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多发性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM）是浆细胞的恶性肿瘤，传统的化疗方案完全缓解率低，且副作用大。虽然近年来硼替佐米、沙利度胺等新药的应用，以及大剂量化疗联合Allo-HASCT的开展，完全缓解率提高，仍可能复发，尚无法彻底治愈。目前认为微小残留病灶（MRD）使MM容易复发和转移，并诱发耐药，导致疗效不佳。近年来，快速发展的过继细胞免疫治疗（ACI）在体外试验及动物模型中均取得了较理想的结果，有可能为MM患者带来新的希望。本文就ACI中细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells，CIK细胞）的一些基础研究现状及其在MM治疗中的应用现状和前景进行综述。
1.CIK细胞的生物学特性
1991年，斯坦福大学Schmidt-Wolf等[1，2]首次报道人外周血单个核细胞（PMC）在体外通过CD3单克隆抗体与多种细胞因子联合作用而培养出的具有细胞毒活性的杀伤细胞，即CIK细胞。Negrin等[3]证明诱导扩增出来的CD3+CD56+细胞并非来源于CD3-CD56+NK细胞，而是CD3+CD56-T细胞。CIK细胞的另外可来源于CD4-CD8+及 CD4-CD8-的 T 细胞。根据细胞受体〔TCR）的不同，可分成两种细胞亚群，即CD3+cD56+αβT细胞及CD3+CD56+γδ细胞[4]。成熟的CIK细胞膜表面主要分子有高度表达的CD3、CD11a、CD54、HLA-DR、CD56和中度表达的CD2、CD28、CD54，几乎不表达CD80和CD86 [5]。
2.不同来源的CIK细胞的作用比较研究
目前，自体外周血来源的CIK细胞在当前的实验研究和临床应用中较广泛，并已经取得了较好的成果及临床治疗效果[6]。黄文荣等[7]研究发现外周血来源的CIK细胞的增殖能力明显优于骨髓来源的CIK细胞，可能因为外周血和骨髓中免疫细胞的细胞因子调节网络以及分化程度的不同而导致了该差异的发生。王家祥等[8] 发现脐血来源的CIK细胞在增殖速度及殺伤活性两方面均明显优于外周血来源的CIK细胞。脐血CIK细胞与外周血CIK细胞的作用机制不同，前者以诱导肿瘤细胞坏死为主，而后者以诱导肿瘤细胞凋亡为主。综上所述，不同来源的CIK细胞具有不同的肿瘤细胞杀伤机制，故临床应用中应注意合理选择。
3.CIK细胞增殖与活性的影响因素
体外培养的CIK细胞的增殖与活性容易受到各种细胞因子及抗体类物质的影响。Schmidt等[9]通过单抗阻断试验测定了各种单抗对CIK细胞杀伤OC-LY8肿瘤细胞时杀伤效率的影响，其中抗IFA-l、抗ICAM-1几乎完全阻断了CIK细胞发挥细胞毒性作用；抗CD3抗体、抗αβTCR抗体只有部分阻断效应；而抗CD4、CD8、CD1lb、CD2、CD20、MHC-I、MHC-11及VLA-4等抗体对其活性基本无影响。研究已证实CIK细胞在受到IL-2和IL-7的刺激后高表达IFA-1及CD28、CD56，进而提高其杀瘤活性。
此外研究发现，CIK细胞的增殖活性、杀瘤能力与诸多因素有关，比如培养方式、细胞纯度、单次剂量、回输时间、途径、次数以及患者的个体差异等，尚需进一步探索和研究。
4.CIK细胞肿瘤杀伤的作用机制
CIK依赖其迁移粘附能力与改造体内免疫环境来实现体内杀瘤能力，其可能的作用机制包括以下几方面：
4.1分泌穿孔素和裂解酶裂解瘤细胞
CIK细胞为MHC非限制性的细胞毒细胞，溶解活性大。Mehta等[10]通过实验证实，CIK细胞在受到外源性抗CD3McAb或者敏感靶细胞刺激时，会向膜外空间释放具有细胞毒活性的胞浆颗粒，内容物主要为BLT酯酶，将直接杀伤靶细胞。另外，CIK细胞的穿孔形成蛋白（RFP）亦能溶解靶细胞，其活化后产生大量炎性细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，可通过直接抑制肿瘤细胞与调节机体免疫系统反应间接杀伤肿瘤细胞的双重机制发挥抗瘤作用。
4.2经Fas/FasL诱导瘤细胞凋亡；
凋亡调节蛋白的表达是机体细胞免疫的重要机制。靶细胞的内源性DNA切酶的激活可杀伤肿瘤细胞，该作用是通过细胞间配受体（Fas/FasL）的相互结合实现的。CIK细胞在培养过程中表达Fas-L，但与既往效应细胞不同，CIK细胞通过杀伤FasL+（即fas-）瘤细胞与抵抗FasL+瘤细胞诱导的细胞凋亡两种作用来实现的，且可长期维持其抗瘤活性[11]。IFN-γ等凋亡相关因子可通过上调肿瘤细胞Fas抗原的表达，促进肿瘤细胞的凋亡。
4.3分泌IFN-γ及IL-12等杀灭瘤细胞；
Marten等[12]发现，活化的CIK细胞可通过分泌IL-2、IFN-γ及IL-12等大量Thl类细胞因子，来调节体内其他细胞因子的分泌，增强其对肿瘤细胞杀伤作用的敏感性；CIK间接杀伤肿瘤的作用是通过上调肿瘤细胞的MHC分子及其刺激分子的表达进一步激活肿瘤特异性CTL、自然杀伤（NK）细胞实现的。
5.CIK细胞在MM患者中的临床应用研究进展
5.1CIK细胞联合树突状细胞（DC）的抗肿瘤机制
DC是激活机体特异性抗肿瘤免疫应答的关键，是功能最强的APC，其可诱导长久有力的抗肿瘤应答效应，是主动免疫及特异性免疫的代表。CIK是目前为止发现的最强的肿瘤杀伤活性免疫细胞，具有非限制性杀瘤能力。此两种治疗模式有机结合了主动与被动免疫，能更强效地杀伤肿瘤细胞，使得肿瘤免疫治疗得到新的突破。目前，以DC-CIK为基础的免疫化疗治疗MM已在临床开展[13]。张嵩等[14]通过观察DC与CIK细胞共同培养后，结果提示该方法可促进彼此的成熟。DC摄取瘤抗原，呈递给CIK，促进CIK活化进而主动杀伤瘤细胞；DC-CIK可一定程度上修复患者的免疫缺陷；能减轻化疗不良反应，且无异体排斥，临床应用安全性得到保证[15]。 5.2 CIK与化疗的联合治疗现，化疗与免疫治疗具有协同作用，前者可通过调节患者的免疫功能而增强抗肿瘤应答效应，其主要机制包含下述几方面：①化疗可导致瘤细胞的裂解，后者释放出大量胞内抗原，免疫原性得到提高[16]；②化疗可致更多T细胞分化成为记忆细胞，促进免疫记忆的建立，从而提高抗原特异性效应细胞的比例；③化疗可导致Treg大幅度下降，从而能解除其对效应细胞的抑制[17]；④化疗可减少淋巴细胞数量，使残留的T细胞能在重建的细胞因子网络中自稳性增生，有利于CIK细胞迅速活化并增殖。⑤化疗可通过降低肿瘤负荷来使肿瘤局部的免疫抑制性微环境发生改变，免疫杀伤效靶比得到提高；⑥某些化疗药物可促使瘤细胞高表达Fas，通过Fas/FasL诱导瘤细胞凋亡； ⑦CIK对耐药MM细胞高表达的P-gp极其敏感，可有效杀伤肿瘤细胞。综上所述，化疗虽然副作用大，但它为MM患者提供了非常有利于目前，大量研究发过继免疫细胞治疗的免疫环境[18]。
近来，四川省卫生厅科研基金项目（09013）研究，钟国成[19]等人对DC-CIK过继免疫联合化疗治疗多发性骨髓瘤的疗效分析中发现，免疫化疗组治疗后的免疫指标、生活质量及临床疗效均较化疗组明显提高，说明DC-CIK免疫治疗与化疗联合应用时有良好的协同作用。DC-CIK过继免疫联合化疗的治疗方案为多发性骨髓瘤患者提供了新的治疗模式[20]，有待进一步研究其具体的分子治疗机制。
5.3 CIK与沙利度胺的联合治疗
多发性骨髓瘤细胞（MC）的生长与新生血管的形成及机体免疫环境的改变有关。孙薏[21]等人在DC-CIK过继免疫联合沙利度胺治疗复发难治性多发性骨髓瘤的回顾性研究中发现，Thd可增强CIK细胞的免疫表型，且明显提高了DC-CIK对U266的杀伤率，免疫组患者的生活质量较对照组患者明显改善，认为该疗法有良好的临床疗效和应用价值。二者的联合治疗方案能提高疗效，却不增加毒副作用，起到优势互补及效果叠加的协同作用。
5.4 CIK在复发难治性MM中的应用
对于不能耐受化療的复发难治性多发性骨髓瘤患者，该疗法可以在一定程度上减轻症状，并能提高患者机体免疫力，减轻痛苦，使患者长期带瘤生存，故不失为一种理想的姑息治疗方法[22]。孙薏、张聪[23]等人在自体树突细胞联合细胞因子诱导杀伤细胞过继治疗复发难治性多发性骨髓瘤26例临床观察中发现，治疗后患者的生活质量（QOL）及肾功能、骨髓瘤细胞百分比、β2-MG、24小时尿液轻链含量等与治疗前相比均得到明显改善。
6、目前CIK治疗存在的问题
虽然该治疗有着广阔的应用前景，但还存在很多亟待解决的问题，主要包括：①患者体内外环境的不同，回输的CIK细胞在体内很难长时间维持其在体外的杀伤活性；②能否通过同步注射IL～2等细胞因子而进一步提高其疗效，需要进一步论证；③与其他方法（尤其是化疗）的有机整合需要进一步完善；建立CIK过继免疫治疗的统一方案。④医疗费用问题，目前单疗程的CIK治疗费用在3万人民币左右，大多不在报销范围，经济问题或许成为该治疗的瓶颈，限制了其在临床的应用。⑤质量安全问题，对于生物治疗而言，质量安全直接决定着治疗效果。若质控把关不严将会导致安全隐患。免疫细胞治疗技术作为三类医疗技术需要申报审核，但目前国家尚未出台相关的临床应用评价标准。故尤其需要注意严格掌握该治疗的适应症，相关操作必须在国家技术监督部门批准并验收的的GMP环境中进行，治疗前与患者及其（或）家属详细充分沟通，并签署治疗知情同意书。
7、结语
CIK细胞的高效杀瘤作用在实验室得到证实后，已在临床上逐步开展应用，其具有独特抗瘤优势与免疫支持作用，且临床应用较安全，并通过有机结合其他的治疗手段，如化疗、沙利度胺等，为MM患者提供了新的治疗策略，并取得了较好的临床治疗效果。但在具体方案实施及CIK细胞的最佳培养方式、单次剂量以及回输途径等方面需要进一步探索。相信随着对MM分子生物学机制的进一步阐明，关键技术的逐步完善，CIK很可能成为未来MM根治的重要手段[24]。
参考文献：
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[2] Lu PH，Negrin RS. A novel population of expanded humanCD3+CD56+cells derivedfrom T cells with potent in vivo antitumor activity in mice with severe combinedimmunodeficiency[J]. J Immunol，1994，153（4）：1687-1696.
[3].Negrin RS，Lu pH.A novel population of expanded humanCD3+、CD56+ cells derived from T eells with Potent in vivo antitumor activity in mice with severe combined immunodeficieney.J Immunol.1994 Aug15，153（4）：1687一96.
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1.CIK细胞的生物学特性
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2.不同来源的CIK细胞的作用比较研究
目前，自体外周血来源的CIK细胞在当前的实验研究和临床应用中较广泛，并已经取得了较好的成果及临床治疗效果[6]。黄文荣等[7]研究发现外周血来源的CIK细胞的增殖能力明显优于骨髓来源的CIK细胞，可能因为外周血和骨髓中免疫细胞的细胞因子调节网络以及分化程度的不同而导致了该差异的发生。王家祥等[8] 发现脐血来源的CIK细胞在增殖速度及殺伤活性两方面均明显优于外周血来源的CIK细胞。脐血CIK细胞与外周血CIK细胞的作用机制不同，前者以诱导肿瘤细胞坏死为主，而后者以诱导肿瘤细胞凋亡为主。综上所述，不同来源的CIK细胞具有不同的肿瘤细胞杀伤机制，故临床应用中应注意合理选择。
3.CIK细胞增殖与活性的影响因素
体外培养的CIK细胞的增殖与活性容易受到各种细胞因子及抗体类物质的影响。Schmidt等[9]通过单抗阻断试验测定了各种单抗对CIK细胞杀伤OC-LY8肿瘤细胞时杀伤效率的影响，其中抗IFA-l、抗ICAM-1几乎完全阻断了CIK细胞发挥细胞毒性作用；抗CD3抗体、抗αβTCR抗体只有部分阻断效应；而抗CD4、CD8、CD1lb、CD2、CD20、MHC-I、MHC-11及VLA-4等抗体对其活性基本无影响。研究已证实CIK细胞在受到IL-2和IL-7的刺激后高表达IFA-1及CD28、CD56，进而提高其杀瘤活性。
此外研究发现，CIK细胞的增殖活性、杀瘤能力与诸多因素有关，比如培养方式、细胞纯度、单次剂量、回输时间、途径、次数以及患者的个体差异等，尚需进一步探索和研究。
4.CIK细胞肿瘤杀伤的作用机制
CIK依赖其迁移粘附能力与改造体内免疫环境来实现体内杀瘤能力，其可能的作用机制包括以下几方面：
4.1分泌穿孔素和裂解酶裂解瘤细胞
CIK细胞为MHC非限制性的细胞毒细胞，溶解活性大。Mehta等[10]通过实验证实，CIK细胞在受到外源性抗CD3McAb或者敏感靶细胞刺激时，会向膜外空间释放具有细胞毒活性的胞浆颗粒，内容物主要为BLT酯酶，将直接杀伤靶细胞。另外，CIK细胞的穿孔形成蛋白（RFP）亦能溶解靶细胞，其活化后产生大量炎性细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，可通过直接抑制肿瘤细胞与调节机体免疫系统反应间接杀伤肿瘤细胞的双重机制发挥抗瘤作用。
4.2经Fas/FasL诱导瘤细胞凋亡；
凋亡调节蛋白的表达是机体细胞免疫的重要机制。靶细胞的内源性DNA切酶的激活可杀伤肿瘤细胞，该作用是通过细胞间配受体（Fas/FasL）的相互结合实现的。CIK细胞在培养过程中表达Fas-L，但与既往效应细胞不同，CIK细胞通过杀伤FasL+（即fas-）瘤细胞与抵抗FasL+瘤细胞诱导的细胞凋亡两种作用来实现的，且可长期维持其抗瘤活性[11]。IFN-γ等凋亡相关因子可通过上调肿瘤细胞Fas抗原的表达，促进肿瘤细胞的凋亡。
4.3分泌IFN-γ及IL-12等杀灭瘤细胞；
Marten等[12]发现，活化的CIK细胞可通过分泌IL-2、IFN-γ及IL-12等大量Thl类细胞因子，来调节体内其他细胞因子的分泌，增强其对肿瘤细胞杀伤作用的敏感性；CIK间接杀伤肿瘤的作用是通过上调肿瘤细胞的MHC分子及其刺激分子的表达进一步激活肿瘤特异性CTL、自然杀伤（NK）细胞实现的。
5.CIK细胞在MM患者中的临床应用研究进展
5.1CIK细胞联合树突状细胞（DC）的抗肿瘤机制
DC是激活机体特异性抗肿瘤免疫应答的关键，是功能最强的APC，其可诱导长久有力的抗肿瘤应答效应，是主动免疫及特异性免疫的代表。CIK是目前为止发现的最强的肿瘤杀伤活性免疫细胞，具有非限制性杀瘤能力。此两种治疗模式有机结合了主动与被动免疫，能更强效地杀伤肿瘤细胞，使得肿瘤免疫治疗得到新的突破。目前，以DC-CIK为基础的免疫化疗治疗MM已在临床开展[13]。张嵩等[14]通过观察DC与CIK细胞共同培养后，结果提示该方法可促进彼此的成熟。DC摄取瘤抗原，呈递给CIK，促进CIK活化进而主动杀伤瘤细胞；DC-CIK可一定程度上修复患者的免疫缺陷；能减轻化疗不良反应，且无异体排斥，临床应用安全性得到保证[15]。 5.2 CIK与化疗的联合治疗现，化疗与免疫治疗具有协同作用，前者可通过调节患者的免疫功能而增强抗肿瘤应答效应，其主要机制包含下述几方面：①化疗可导致瘤细胞的裂解，后者释放出大量胞内抗原，免疫原性得到提高[16]；②化疗可致更多T细胞分化成为记忆细胞，促进免疫记忆的建立，从而提高抗原特异性效应细胞的比例；③化疗可导致Treg大幅度下降，从而能解除其对效应细胞的抑制[17]；④化疗可减少淋巴细胞数量，使残留的T细胞能在重建的细胞因子网络中自稳性增生，有利于CIK细胞迅速活化并增殖。⑤化疗可通过降低肿瘤负荷来使肿瘤局部的免疫抑制性微环境发生改变，免疫杀伤效靶比得到提高；⑥某些化疗药物可促使瘤细胞高表达Fas，通过Fas/FasL诱导瘤细胞凋亡； ⑦CIK对耐药MM细胞高表达的P-gp极其敏感，可有效杀伤肿瘤细胞。综上所述，化疗虽然副作用大，但它为MM患者提供了非常有利于目前，大量研究发过继免疫细胞治疗的免疫环境[18]。
近来，四川省卫生厅科研基金项目（09013）研究，钟国成[19]等人对DC-CIK过继免疫联合化疗治疗多发性骨髓瘤的疗效分析中发现，免疫化疗组治疗后的免疫指标、生活质量及临床疗效均较化疗组明显提高，说明DC-CIK免疫治疗与化疗联合应用时有良好的协同作用。DC-CIK过继免疫联合化疗的治疗方案为多发性骨髓瘤患者提供了新的治疗模式[20]，有待进一步研究其具体的分子治疗机制。
5.3 CIK与沙利度胺的联合治疗
多发性骨髓瘤细胞（MC）的生长与新生血管的形成及机体免疫环境的改变有关。孙薏[21]等人在DC-CIK过继免疫联合沙利度胺治疗复发难治性多发性骨髓瘤的回顾性研究中发现，Thd可增强CIK细胞的免疫表型，且明显提高了DC-CIK对U266的杀伤率，免疫组患者的生活质量较对照组患者明显改善，认为该疗法有良好的临床疗效和应用价值。二者的联合治疗方案能提高疗效，却不增加毒副作用，起到优势互补及效果叠加的协同作用。
5.4 CIK在复发难治性MM中的应用
对于不能耐受化療的复发难治性多发性骨髓瘤患者，该疗法可以在一定程度上减轻症状，并能提高患者机体免疫力，减轻痛苦，使患者长期带瘤生存，故不失为一种理想的姑息治疗方法[22]。孙薏、张聪[23]等人在自体树突细胞联合细胞因子诱导杀伤细胞过继治疗复发难治性多发性骨髓瘤26例临床观察中发现，治疗后患者的生活质量（QOL）及肾功能、骨髓瘤细胞百分比、β2-MG、24小时尿液轻链含量等与治疗前相比均得到明显改善。
6、目前CIK治疗存在的问题
虽然该治疗有着广阔的应用前景，但还存在很多亟待解决的问题，主要包括：①患者体内外环境的不同，回输的CIK细胞在体内很难长时间维持其在体外的杀伤活性；②能否通过同步注射IL～2等细胞因子而进一步提高其疗效，需要进一步论证；③与其他方法（尤其是化疗）的有机整合需要进一步完善；建立CIK过继免疫治疗的统一方案。④医疗费用问题，目前单疗程的CIK治疗费用在3万人民币左右，大多不在报销范围，经济问题或许成为该治疗的瓶颈，限制了其在临床的应用。⑤质量安全问题，对于生物治疗而言，质量安全直接决定着治疗效果。若质控把关不严将会导致安全隐患。免疫细胞治疗技术作为三类医疗技术需要申报审核，但目前国家尚未出台相关的临床应用评价标准。故尤其需要注意严格掌握该治疗的适应症，相关操作必须在国家技术监督部门批准并验收的的GMP环境中进行，治疗前与患者及其（或）家属详细充分沟通，并签署治疗知情同意书。
7、结语
CIK细胞的高效杀瘤作用在实验室得到证实后，已在临床上逐步开展应用，其具有独特抗瘤优势与免疫支持作用，且临床应用较安全，并通过有机结合其他的治疗手段，如化疗、沙利度胺等，为MM患者提供了新的治疗策略，并取得了较好的临床治疗效果。但在具体方案实施及CIK细胞的最佳培养方式、单次剂量以及回输途径等方面需要进一步探索。相信随着对MM分子生物学机制的进一步阐明，关键技术的逐步完善，CIK很可能成为未来MM根治的重要手段[24]。
参考文献：
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