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【摘要】 目的:探讨人脑胶质瘤组织中MARVELD1 的表达。方法:RT-PCR和Western blot技术检测33例脑胶质瘤组织蛋白和mRNA的表达,并以11例正常脑组织为对照。结果:相较于正常脑组织,Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级脑胶质瘤组织中MARVELD1蛋白和mRNA的表达水平差异均有统计学意义(P<0.05),Ⅲ级、Ⅳ级脑胶质瘤组织中MARVELD1蛋白和mRNA的表达水平低于Ⅰ~Ⅱ级脑胶质瘤组织和正常脑组织(P<0.05)。结论:MARVELD1对脑胶质瘤恶性程度判断有一定的指导意义,并为脑胶质瘤临床治疗提供了新的靶标。
【关键词】 脑胶质瘤; MARVELD1; 实验研究
【Abstract】 Objective:To explore the relationship the expression of autophagy-related gene MARVELD1 in human glioma tissue. Method: Western blot and RT-PCR technology were used to detect the expressions of MARVELD1 protein and mRNA in 33 cases of glioma tissue and 11 cases of normal brain tissue. Result:There were significant differences in the expressions of MARVELD1 protein and mRNA among normal brain tissue grade Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ glioma tissue(P<0.05). The expressions of MARVELD1 protein and mRNA in grade Ⅲ and grade Ⅳ glioma tissue were lower than those in grade Ⅰ, grade Ⅱ glioma tissue and normal brain tissue(P<0.05). The expression of MARVELD1 protein in grade Ⅰ and grade Ⅱ glioma tissue was lower than that in normal brain tissue(P<0.05).Conclusion: MARVELD1 of glioma malignancy judge has a certain significance, and provides a new target for the clinical treatment of glioma.
【Key words】 Glioma; MARVELD1; Experimental research
First-author’s address:Shenzhen Guangming New District Central Hospital,Shenzhen 518107,China
doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2015.09.012
脑胶质细胞瘤是来源于神经上皮的颅内最常见的原发性肿瘤,占颅内肿瘤的40%~50%,胶质细胞瘤患者的治疗主要以积极的手术、放、化疗等治疗措施为主,但该肿瘤多呈浸润性生长,手术不易全切[1-2]。患者预后仍较差,WHO分级Ⅲ级的胶质细胞瘤患者平均生存期约3~5年,多形性胶质母细胞瘤患者平均生存期尚不足1年[3-4],因此寻找新的脑胶质瘤治疗靶点成为当前亟待解决的难题。MARVELD1基因是定位于人类10号染色体长臂10q24.2的一个新的候选抑癌基因,该基因在多种正常组织中表达,而在乳腺癌、肺癌、肾癌等多种癌症中 MARVELD1基因的表达呈明显下调[5-6]。因此本研究通过对不同病理级别脑胶质瘤组织中MARVELD1的表达,以期从MARVELD1在其发病机制中的调控作用,为脑胶质瘤的靶向治疗提供新思路。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2013年1月-2014年4月入住本院神经外科的符合脑胶质瘤的患者33例。患者均为初发,术前未接受放、化疗等治疗,其中男18例,女15例,年龄7~70岁,平均(40.2±19.3)岁;星形胶质细胞瘤20例,少突胶质细胞瘤3例,室管膜细胞瘤5例,髓母细胞瘤3例,多形性胶质母细胞瘤1例,胶质肉瘤1例;按照2007年WHO神经肿瘤分类标准进行病理分级,其中I~II级15例,III级10例,IV级8例。另取11例来自同期收治的脑外伤或脑出血患者的正常脑组织标本作为对照,患者男6例,女5例,年龄16~47岁,平均(32.3±12.3)岁。两组患者在性别、年龄方面比较差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2 主要仪器与试剂 荧光定量PCR仪及分析软MXPro 4.01(Stratagene公司);凝胶成像系统(柯达公司)。一抗兔抗人MARVELD1单克隆抗体(Abcam);兔抗羊免疫荧光IgG二抗(美国Santa Cruz公司),TRIzol试剂盒(Gibco 公司),RT-PCR引物由Takara生物技术有限公司合成,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒为公司产品。
1.3 检测方法
1.3.1 标本采集 符合纳入标准的脑胶质瘤的患者与11例健康正常者均收集手术切除的新鲜脑胶质瘤标本,标本均经病理确诊,离体后0.5 h内转至-80 ℃低温冰箱冻存。手术切除后标本分成两部分,一部分用于MARVELD1 mRNA的检测,另一部分用于MARVELD1蛋白的检测。
1.3.2 RT-PCR检测脑组织 MARVELD1 mRNA表达 采用TRIzol 法抽提总RNA,将 RNA反转录成cDNA。取1 μL作为模板进行 RT-PCR反应。MARVELD1引物序列,上游:5'-GAGGAAGTAGATTGCTGCCTCTAG-3';下游:5'-GAGAGCGGTCGGTGTGACCAGCTCTG-3'。β-actin引物序列,上游:ATGGG TCAGA AGGATTCCT ATGTG;下游:CTTCATGAGGTAG TCAGT CA GGTC。RT-PCR反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃延伸 1 min(30 cycle);72 ℃终延伸 10 min。 1.3.3 Western Blot检测PBMC中MARVELD1蛋白的表达水平 取适当脑组织加入液氮快速研磨后,加入相应体积的裂解液,放置冰上充分作用30 min后;收集裂解物入,4 ℃离心30 min,-80 ℃冻存。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测MARVELD1 蛋白的变化,进行SDS-PAGE凝胶电泳,转膜与封闭,一抗及二抗孵育。在凝胶成像仪上扫描条带,以其和内参β-actin灰度值的比值来反映其相对含量。
1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析,计量资料以(x±s)表示,比较采用t检验,计数资料采用 字2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 脑胶质瘤组织与健康正常脑组织mRNA的提取 琼脂糖凝胶电泳结果显示,脑胶质瘤脑组织Ⅰ~Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级与健康正常脑组织总RNA均可见清晰的18S和28S条带,说明总RNA纯度基本达到实验要求,且样品保存质量较好无明显降解;对提取的mRNA用紫外分光光度计测量A260/A280值为1.8~2.0,说明mRNA总量及质量满足实时定量荧光RT-PCR的要求。
2.2 脑胶质瘤脑组织与健康正常脑组织标本中MARVELD1mRNA水平的表达差异 为验证MARVELD1在脑胶质瘤组织中的表达情况,用RT-PCR检测MARVELD1 mRNA的表达,如图1、表1所示,相较于正常组织,MARVELD1 mRNA在脑胶质瘤Ⅰ~Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级组织中相对表达降低,且Ⅲ级和Ⅳ级组织低于Ⅰ~Ⅱ级,差异均有统计学意义(P<0.05),表示MARVELD1 mRNA在脑胶质瘤组织中特异表达显著下调。本实验均以β-actin为内参,应用商品化的引物,得到的溶解曲线为单峰,结果符合要求。
2.3 脑胶质瘤脑组织与健康正常脑组织标本中MARVELD1蛋白水平的表达差异 提取正常组织和脑胶质瘤Ⅰ~Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级组织的蛋白,用western bloting检测MARVELD1蛋白的表达,如图2、表2所示,MARVELD1在脑胶质瘤Ⅰ~Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级组织中相对表达降低,且Ⅲ级和Ⅳ级组织低于Ⅰ~Ⅱ级,差异均有统计学意义(P<0.05),表示MARVELD1 蛋白在脑胶质瘤组织中特异表达显著下调。
3 讨论
MARVELD1 是癌症发生及转移的分子机制过程中发现的一个新的候选抑癌基因,其含有一个较为保守的膜相关结构域MARVEL (MAL and related proteins for vesicle trafficking and membrane link,具有囊泡运输和膜连接功能的MAL及相关蛋白),MARVEL结构域的蛋白参与了clathrin调节的细胞内吞作用、细胞凋亡、突触囊泡的融合、细胞的趋化活力、成肌细胞的融合和紧密连接等相关进程[7-8]。MARVELD1 mRNA全长 3238bp,含有两个外显子,编码区位于第一外显子内,其编码蛋白含有173个氨基酸,预测分子量约为18.9 kDa[9]。MARVELD1 蛋白定位于细胞核和线粒体中,而在细胞质中的含量很少[10]。
MARVELD1作为一个新的候选抑癌基因,在多种正常组织中表达,而且与癌旁对照相比,P. M. Alves等通过大规模基因表达谱分析发现MARVELD1 在结肠癌中处于高表达状态[11-12]。通过ONCOMINE网站的基因表达谱数据检索发现MARVELD1 在男性生殖细胞肿瘤中的表达明显高于正常的睾丸组织;在多形性胶质母细胞瘤、少突胶质细胞瘤以及星形细胞瘤中的表达则明显低于正常脑组织;在前列腺腺癌中的表达也低于正常前列腺组织[13-14]。采用肿瘤表达芯片对19种不同类型的原发肿瘤样本,系统分析了MARVELD1 基因在多种人类原发癌中的表达情况,发现在154对病例中有69对(45%)MARVELD1基因在肿瘤组织中出现了表达下调,特别是肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌,以及卵巢癌、子宫癌、女性外阴癌、宫颈癌和睾丸癌等生殖系统肿瘤中MARVELD1基因的表达受到明显的抑制[15-16]。
本研究发现,脑胶质瘤组织中MARVELD1蛋白和mRNA表达水平均低于正常脑组织,并且随胶质瘤细胞分化程度的降低( 病理级别的升高)而逐渐下降,表明MARVELD1基因表达下调可能是脑细胞发生恶性转化的原因之一,提示MARVELD1可作为脑胶质瘤恶性程度判断的辅助指标用于临床。
综上所述,通过检测脑胶质瘤组织中MARVELD1的表达,可能对脑胶质瘤恶性程度及预后的判断有一定的指导意义,并为脑胶质瘤临床治疗提供了新的靶标。
参考文献
[1]何景扬,林瑞蔼.恶性胶质瘤手术后放疗的临床疗效及预后影响因素[J].中外医学研究,2012,10(21):26-27.
[2]李荔荣,赵建伟,胡昌辰,等.福莫司汀化疗联合立体定向放射治疗脑胶质瘤的临床疗效观察[J].中外医学研究,2013,11(23):19.
[3]肖淳文,蒋林,曾连,等.CEACAM1在胶质瘤中的表达与血管生成关系的研究[J].中国医学创新,2011,8(3):3-5.
[4]倪恒,窦长武.生存素Survivin与脑胶质瘤的研究进展[J].中外医学研究,2014,12(14):150-153.
[5] Wang S, Li Y, Han F, et al. Identification and characterization of MARVELD1, a novel nuclear protein that is down-regulated in multiple cancers and silenced by DNA methylation[J]. Cancer Letters, 2009, 282(1): 77-86. [6] Riazuddin S, Ahmed Z M, Fanning A S, et al. Tricellulin is a tight-junction protein necessary for hearing[J]. Genet, 2006, 79(5):1040-1051.
[7] Clement Q J, Shareen M L, Bobby L W. Gene expression profiling of human epidermal keratinocytes in simulated microgravity and recovery cultures[J].Geno Prot Bioinfo, 2008, 6(9): 8-28.
[8] Hirst M, Marra M A. Epigenetics and human disease[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2009, 41(1): 136-146.
[9] Quon H, Abdulkarim B. Adjuvant treatment of anaplastic oligodendrogliomas and oligoastrocytomas[J]. Cochrane Database Syst Rev, 2008,28(2):CD007104.
[10] Wenwei Hu,Zhaohui Feng, Ippolito Modica, et al. Gene amplifications in well-differentiated pancreatic neuroendocrine tumors inactivate the p53 pathway[J]. Genes Cancer, 2010, 1(4):360-368.
[11]高志安,张世羽,杨光华.肿瘤抑制基因p16研究进展[J].中国现代医学杂志,2003,30(1):70-72.
[12]马庆防,杨梅,陈剑,等.人脑胶质瘤中MMP-9、CD133蛋白的表达及临床意义[J].中国医学创新,2012,9(3):8-10.
[13] Hatada I, Fukasawa M, Kimura M. Genome-wide profiling of promoter methylation in human[J]. Oncogene, 2006, 25(9): 3059-3064.
[14]郭新,种衍军,陈剑.人脑胶质瘤中细胞周期蛋白D1和血管内皮生长因子的表达和意义[J].中国医学创新,2010,7(9):3-5.
[15] Alves P M, Lévy N, Stevenson B J, et al. Identification of tumor-associated antigens by large scale analysis of genes expressed in human colorectal cancer[J]. Cancer Immun,2008,8(5):11.
[16]王山.候选肿瘤抑制基因MARVELD1的表达及功能研究[D].哈尔滨:哈尔滨工业大学,2013.
(收稿日期:2014-08-07) (本文编辑:蔡元元)
【关键词】 脑胶质瘤; MARVELD1; 实验研究
【Abstract】 Objective:To explore the relationship the expression of autophagy-related gene MARVELD1 in human glioma tissue. Method: Western blot and RT-PCR technology were used to detect the expressions of MARVELD1 protein and mRNA in 33 cases of glioma tissue and 11 cases of normal brain tissue. Result:There were significant differences in the expressions of MARVELD1 protein and mRNA among normal brain tissue grade Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ glioma tissue(P<0.05). The expressions of MARVELD1 protein and mRNA in grade Ⅲ and grade Ⅳ glioma tissue were lower than those in grade Ⅰ, grade Ⅱ glioma tissue and normal brain tissue(P<0.05). The expression of MARVELD1 protein in grade Ⅰ and grade Ⅱ glioma tissue was lower than that in normal brain tissue(P<0.05).Conclusion: MARVELD1 of glioma malignancy judge has a certain significance, and provides a new target for the clinical treatment of glioma.
【Key words】 Glioma; MARVELD1; Experimental research
First-author’s address:Shenzhen Guangming New District Central Hospital,Shenzhen 518107,China
doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2015.09.012
脑胶质细胞瘤是来源于神经上皮的颅内最常见的原发性肿瘤,占颅内肿瘤的40%~50%,胶质细胞瘤患者的治疗主要以积极的手术、放、化疗等治疗措施为主,但该肿瘤多呈浸润性生长,手术不易全切[1-2]。患者预后仍较差,WHO分级Ⅲ级的胶质细胞瘤患者平均生存期约3~5年,多形性胶质母细胞瘤患者平均生存期尚不足1年[3-4],因此寻找新的脑胶质瘤治疗靶点成为当前亟待解决的难题。MARVELD1基因是定位于人类10号染色体长臂10q24.2的一个新的候选抑癌基因,该基因在多种正常组织中表达,而在乳腺癌、肺癌、肾癌等多种癌症中 MARVELD1基因的表达呈明显下调[5-6]。因此本研究通过对不同病理级别脑胶质瘤组织中MARVELD1的表达,以期从MARVELD1在其发病机制中的调控作用,为脑胶质瘤的靶向治疗提供新思路。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2013年1月-2014年4月入住本院神经外科的符合脑胶质瘤的患者33例。患者均为初发,术前未接受放、化疗等治疗,其中男18例,女15例,年龄7~70岁,平均(40.2±19.3)岁;星形胶质细胞瘤20例,少突胶质细胞瘤3例,室管膜细胞瘤5例,髓母细胞瘤3例,多形性胶质母细胞瘤1例,胶质肉瘤1例;按照2007年WHO神经肿瘤分类标准进行病理分级,其中I~II级15例,III级10例,IV级8例。另取11例来自同期收治的脑外伤或脑出血患者的正常脑组织标本作为对照,患者男6例,女5例,年龄16~47岁,平均(32.3±12.3)岁。两组患者在性别、年龄方面比较差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2 主要仪器与试剂 荧光定量PCR仪及分析软MXPro 4.01(Stratagene公司);凝胶成像系统(柯达公司)。一抗兔抗人MARVELD1单克隆抗体(Abcam);兔抗羊免疫荧光IgG二抗(美国Santa Cruz公司),TRIzol试剂盒(Gibco 公司),RT-PCR引物由Takara生物技术有限公司合成,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒为公司产品。
1.3 检测方法
1.3.1 标本采集 符合纳入标准的脑胶质瘤的患者与11例健康正常者均收集手术切除的新鲜脑胶质瘤标本,标本均经病理确诊,离体后0.5 h内转至-80 ℃低温冰箱冻存。手术切除后标本分成两部分,一部分用于MARVELD1 mRNA的检测,另一部分用于MARVELD1蛋白的检测。
1.3.2 RT-PCR检测脑组织 MARVELD1 mRNA表达 采用TRIzol 法抽提总RNA,将 RNA反转录成cDNA。取1 μL作为模板进行 RT-PCR反应。MARVELD1引物序列,上游:5'-GAGGAAGTAGATTGCTGCCTCTAG-3';下游:5'-GAGAGCGGTCGGTGTGACCAGCTCTG-3'。β-actin引物序列,上游:ATGGG TCAGA AGGATTCCT ATGTG;下游:CTTCATGAGGTAG TCAGT CA GGTC。RT-PCR反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃延伸 1 min(30 cycle);72 ℃终延伸 10 min。 1.3.3 Western Blot检测PBMC中MARVELD1蛋白的表达水平 取适当脑组织加入液氮快速研磨后,加入相应体积的裂解液,放置冰上充分作用30 min后;收集裂解物入,4 ℃离心30 min,-80 ℃冻存。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测MARVELD1 蛋白的变化,进行SDS-PAGE凝胶电泳,转膜与封闭,一抗及二抗孵育。在凝胶成像仪上扫描条带,以其和内参β-actin灰度值的比值来反映其相对含量。
1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析,计量资料以(x±s)表示,比较采用t检验,计数资料采用 字2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 脑胶质瘤组织与健康正常脑组织mRNA的提取 琼脂糖凝胶电泳结果显示,脑胶质瘤脑组织Ⅰ~Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级与健康正常脑组织总RNA均可见清晰的18S和28S条带,说明总RNA纯度基本达到实验要求,且样品保存质量较好无明显降解;对提取的mRNA用紫外分光光度计测量A260/A280值为1.8~2.0,说明mRNA总量及质量满足实时定量荧光RT-PCR的要求。
2.2 脑胶质瘤脑组织与健康正常脑组织标本中MARVELD1mRNA水平的表达差异 为验证MARVELD1在脑胶质瘤组织中的表达情况,用RT-PCR检测MARVELD1 mRNA的表达,如图1、表1所示,相较于正常组织,MARVELD1 mRNA在脑胶质瘤Ⅰ~Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级组织中相对表达降低,且Ⅲ级和Ⅳ级组织低于Ⅰ~Ⅱ级,差异均有统计学意义(P<0.05),表示MARVELD1 mRNA在脑胶质瘤组织中特异表达显著下调。本实验均以β-actin为内参,应用商品化的引物,得到的溶解曲线为单峰,结果符合要求。
2.3 脑胶质瘤脑组织与健康正常脑组织标本中MARVELD1蛋白水平的表达差异 提取正常组织和脑胶质瘤Ⅰ~Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级组织的蛋白,用western bloting检测MARVELD1蛋白的表达,如图2、表2所示,MARVELD1在脑胶质瘤Ⅰ~Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级组织中相对表达降低,且Ⅲ级和Ⅳ级组织低于Ⅰ~Ⅱ级,差异均有统计学意义(P<0.05),表示MARVELD1 蛋白在脑胶质瘤组织中特异表达显著下调。
3 讨论
MARVELD1 是癌症发生及转移的分子机制过程中发现的一个新的候选抑癌基因,其含有一个较为保守的膜相关结构域MARVEL (MAL and related proteins for vesicle trafficking and membrane link,具有囊泡运输和膜连接功能的MAL及相关蛋白),MARVEL结构域的蛋白参与了clathrin调节的细胞内吞作用、细胞凋亡、突触囊泡的融合、细胞的趋化活力、成肌细胞的融合和紧密连接等相关进程[7-8]。MARVELD1 mRNA全长 3238bp,含有两个外显子,编码区位于第一外显子内,其编码蛋白含有173个氨基酸,预测分子量约为18.9 kDa[9]。MARVELD1 蛋白定位于细胞核和线粒体中,而在细胞质中的含量很少[10]。
MARVELD1作为一个新的候选抑癌基因,在多种正常组织中表达,而且与癌旁对照相比,P. M. Alves等通过大规模基因表达谱分析发现MARVELD1 在结肠癌中处于高表达状态[11-12]。通过ONCOMINE网站的基因表达谱数据检索发现MARVELD1 在男性生殖细胞肿瘤中的表达明显高于正常的睾丸组织;在多形性胶质母细胞瘤、少突胶质细胞瘤以及星形细胞瘤中的表达则明显低于正常脑组织;在前列腺腺癌中的表达也低于正常前列腺组织[13-14]。采用肿瘤表达芯片对19种不同类型的原发肿瘤样本,系统分析了MARVELD1 基因在多种人类原发癌中的表达情况,发现在154对病例中有69对(45%)MARVELD1基因在肿瘤组织中出现了表达下调,特别是肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌,以及卵巢癌、子宫癌、女性外阴癌、宫颈癌和睾丸癌等生殖系统肿瘤中MARVELD1基因的表达受到明显的抑制[15-16]。
本研究发现,脑胶质瘤组织中MARVELD1蛋白和mRNA表达水平均低于正常脑组织,并且随胶质瘤细胞分化程度的降低( 病理级别的升高)而逐渐下降,表明MARVELD1基因表达下调可能是脑细胞发生恶性转化的原因之一,提示MARVELD1可作为脑胶质瘤恶性程度判断的辅助指标用于临床。
综上所述,通过检测脑胶质瘤组织中MARVELD1的表达,可能对脑胶质瘤恶性程度及预后的判断有一定的指导意义,并为脑胶质瘤临床治疗提供了新的靶标。
参考文献
[1]何景扬,林瑞蔼.恶性胶质瘤手术后放疗的临床疗效及预后影响因素[J].中外医学研究,2012,10(21):26-27.
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[7] Clement Q J, Shareen M L, Bobby L W. Gene expression profiling of human epidermal keratinocytes in simulated microgravity and recovery cultures[J].Geno Prot Bioinfo, 2008, 6(9): 8-28.
[8] Hirst M, Marra M A. Epigenetics and human disease[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2009, 41(1): 136-146.
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[10] Wenwei Hu,Zhaohui Feng, Ippolito Modica, et al. Gene amplifications in well-differentiated pancreatic neuroendocrine tumors inactivate the p53 pathway[J]. Genes Cancer, 2010, 1(4):360-368.
[11]高志安,张世羽,杨光华.肿瘤抑制基因p16研究进展[J].中国现代医学杂志,2003,30(1):70-72.
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[13] Hatada I, Fukasawa M, Kimura M. Genome-wide profiling of promoter methylation in human[J]. Oncogene, 2006, 25(9): 3059-3064.
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[16]王山.候选肿瘤抑制基因MARVELD1的表达及功能研究[D].哈尔滨:哈尔滨工业大学,2013.
(收稿日期:2014-08-07) (本文编辑:蔡元元)