，植株松散（图1-A），叶片短圆（图1-B）、佛焰苞也更短圆及更有光泽（图1-C）；花不高于叶片。对两者器官的形态学特征比较结果如表1所示：变异株在叶片长度、叶片宽度、叶片厚度、叶柄长度等性状上都高于正常株，叶片长度/宽度小于正常株。其中叶片宽度、叶片长度/宽度、叶片厚度、叶柄长度、叶柄粗细差异显著。花梗长度、佛焰苞长度、佛焰苞长度/宽度、肉穗花序长度低于正常株，但差异不显著，花柄粗细、佛焰苞宽度、佛焰苞厚度、肉穗花序粗细高于正常株，其中花柄粗细、佛焰苞厚度差异显著。
红掌品种‘樱桃红’变异株与正常株的气孔比较见图2，花粉粒比较见图3。从表2可见，变异株气孔长度和宽度为36.44 μm和22.13 μm，大于二倍体气孔的长度（29.33 μm）和宽度（21.38 μm）。经方差分析比较，二者气孔长度存在显著差异，气孔宽度差异不显著。变异株单位面积气孔数为55.50个，显著低于二倍体植株单位面积的气孔数。变异株的花粉粒直径为27.08 μm，显著大于二倍体花粉粒直径。
2.2 红掌品种‘樱桃红’变异株与正常株的染色体分析
由叶片单细胞DNA含量分布（图4）可以看出，变异株的峰值在荧光强度为400通道的位置，二倍体植株的峰值在荧光强度为200通道的位置，这说明变异株叶片单细胞DNA含量是二倍体的2倍。
对变异株和正常二倍体植株根尖染色体制片发现，对照二倍体根尖细胞染色体数为2n=2x=30（图5-G1）；变异株2n=4x=60（图5-G2）。变异株根尖细胞染色体数目为二倍体植株的2倍。可以确定该变异株为四倍体。
3 讨论与结论
植物多倍体的形成有自然发生和人工诱导两种方式。自然发生常见的途径有植物受内外因素变化的影响，孢母细胞在减数分裂过程中产生未减数配子，未减数配子受精结合，使染色体加倍[16]；或者生长点体细胞突变形成多倍体。自然发生多倍体在植物界普遍发生，并在植物有性多倍化中起到非常重要的作用，但该发生方式频率较低[17-18]。人工诱导途径是指在人为条件下，利用物理、化学等方法诱导产生未减数配子和生长点突变产生多倍体，或者利用体细胞杂交、胚乳培养、不同倍性杂交等生物学途径产生多倍体[19]。本试验材料为田间发现的变异株，这可能是在红掌种苗生产过程中，由于培养激素的累积，或者生长点由于切割的原因，产生机械损伤，分生组织细胞有丝分裂异常，导致体细胞染色体加倍，经过多次的增殖与分化后，形成多倍体植株。这是人工诱导产生多倍体的方式之一。 相较于二倍体来说，多倍体在植株外部形态上会有所改变，如叶片变短圆、厚度增加、叶色加深、花瓣变厚、气孔变大、气孔密度降低、花粉粒变大等[3-4，20]。外部形态的变化可以作为初步鉴定多倍体的方法，枣树、狼尾草、紫薇、泡桐、杨树等多倍体植株的鉴定，形态学特征和气孔指数就作为一个鉴定指标[21-25]。本试验结果亦表明红掌品种‘樱桃红’的多倍体与二倍体相比，植株形态差别较大，可以作为筛选多倍体的重要参数，与张志胜等[11]对人工诱导红掌多倍体植株的研究结果一致。
但是单靠形态上的参数来确定植物倍性是不够准确的，需要进一步倍性鉴定，流式细胞仪检测和染色体计数法是植株倍性水平直接可靠的方法。Zhang等[23]对紫薇多倍体鉴定时发现，根据形态特征初筛出的多倍体疑似植株经过流式细胞仪检测发现仅有50%为四倍体，其他为混倍体，李豆豆等[10]对人工诱导鹤顶兰多倍体鉴定时发现，部分变异植株在外部形态上发生变化，经染色体鉴定后为嵌合体。本研究对红掌品种‘樱桃红’疑似变异株进行经流式细胞仪检测和染色体计数确定为四倍体，未发现混倍体的存在。因此，本研究通过植株外部形态进行初筛，选出疑似多倍体，进一步通过流式细胞仪和染色体计数法确定其倍性，这对于红掌进行多倍体鉴定是可行的，为红掌多倍体育种后代倍性鉴定提供了可靠的方法。
参考文献
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