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摘 要： 2013年，在山东泰安采集到疑似感染黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）的丝瓜样品，利用该病毒外壳蛋白（Coat protein，CP）特异引物CG-CPF/CPR对样品进行扩增并测序。所得序列（GenBank登录号：KJ187042）经NCBI BLAST比对，与已登录的CGMMV序列的相似性均大于92.6%，确定为黄瓜绿斑驳花叶病毒。系统进化分析表明，CGMMV山东丝瓜分离物（CGMMV-SDLoofah）与辽宁分离物（CGMMV-LN）等大多数国内CGMMV分离物同聚为一个进化组，从而进一步确定了CGMMV山东丝瓜病毒分离物为黄瓜绿斑驳花叶病毒。这是首次报道黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染丝瓜。
关键词： 丝瓜；黄瓜绿斑驳花叶病毒；外壳蛋白；分子鉴定
中图分类号： S436.429 文献标识号：A 文章编号： 1001 - 4942（2014）08 - 0010 - 05
Molecular Identification of an Isolate of Cucumber
Green Mottle Mosaic Virus Infecting Loofah in Shandong
Wang Yun1， Xin Zhimei2， Zhao Liming3， Zhu Xiaoping3*， Wang Yunxiang4
（1. Qiaoguan Agricultural Extension Center of Changle County， Changle 262408， China；2. Institute of Plant Protection，
Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China；3. College of Plant Protection， Shandong Agricultural
University， Taian 271018， China； 4.Xing ’ an Street Office of Anqiu City， Anqiu 262100， China）
Abstract An isolate of cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV） was obtained from loofah showing typical symptoms in Taian， Shandong Province， in 2013. The nucleotide sequence of the coat protein （CP） of this isolate （CGMMV-SDLoofah） was amplified and sequenced using specific primer pair CG-CPF/CPR. The sequence analysis showed the sequence of CGMMV-SDLoofah （GenBank accession number： KJ187042） had 92.6% of identity with other isolates of CGMMV in GenBank， so it was confirmed as the CGMMV. The phylogenic analysis results indicated that CGMMV-SDLoofah could be clustered together with Liaoning isolate （CGMMV-LN） and most other CGMMV isolates from China， which further confirmed that the CGMMV-SDLoofah was an isolate of CGMMV. This was the first report of CGMMV infecting loofah in China.
Key words Loofah； Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV）； Coat protein；Molecular identification
黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）为烟草花叶病毒属 （Tobamovirus） 成员，该病毒最早在黄瓜上发现，西瓜、甜瓜、葫芦等瓜类植物都是该病毒的寄主，主要症状为叶片斑驳、系统性花叶。在西瓜上，该病毒常引起果肉烂瓤变质而失去商品价值，是重要的种传葫芦科蔬菜病毒病，常造成产量和品质的严重损失，为我国进境和全国植物检疫性有害生物。
CGMMV在日本、韩国等东亚国家以及西亚的阿拉伯地区、中亚的巴基斯坦等国家发生普遍[1]。在我国，2004年首次从日本进口的南瓜种子中检测截获CGMMV，2005年秦碧霞等在广西的观赏南瓜上发现该病毒[2]，随后在辽宁、北京、山东、甘肃、广东等地也陆续报道了该病毒在田间的为害发生[3～6]。国内已报道的受该病毒侵染的葫芦科蔬菜多为西瓜、黄瓜、西葫芦和南瓜，本研究2013年首次在丝瓜上检测到CGMMV，并对其外壳蛋白基因进行了测序和分子鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 感病样品采集 待测丝瓜样品于2013年采自山东泰安田间，并保存在-80℃冰箱，用于RNA提取等后续试验。
1.1.2 菌株、载体和试剂 克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司；大肠杆菌 （Escherichia coli） DH5α菌株由本试验室保存；RNA提取试剂，购自天根公司；RNase Inhibitor、RTase M-MLV（RNase H-）、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，购自杭州爱思进生物技术有限公司；Easy Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量标准Trans 2K Plus，均购自北京全式金公司；其它生化试剂及普通化学试剂均为进口或国产分析纯。 1.2 方法
1.2.1 感病丝瓜样品总RNA的提取及RT-PCR扩增 称取寄主植物叶片0.1 g，加液氮研磨成粉末，按TRIzol法提取叶片总RNA，用于后续试验cDNA的合成，以未发病的健康丝瓜植株叶片总RNA作为阴性对照。
1.2.2 引物设计与RT-PCR扩增 参照GenBank中HM008919序列设计上游引物（CG-CPF，位于5763-5765）：5′-ATGGCTTACAATCCGATCACACC-3′；下游引物（CG-CPR，位于6224-6248）：5′-CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCCTC-3′，预期扩增产物大小为486 bp。 反转录体系：模板RNA 6.0 μL，下游引物2.0 μL，RNase- Free H2O 5.5 μL，70℃变性10 min，冰上放置2 min，再加入下列试剂：5×M-MLV Buffer 4 μL，dNTP mixture （各10 mmol/L）1.0 μL，RTase M-MLV（RNase H-）（200 U/μL）1.0 μL，RNase Inhibitor（40 U/μL）0.5 μL，总体积为20 μL。42℃保温60 min，再70℃保温15 min。取上述反应产物2 μL做模板进行PCR反应。PCR反应条件：94℃ 3 min，1个循环；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 50 s，25个循环；72℃ 5 min。将PCR扩增产物克隆到pMD18-T 载体上，转化感受态DH5α细菌细胞，选择阳性克隆，委托上海博尚生物科技有限公司完成双向测序。
1.2.3 序列比对分析 利用BLAST对病毒样品外壳蛋白核苷酸的测序结果进行比对，在NCBI上选取已登录的有代表性的CGMMV外壳蛋白序列（表1），通过DNAStar软件中的MegAlign对已知序列进行一致率分析，系统进化树的构建利用Mega 5.0的邻接法进行。
2 结果与分析
2.1 感病丝瓜样品的分子检测
在亚洲，韩国从1995年开始爆发黄瓜绿斑驳花叶病毒病害[11]，而日本早在1971年即在关东地区大面积发生该病害[12]，商品化育苗和种苗贸易是该病毒地区间传播和扩散的主要原因[13～15]。一般认为，国内该病害来自日、韩等疫区引进的种子[5，6，9]，山东设施种植的葫芦科蔬菜均采用工厂化育苗，且绝大多数种苗采用嫁接苗，带毒种子的引进和调运应该是CGMMV在山东及我国其他地区尤其是设施蔬菜种植区 蔓延扩展的主要因素，因此加强种子的检疫和种苗处理才能有效控制CGMMV的蔓延。
参 考 文 献：
[1] Varveri C， Vassilakos N， Bem F. Characterization and detection of cucumber green mottle mosaic virus in Greece [J]. Phytoparasitica， 2002， 30（5）：493-501.
[2] 秦碧霞， 蔡健和， 刘志明， 等. 侵染观赏南瓜的黄瓜绿斑 驳花叶病毒的初步鉴定[J]. 植物检疫， 2005，19（4）：198- 200.
[3] 陈红运， 赵文军， 程毅， 等. 辽中地区西瓜花叶病病原的分子鉴定[J]. 植物病理学报， 2006， 36（4）：306-309.
[4] 李红霞， 白静， 陈红运， 等.南瓜果实中黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-PCR检测及cp基因序列分析[J].植物检疫， 2007，21（5）：268-270.
[5] 田永蕾， 刘冬梅， 张永江， 等. 黄瓜绿斑驳花叶病毒北京和山东分离物的生物学测定及其基因组比较[J]. 植物检疫， 2009，23（6）：1-6.
[6] 张卫东， 权永兵， 廖力，等. 黄瓜绿斑驳花叶病毒广东分离物的分子鉴定[J]. 广东农业科学，2011（20）：73-76.
[7] 秦碧霞， 蔡健和， 刘志明， 等. 侵染葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒广西分离物分子鉴定[J]. 植物保护， 2008， 34（1）： 116-118.
[8] 吴鑫， 丁元明， 何月秋， 等. 黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子检测及云南分离物的序列分析[J]. 扬州大学学报：农业与生命科学版，2010，31（3）： 75-80.
[9] 陈红运， 林石明，陈青，等. 黄瓜绿斑驳花叶病毒辽宁分离物全基因组序列测定[J]. 病毒学报，2009，25（1）： 68-72.
[10] 李晓颖， 江蓓蓓， 王迅， 等. 黄瓜绿斑驳花叶病毒山东南瓜分离物外壳蛋白基因序列分析[J]. 山东农业科学，2010（7）：1-4.
[11] Choi G S. Occurrence of two tobamovirus diseases in cucurbits and control measures in Korea [J]. Plant Pathology Journal， 2001， 17（5）： 243-248.
[12] Komuro Y， Tochihara H ， Fukatsu R， et al . Cucumber green mottle mosaic virus （watermelon strain） in watermelon and its bearing on deterioration of watermelon fruit known as konnyaku disease [J]. Annals Phytopathologica1 Society of Japan， 1971， 37： 34-42.
[13] Lee K W. Occurrence of cucumber green mottle mosaic virus disease of watermelon in Korea [J]. Korean Journal of Plant Pathology， 1990， 6（2）： 250- 255.
[14] Tochihara H， Komuro Y. Infectivity test and serological relationships among various isolates of cucumber green mottle mosaic virus some deduction of the invasion route of the virus into Japan [J]. Annals of the Phytopathological Society of Japan， 1974， 40 （1）： 52-58.
[15] Yoon J Y， Choi G S， Choi S K，et al. Molecular and biological diversities of cucumber green mottle mosaic virus from cucurbitaceous crops in Korea [J]. Phytopathology， 2008， 156：408-412.
关键词： 丝瓜；黄瓜绿斑驳花叶病毒；外壳蛋白；分子鉴定
中图分类号： S436.429 文献标识号：A 文章编号： 1001 - 4942（2014）08 - 0010 - 05
Molecular Identification of an Isolate of Cucumber
Green Mottle Mosaic Virus Infecting Loofah in Shandong
Wang Yun1， Xin Zhimei2， Zhao Liming3， Zhu Xiaoping3*， Wang Yunxiang4
（1. Qiaoguan Agricultural Extension Center of Changle County， Changle 262408， China；2. Institute of Plant Protection，
Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China；3. College of Plant Protection， Shandong Agricultural
University， Taian 271018， China； 4.Xing ’ an Street Office of Anqiu City， Anqiu 262100， China）
Abstract An isolate of cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV） was obtained from loofah showing typical symptoms in Taian， Shandong Province， in 2013. The nucleotide sequence of the coat protein （CP） of this isolate （CGMMV-SDLoofah） was amplified and sequenced using specific primer pair CG-CPF/CPR. The sequence analysis showed the sequence of CGMMV-SDLoofah （GenBank accession number： KJ187042） had 92.6% of identity with other isolates of CGMMV in GenBank， so it was confirmed as the CGMMV. The phylogenic analysis results indicated that CGMMV-SDLoofah could be clustered together with Liaoning isolate （CGMMV-LN） and most other CGMMV isolates from China， which further confirmed that the CGMMV-SDLoofah was an isolate of CGMMV. This was the first report of CGMMV infecting loofah in China.
Key words Loofah； Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV）； Coat protein；Molecular identification
黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）为烟草花叶病毒属 （Tobamovirus） 成员，该病毒最早在黄瓜上发现，西瓜、甜瓜、葫芦等瓜类植物都是该病毒的寄主，主要症状为叶片斑驳、系统性花叶。在西瓜上，该病毒常引起果肉烂瓤变质而失去商品价值，是重要的种传葫芦科蔬菜病毒病，常造成产量和品质的严重损失，为我国进境和全国植物检疫性有害生物。
CGMMV在日本、韩国等东亚国家以及西亚的阿拉伯地区、中亚的巴基斯坦等国家发生普遍[1]。在我国，2004年首次从日本进口的南瓜种子中检测截获CGMMV，2005年秦碧霞等在广西的观赏南瓜上发现该病毒[2]，随后在辽宁、北京、山东、甘肃、广东等地也陆续报道了该病毒在田间的为害发生[3～6]。国内已报道的受该病毒侵染的葫芦科蔬菜多为西瓜、黄瓜、西葫芦和南瓜，本研究2013年首次在丝瓜上检测到CGMMV，并对其外壳蛋白基因进行了测序和分子鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 感病样品采集 待测丝瓜样品于2013年采自山东泰安田间，并保存在-80℃冰箱，用于RNA提取等后续试验。
1.1.2 菌株、载体和试剂 克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司；大肠杆菌 （Escherichia coli） DH5α菌株由本试验室保存；RNA提取试剂，购自天根公司；RNase Inhibitor、RTase M-MLV（RNase H-）、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，购自杭州爱思进生物技术有限公司；Easy Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量标准Trans 2K Plus，均购自北京全式金公司；其它生化试剂及普通化学试剂均为进口或国产分析纯。 1.2 方法
1.2.1 感病丝瓜样品总RNA的提取及RT-PCR扩增 称取寄主植物叶片0.1 g，加液氮研磨成粉末，按TRIzol法提取叶片总RNA，用于后续试验cDNA的合成，以未发病的健康丝瓜植株叶片总RNA作为阴性对照。
1.2.2 引物设计与RT-PCR扩增 参照GenBank中HM008919序列设计上游引物（CG-CPF，位于5763-5765）：5′-ATGGCTTACAATCCGATCACACC-3′；下游引物（CG-CPR，位于6224-6248）：5′-CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCCTC-3′，预期扩增产物大小为486 bp。 反转录体系：模板RNA 6.0 μL，下游引物2.0 μL，RNase- Free H2O 5.5 μL，70℃变性10 min，冰上放置2 min，再加入下列试剂：5×M-MLV Buffer 4 μL，dNTP mixture （各10 mmol/L）1.0 μL，RTase M-MLV（RNase H-）（200 U/μL）1.0 μL，RNase Inhibitor（40 U/μL）0.5 μL，总体积为20 μL。42℃保温60 min，再70℃保温15 min。取上述反应产物2 μL做模板进行PCR反应。PCR反应条件：94℃ 3 min，1个循环；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 50 s，25个循环；72℃ 5 min。将PCR扩增产物克隆到pMD18-T 载体上，转化感受态DH5α细菌细胞，选择阳性克隆，委托上海博尚生物科技有限公司完成双向测序。
1.2.3 序列比对分析 利用BLAST对病毒样品外壳蛋白核苷酸的测序结果进行比对，在NCBI上选取已登录的有代表性的CGMMV外壳蛋白序列（表1），通过DNAStar软件中的MegAlign对已知序列进行一致率分析，系统进化树的构建利用Mega 5.0的邻接法进行。
2 结果与分析
2.1 感病丝瓜样品的分子检测
在亚洲，韩国从1995年开始爆发黄瓜绿斑驳花叶病毒病害[11]，而日本早在1971年即在关东地区大面积发生该病害[12]，商品化育苗和种苗贸易是该病毒地区间传播和扩散的主要原因[13～15]。一般认为，国内该病害来自日、韩等疫区引进的种子[5，6，9]，山东设施种植的葫芦科蔬菜均采用工厂化育苗，且绝大多数种苗采用嫁接苗，带毒种子的引进和调运应该是CGMMV在山东及我国其他地区尤其是设施蔬菜种植区 蔓延扩展的主要因素，因此加强种子的检疫和种苗处理才能有效控制CGMMV的蔓延。
参 考 文 献：
[1] Varveri C， Vassilakos N， Bem F. Characterization and detection of cucumber green mottle mosaic virus in Greece [J]. Phytoparasitica， 2002， 30（5）：493-501.
[2] 秦碧霞， 蔡健和， 刘志明， 等. 侵染观赏南瓜的黄瓜绿斑 驳花叶病毒的初步鉴定[J]. 植物检疫， 2005，19（4）：198- 200.
[3] 陈红运， 赵文军， 程毅， 等. 辽中地区西瓜花叶病病原的分子鉴定[J]. 植物病理学报， 2006， 36（4）：306-309.
[4] 李红霞， 白静， 陈红运， 等.南瓜果实中黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-PCR检测及cp基因序列分析[J].植物检疫， 2007，21（5）：268-270.
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[6] 张卫东， 权永兵， 廖力，等. 黄瓜绿斑驳花叶病毒广东分离物的分子鉴定[J]. 广东农业科学，2011（20）：73-76.
[7] 秦碧霞， 蔡健和， 刘志明， 等. 侵染葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒广西分离物分子鉴定[J]. 植物保护， 2008， 34（1）： 116-118.
[8] 吴鑫， 丁元明， 何月秋， 等. 黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子检测及云南分离物的序列分析[J]. 扬州大学学报：农业与生命科学版，2010，31（3）： 75-80.
[9] 陈红运， 林石明，陈青，等. 黄瓜绿斑驳花叶病毒辽宁分离物全基因组序列测定[J]. 病毒学报，2009，25（1）： 68-72.
[10] 李晓颖， 江蓓蓓， 王迅， 等. 黄瓜绿斑驳花叶病毒山东南瓜分离物外壳蛋白基因序列分析[J]. 山东农业科学，2010（7）：1-4.
[11] Choi G S. Occurrence of two tobamovirus diseases in cucurbits and control measures in Korea [J]. Plant Pathology Journal， 2001， 17（5）： 243-248.
[12] Komuro Y， Tochihara H ， Fukatsu R， et al . Cucumber green mottle mosaic virus （watermelon strain） in watermelon and its bearing on deterioration of watermelon fruit known as konnyaku disease [J]. Annals Phytopathologica1 Society of Japan， 1971， 37： 34-42.
[13] Lee K W. Occurrence of cucumber green mottle mosaic virus disease of watermelon in Korea [J]. Korean Journal of Plant Pathology， 1990， 6（2）： 250- 255.
[14] Tochihara H， Komuro Y. Infectivity test and serological relationships among various isolates of cucumber green mottle mosaic virus some deduction of the invasion route of the virus into Japan [J]. Annals of the Phytopathological Society of Japan， 1974， 40 （1）： 52-58.
[15] Yoon J Y， Choi G S， Choi S K，et al. Molecular and biological diversities of cucumber green mottle mosaic virus from cucurbitaceous crops in Korea [J]. Phytopathology， 2008， 156：408-412.