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摘要 [目的]利用响应面分析方法的中心组合试验设计对巴西虫草生产菌株分泌多糖的培养条件进行优化，以得到提高产量的最优条件。 [方法]使用Plackett-Burman分析和响应面中心组合分析法对巴西虫草生产菌株GC-88-4进行培养条件优化。[结果]9个有可能影响巴西虫草分泌多糖产量的因素经过响应面中心组合方法分析后得出3个最显著的影响因子，分别为米粉、葡萄糖和硫酸镁，优化后米粉含量为29.5 g/L，葡萄糖为7.3 g/L，硫酸镁为1.1 g/L，巴西虫草生产菌株在优化后的培养条件中分泌多糖平均含量达到6.65 mg/ml，优化后培养条件在500 L发酵罐所分泌的巴西虫草多糖含量达到7.2 mg/ml。 [结论]经优化后巴西虫草多糖含量提高58.4%，而且优化结果稳定，为放大生产提供了指导。
关键词 巴西虫草多糖；培养基条件优化；响应面分析法；中心组合分析
中图分类号 S188；TS202.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）18-052-04
冬虫夏草（Cordyceos sinensis）是我国传统名贵的强壮滋补药材，由于其生长条件和寄生条件特殊，多长于高原地区，加上近年来人们过度开采，生长环境受到破坏，天然的虫草非常紧缺[1]。天然冬虫夏草以及人工冬虫夏草的提取多糖经成分分析发现其主要成分为甘露糖、半乳糖、葡萄糖等，为高度分枝的杂多糖[2]。虫草多糖无色无味，具有良好的水溶性和稳定性，无毒副作用，可以提高机体免疫力，抑制肿瘤和增强单核巨噬细胞吞噬能力，能应用于医疗保健领域，目前已有相关研究[3]。
1988年广东省农业科学院蚕业研究所的研究人员采集到了一株虫草菌种，经鉴定为巴西虫草（Cordyces brasilienesis Henn.），该菌株GC-88-4已保存于广州市微生物研究所，并已有初步的研究[4]。近年来已有用正交设计法和单因素分析对巴西虫草的液体培养基优化的报道[5]。正交方法注重科学合理安排试验，可以同时考虑多个因素，但该方法的局限性在于不能综合考虑多因素之间的交互作用，优化出的工艺通常不是最优方案。而Plackett-Burman和响应面分析法的应用则能综合考虑到因素间的交互作用，目前已经在微生物培养方法的优化工作中开始使用，并已有成效。蔡友华等利用响应面法对巴西虫草培养基进行了优化，提高了其菌丝体生物量[6]。笔者选取9个对巴西虫草生产菌株GC-88-4分泌多糖的因素进行试验设计，根据试验结果筛选出对其分泌多糖有显著影响作用的因子，再使用响应面中心组合的分析方法，通过数据分析，得出回归方程并解得最优条件，在500 L规模进行中试发酵试验，并进行验证，为日后的研究提供帮助。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌种。巴西虫草生产菌GC-88-4为广州市微生物研究所保藏。
1.1.2 培养基。种子培养基：蔗糖20.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，MgSO4·7H2O 3.0 g/L，KH2PO4 3.0 g/L，（NH4）2SO4 10.0 g/L，pH 6.5。发酵培养基：米粉15.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，蚕蛹水解物10.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，pH 7。固体斜面培养基：马铃薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，琼脂粉20.0 g/L，pH 7。
1.1.3 仪器设备。752型分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；pHS-25 数显酸度计（上海雷磁仪器厂）；50、500 L不锈钢发酵罐（上海洋格生物工程设备有限公司）。
1.2 菌株培养方法及样品处理 虫草斜面活化后，转接入500 ml种子摇瓶中，每瓶装液量为100 ml，培养条件为200 r/min、28 ℃，培养26 h后以5%接种量转接至发酵摇瓶中，每瓶装液量为100 ml，200 r/min、28 ℃培养7 d，按照如下步骤进行样品处理。将发酵液4 000 r/min离心，弃去上清，于60 ℃烘干。称量2 g样品粉末，加入80 ml纯化水后加热煮沸1 h，过程中适量补水，最终定容至80 ml，过滤取上清5 ml滤液加入20 ml乙醇，于4 ℃静置，4 000 r/min离心得粗多糖产物。
1.3 虫草多糖测定 采用苯酚-硫酸法[7]。
1.3.1 葡萄糖标准曲线的制作。准确称取无水葡萄糖标准品0.06 g，并加水溶解定容至250 ml，配成0.24 mg/ml的葡萄糖标准溶液，分别量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml置于25 ml比色管中，加水补足至1 ml，并加入新鲜配制的5%苯酚溶液1.5 ml，浓硫酸7.5 ml，水浴煮沸15 min，补水至10.0 ml，于488 nm下测定吸光度，并制作葡萄糖含量与吸光度的标准曲线。
1.3.2 样品测定。按照“1.2”中方法处理样品后，用水溶解粗多糖产物，定容至10 ml，取0.1 ml至25 ml比色管，加水至1 ml，按照“1.3.1”方法显色，代入标准曲线，乘以稀释倍数，测得多糖含量。
1.4 培养基优化方法
1.4.1 Plackett-Burman法筛选影响产多糖的重要因素。归纳影响巴西虫草分泌多糖含量的可能因素为米粉、葡萄糖、蚕蛹水解物、硫酸二氢钾、硫酸镁、初始pH、培养温度、接种量以及接种龄9个因素， Design Expert软件运行Plackett-Burman试验设计[8]见表1，按照设计进行试验并根据反馈数据的P值确定各因素的显著水平。
1.4.2 中心组合响应面试验设计。对Plachett-Burman试验结果进行分析可知，米粉、葡萄糖、硫酸镁3个因子是影响巴西虫草分泌多糖的显著因素（P<0.05），因此其余因素不变，将这3个因素作为中心组合响应面试验研究对象进行爬坡试验，然后以巴西虫草分泌的多糖含量作为响应值设计中心组合响应面试验，根据Design Expert软件设计出的试验方法进行试验得出最优条件。中心组合试验设计的因素水平以及编码见表2。 2 结果与分析
2.1 Plackett-Burman法筛选影响巴西虫草分泌多糖的重要因素 以巴西虫草分泌的多糖含量为响应值分别对米粉、葡萄糖、蚕蛹水解物、硫酸镁、硫酸二氢钾、初始pH、培养温度、接种量以及接种龄9个因子进行计算，得出各因子的显著水平。按试验因素的水平，利用Plackett-Burman进行试验设计，设计出的试验共进行12次，根据设计进行试验得到相应的巴西虫草分泌多糖含量，试验结果见表3。根据其P值得出各因素显著性结果，具体数据见表4。
由表4可知，因素B、C、F的P值均小于0.05，因此可以认为米粉、葡萄糖、硫酸镁是影响巴西虫草分泌多糖含量的显著因子。选择上述3个因素作为主要研究因子进行中心组合响应面试验，其余因子则根据其在Plackett-Burman试验中相应的T值正负效应选取高水平或低水平，分别为：磷酸二氢钾、初始pH、培养温度、接种量和接种龄为高水平，蚕蛹水解物为低水平，即以后优化培养基为磷酸二氢钾（2.0 g/L）、初始pH（7）、培养温度（28 ℃）、接种量（10%）、接种龄（26 h）、蚕蛹水解物（10.0 g/L）。
2.2 响应面中心组合试验
2.2.1 最陡爬坡筛选试验。从Plackett-Burman试验分析的结果可知，对巴西虫草分泌多糖影响最显著的因子为米粉、葡萄糖和硫酸镁，因此主要对这3个因子进行最陡爬坡试验，其余因子选择Plackett-Burman试验中的中心点值，并确定出这3个因子的步长。分析Plackett-Burman试验中的结果，计算得出米粉、葡萄糖和硫酸镁的步长，并设计最陡爬坡试验参数见表5，以分泌多糖的含量作为响应值进行最陡爬坡试验。
由表5可知，6组试验中，第4组中巴西虫草分泌多糖含量达6.5 mg/ml，在试验组横向比较中含量最高。因此，选择第4组数据的参数作为中心组合响应面试验的中心点。
2.2.2 中心组合试验设计。分别设定因素A、B、C代表最陡爬坡试验中3个主要显著因素米粉、葡萄糖、硫酸镁，设每组试验分泌的多糖含量为响应值Y，根据中心组合试验设计试验的因素水平，运行软件设计得出中心组合试验，根据20组试验条件进行试验并测定各试验组多糖含量，表6为试验设计及运行结果。
根据响应面中心组合试验结果，利用Design Expert软件的分析功能对其数据进行分析，得到的编码回归方程为：
Y=6.53+0.33×A+0.32×B-0.27×C-0.30×A×B+0.19×A×C+0.24×B×C-0.61×A2-0.37×B2-0.50×C2
该模型总P值等于0.000 1，说明模型回归显著，R2越大，表明该模型预测值越精准，试验中R2为0.928 3，表明该模型拟合良好，模型中Adj-R2为0.863 8，只有13.62%的变异超出该模型解释范围，证明该模型基本可靠。试验中一次项和二次项的P值都是显著的，而交互项则不显著，说明三因素间交互作用不明显。试验中的变异系数（CV%）为5.18，变异系数越低表明试验可靠性越高。试验信噪比为11.126，大于4的信噪比说明试验中的因子都具有较强的信号。
使用Design Expert软件根据试验参数绘制分析结果响应面图，如图1～3所示，可以看出该模型等高线图为椭圆形，具有中心点，因此能得出最优解，利用软件进行分析求得若要分泌多糖含量最高则该3个因素为米粉（29.5 g/L）、葡萄糖（7.3 g/L）、硫酸镁（1.1 g/L）。
2.3 验证试验 为证实预测值与真实值之间的拟合程度是否符合预期，使用优化后培养条件对相同的生产菌株进行重复验证试验：米粉（29.5 g/L）、葡萄糖（7.3 g/L）、硫酸镁（1.1 g/L）、磷酸二氢钾（2.0 g/L）、初始pH（7）、培养温度（28 ℃）、接种量（10%）、接种龄（26 h）、蚕蛹水解物（10.0 g/L），试验共进行3组，试验结果分别为6.4、6.7、6.7 mg/ml，平均多糖含量为6.65 mg/ml，表明预测值与真实值之间有很好的拟合性，且比优化前的多糖产量提高58.4%。
2.4 发酵中试试验 为验证优化的条件是否适合放大生产并确定该模型可靠性，使用优化后条件在500 L规模的发酵罐上进行放大验证性发酵试验。除上述条件外，其余条件发酵培养分别为搅拌转速200 r/min，通风量15 m3/h，罐压保持在0.6 MPa。发酵罐培养运作7 d后放罐处理，根据相同的检测方法测得多糖含量达7.2 mg/ml，明显高于摇瓶中的结果，推测其可能原因在于发酵罐培养过程中规模大的发酵罐提供溶氧水平高，而大型真菌类多数需要高溶氧提供生长所需要的耗氧，因此更利于菌体生长，同时代谢出的多糖产物更多。
3 结论
国内外许多学者通过使用响应面的方法优化培养条件，并取得成功，该试验通过使用Plackett-Burman设计方法筛选出对巴西虫草分泌多糖影响的显著因子，根据分析使用中心组合响应面试验对显著因子进行优化，采用多元二次回归方程，通过软件求偏导解出最优解。优化后培养条件及培养基为：米粉（29.5 g/L）、葡萄糖（7.3 g/L）、硫酸镁（1.1 g/L）、磷酸二氢钾（2.0 g/L）、初始pH（7）、培养温度（28 ℃）、接种量（10%）、接种龄（26 h）、蚕蛹水解物（10.0 g/L）。使用优化后培养条件进行试验摇瓶多糖含量达到6.65 mg/ml，比优化前含量提高了58.4%，优化后的培养条件有利于GC-88-4的生长以及多糖含量的合成与分泌。为验证预期模拟值与真实值的拟合程度以及放大生产是否可行，进行500 L规模发酵罐放大中试试验，使其接种量达到10%，最终发酵液中多糖含量检测能达到7.2 mg/ml。通过试验验证，经过响应面中心组合方法优化后的培养基实际值与软件理论值拟合良好，表明该方法在培养基优化中能起到指导作用，具有重大意义。
参考文献
[1] 陈晋安，黄浩，郑忠辉，等.蛹虫草液体发酵条件的研究[J].集美大学学报：自然科学版，2001，6（3）：219-222.
[2] 武忠伟，刘明久，窦艳萍，等.虫草多糖醇沉和DEAE-32纤维素柱层析特性研究[J].食品科学，2008，29（2）：86-90.
[3] 何雅军，吴谦，朱瑞斐，等.虫草多糖脂质体对小鼠肝损伤的保护作用[J].中西医结合肝病杂志，1996，6（1）：14-16.
[4] 梁淑娃，方展瑞，翁照南，等.冬虫夏草菌丝体深层发酵技术的研究[J].广州食品工业科技，2000，12（1）：25-27.
[5] 杨荣玲，陈卫东，赵祥杰，等.巴西虫草液体培养条件的优化[J].中国食用菌，2007，26（1）：50-54.
[6] 蔡友华，范文霞，刘学铭，等.响应面法优化巴西虫草发酵培养基的研究[J].食用菌学报，2007，14（2）：55-59.
[7] 来永斌，王琦，孙月，等.蛹虫草多糖含量的测定与分析[J].中成药，2001，23（7）：517-518.
[8] 吴有炜.试验设计与数据处理[M].苏州：苏州大学出版社，2003.
关键词 巴西虫草多糖；培养基条件优化；响应面分析法；中心组合分析
中图分类号 S188；TS202.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）18-052-04
冬虫夏草（Cordyceos sinensis）是我国传统名贵的强壮滋补药材，由于其生长条件和寄生条件特殊，多长于高原地区，加上近年来人们过度开采，生长环境受到破坏，天然的虫草非常紧缺[1]。天然冬虫夏草以及人工冬虫夏草的提取多糖经成分分析发现其主要成分为甘露糖、半乳糖、葡萄糖等，为高度分枝的杂多糖[2]。虫草多糖无色无味，具有良好的水溶性和稳定性，无毒副作用，可以提高机体免疫力，抑制肿瘤和增强单核巨噬细胞吞噬能力，能应用于医疗保健领域，目前已有相关研究[3]。
1988年广东省农业科学院蚕业研究所的研究人员采集到了一株虫草菌种，经鉴定为巴西虫草（Cordyces brasilienesis Henn.），该菌株GC-88-4已保存于广州市微生物研究所，并已有初步的研究[4]。近年来已有用正交设计法和单因素分析对巴西虫草的液体培养基优化的报道[5]。正交方法注重科学合理安排试验，可以同时考虑多个因素，但该方法的局限性在于不能综合考虑多因素之间的交互作用，优化出的工艺通常不是最优方案。而Plackett-Burman和响应面分析法的应用则能综合考虑到因素间的交互作用，目前已经在微生物培养方法的优化工作中开始使用，并已有成效。蔡友华等利用响应面法对巴西虫草培养基进行了优化，提高了其菌丝体生物量[6]。笔者选取9个对巴西虫草生产菌株GC-88-4分泌多糖的因素进行试验设计，根据试验结果筛选出对其分泌多糖有显著影响作用的因子，再使用响应面中心组合的分析方法，通过数据分析，得出回归方程并解得最优条件，在500 L规模进行中试发酵试验，并进行验证，为日后的研究提供帮助。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌种。巴西虫草生产菌GC-88-4为广州市微生物研究所保藏。
1.1.2 培养基。种子培养基：蔗糖20.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，MgSO4·7H2O 3.0 g/L，KH2PO4 3.0 g/L，（NH4）2SO4 10.0 g/L，pH 6.5。发酵培养基：米粉15.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，蚕蛹水解物10.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，pH 7。固体斜面培养基：马铃薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，琼脂粉20.0 g/L，pH 7。
1.1.3 仪器设备。752型分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；pHS-25 数显酸度计（上海雷磁仪器厂）；50、500 L不锈钢发酵罐（上海洋格生物工程设备有限公司）。
1.2 菌株培养方法及样品处理 虫草斜面活化后，转接入500 ml种子摇瓶中，每瓶装液量为100 ml，培养条件为200 r/min、28 ℃，培养26 h后以5%接种量转接至发酵摇瓶中，每瓶装液量为100 ml，200 r/min、28 ℃培养7 d，按照如下步骤进行样品处理。将发酵液4 000 r/min离心，弃去上清，于60 ℃烘干。称量2 g样品粉末，加入80 ml纯化水后加热煮沸1 h，过程中适量补水，最终定容至80 ml，过滤取上清5 ml滤液加入20 ml乙醇，于4 ℃静置，4 000 r/min离心得粗多糖产物。
1.3 虫草多糖测定 采用苯酚-硫酸法[7]。
1.3.1 葡萄糖标准曲线的制作。准确称取无水葡萄糖标准品0.06 g，并加水溶解定容至250 ml，配成0.24 mg/ml的葡萄糖标准溶液，分别量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml置于25 ml比色管中，加水补足至1 ml，并加入新鲜配制的5%苯酚溶液1.5 ml，浓硫酸7.5 ml，水浴煮沸15 min，补水至10.0 ml，于488 nm下测定吸光度，并制作葡萄糖含量与吸光度的标准曲线。
1.3.2 样品测定。按照“1.2”中方法处理样品后，用水溶解粗多糖产物，定容至10 ml，取0.1 ml至25 ml比色管，加水至1 ml，按照“1.3.1”方法显色，代入标准曲线，乘以稀释倍数，测得多糖含量。
1.4 培养基优化方法
1.4.1 Plackett-Burman法筛选影响产多糖的重要因素。归纳影响巴西虫草分泌多糖含量的可能因素为米粉、葡萄糖、蚕蛹水解物、硫酸二氢钾、硫酸镁、初始pH、培养温度、接种量以及接种龄9个因素， Design Expert软件运行Plackett-Burman试验设计[8]见表1，按照设计进行试验并根据反馈数据的P值确定各因素的显著水平。
1.4.2 中心组合响应面试验设计。对Plachett-Burman试验结果进行分析可知，米粉、葡萄糖、硫酸镁3个因子是影响巴西虫草分泌多糖的显著因素（P<0.05），因此其余因素不变，将这3个因素作为中心组合响应面试验研究对象进行爬坡试验，然后以巴西虫草分泌的多糖含量作为响应值设计中心组合响应面试验，根据Design Expert软件设计出的试验方法进行试验得出最优条件。中心组合试验设计的因素水平以及编码见表2。 2 结果与分析
2.1 Plackett-Burman法筛选影响巴西虫草分泌多糖的重要因素 以巴西虫草分泌的多糖含量为响应值分别对米粉、葡萄糖、蚕蛹水解物、硫酸镁、硫酸二氢钾、初始pH、培养温度、接种量以及接种龄9个因子进行计算，得出各因子的显著水平。按试验因素的水平，利用Plackett-Burman进行试验设计，设计出的试验共进行12次，根据设计进行试验得到相应的巴西虫草分泌多糖含量，试验结果见表3。根据其P值得出各因素显著性结果，具体数据见表4。
由表4可知，因素B、C、F的P值均小于0.05，因此可以认为米粉、葡萄糖、硫酸镁是影响巴西虫草分泌多糖含量的显著因子。选择上述3个因素作为主要研究因子进行中心组合响应面试验，其余因子则根据其在Plackett-Burman试验中相应的T值正负效应选取高水平或低水平，分别为：磷酸二氢钾、初始pH、培养温度、接种量和接种龄为高水平，蚕蛹水解物为低水平，即以后优化培养基为磷酸二氢钾（2.0 g/L）、初始pH（7）、培养温度（28 ℃）、接种量（10%）、接种龄（26 h）、蚕蛹水解物（10.0 g/L）。
2.2 响应面中心组合试验
2.2.1 最陡爬坡筛选试验。从Plackett-Burman试验分析的结果可知，对巴西虫草分泌多糖影响最显著的因子为米粉、葡萄糖和硫酸镁，因此主要对这3个因子进行最陡爬坡试验，其余因子选择Plackett-Burman试验中的中心点值，并确定出这3个因子的步长。分析Plackett-Burman试验中的结果，计算得出米粉、葡萄糖和硫酸镁的步长，并设计最陡爬坡试验参数见表5，以分泌多糖的含量作为响应值进行最陡爬坡试验。
由表5可知，6组试验中，第4组中巴西虫草分泌多糖含量达6.5 mg/ml，在试验组横向比较中含量最高。因此，选择第4组数据的参数作为中心组合响应面试验的中心点。
2.2.2 中心组合试验设计。分别设定因素A、B、C代表最陡爬坡试验中3个主要显著因素米粉、葡萄糖、硫酸镁，设每组试验分泌的多糖含量为响应值Y，根据中心组合试验设计试验的因素水平，运行软件设计得出中心组合试验，根据20组试验条件进行试验并测定各试验组多糖含量，表6为试验设计及运行结果。
根据响应面中心组合试验结果，利用Design Expert软件的分析功能对其数据进行分析，得到的编码回归方程为：
Y=6.53+0.33×A+0.32×B-0.27×C-0.30×A×B+0.19×A×C+0.24×B×C-0.61×A2-0.37×B2-0.50×C2
该模型总P值等于0.000 1，说明模型回归显著，R2越大，表明该模型预测值越精准，试验中R2为0.928 3，表明该模型拟合良好，模型中Adj-R2为0.863 8，只有13.62%的变异超出该模型解释范围，证明该模型基本可靠。试验中一次项和二次项的P值都是显著的，而交互项则不显著，说明三因素间交互作用不明显。试验中的变异系数（CV%）为5.18，变异系数越低表明试验可靠性越高。试验信噪比为11.126，大于4的信噪比说明试验中的因子都具有较强的信号。
使用Design Expert软件根据试验参数绘制分析结果响应面图，如图1～3所示，可以看出该模型等高线图为椭圆形，具有中心点，因此能得出最优解，利用软件进行分析求得若要分泌多糖含量最高则该3个因素为米粉（29.5 g/L）、葡萄糖（7.3 g/L）、硫酸镁（1.1 g/L）。
2.3 验证试验 为证实预测值与真实值之间的拟合程度是否符合预期，使用优化后培养条件对相同的生产菌株进行重复验证试验：米粉（29.5 g/L）、葡萄糖（7.3 g/L）、硫酸镁（1.1 g/L）、磷酸二氢钾（2.0 g/L）、初始pH（7）、培养温度（28 ℃）、接种量（10%）、接种龄（26 h）、蚕蛹水解物（10.0 g/L），试验共进行3组，试验结果分别为6.4、6.7、6.7 mg/ml，平均多糖含量为6.65 mg/ml，表明预测值与真实值之间有很好的拟合性，且比优化前的多糖产量提高58.4%。
2.4 发酵中试试验 为验证优化的条件是否适合放大生产并确定该模型可靠性，使用优化后条件在500 L规模的发酵罐上进行放大验证性发酵试验。除上述条件外，其余条件发酵培养分别为搅拌转速200 r/min，通风量15 m3/h，罐压保持在0.6 MPa。发酵罐培养运作7 d后放罐处理，根据相同的检测方法测得多糖含量达7.2 mg/ml，明显高于摇瓶中的结果，推测其可能原因在于发酵罐培养过程中规模大的发酵罐提供溶氧水平高，而大型真菌类多数需要高溶氧提供生长所需要的耗氧，因此更利于菌体生长，同时代谢出的多糖产物更多。
3 结论
国内外许多学者通过使用响应面的方法优化培养条件，并取得成功，该试验通过使用Plackett-Burman设计方法筛选出对巴西虫草分泌多糖影响的显著因子，根据分析使用中心组合响应面试验对显著因子进行优化，采用多元二次回归方程，通过软件求偏导解出最优解。优化后培养条件及培养基为：米粉（29.5 g/L）、葡萄糖（7.3 g/L）、硫酸镁（1.1 g/L）、磷酸二氢钾（2.0 g/L）、初始pH（7）、培养温度（28 ℃）、接种量（10%）、接种龄（26 h）、蚕蛹水解物（10.0 g/L）。使用优化后培养条件进行试验摇瓶多糖含量达到6.65 mg/ml，比优化前含量提高了58.4%，优化后的培养条件有利于GC-88-4的生长以及多糖含量的合成与分泌。为验证预期模拟值与真实值的拟合程度以及放大生产是否可行，进行500 L规模发酵罐放大中试试验，使其接种量达到10%，最终发酵液中多糖含量检测能达到7.2 mg/ml。通过试验验证，经过响应面中心组合方法优化后的培养基实际值与软件理论值拟合良好，表明该方法在培养基优化中能起到指导作用，具有重大意义。
参考文献
[1] 陈晋安，黄浩，郑忠辉，等.蛹虫草液体发酵条件的研究[J].集美大学学报：自然科学版，2001，6（3）：219-222.
[2] 武忠伟，刘明久，窦艳萍，等.虫草多糖醇沉和DEAE-32纤维素柱层析特性研究[J].食品科学，2008，29（2）：86-90.
[3] 何雅军，吴谦，朱瑞斐，等.虫草多糖脂质体对小鼠肝损伤的保护作用[J].中西医结合肝病杂志，1996，6（1）：14-16.
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[7] 来永斌，王琦，孙月，等.蛹虫草多糖含量的测定与分析[J].中成药，2001，23（7）：517-518.
[8] 吴有炜.试验设计与数据处理[M].苏州：苏州大学出版社，2003.