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摘要：以天津市津南11个芹菜育种材料为研究对象，利用EST—SSR分子标记技术构建津南芹菜分子指纹图谱，并用于遗传多样性分析。从GenBank数据库查询芹菜EST序列1 122条，使用BatchPrimer3在线软件扫描分析获得194个候选EST—SSR位点，并设计141对SSR—PCR引物。选择其中47对引物进行多态性分析，确认8对引物具有多态性。构建基于Excel格式的津南芹菜EST—SSR指纹图谱，包括8对引物在供试材料中扩增到的44条多态性条带信息。遗传多样性分析显示，供试材料间遗传相似系数介于0.409～0.864之间，平均为0.664。本研究建立的津南芹菜EST—SSR指纹图谱稳定有效，可用于芹菜种质资源鉴定和品种真实性检测。
关键词：芹菜；SSR标记；指纹图谱；遗传多样性
中图分类号：S636.3 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006—6500.2012.05.002
Construction of SSR—based Molecular Fingerprinting and Analysis of Genetic Diversity for Celery Varieties from Tianjin
LAN Qing—kuo1，LI Ou—jing1，ZHANG Ji—bo2，ZHAO Xin1，ZHU Zhu1，CHEN Rui1，XU Shi—yong1，WANG Yong1，GUO Yong—ze1
（1.Tianjin Institute of Agriculture Quality Standard and Testing Technology，Tianjin 300381，China；2.Tianjin Hongcheng Celery Research Institute，Tianjin 300350，China）
Abstract： SSR markers were used to construct the fingerprinting and genetic diversity of 11 celery varieties from Jinnan， Tianjin city.A total of 1 122 celery EST were hunted from the Genebank database.114 microsatellites sequences containing 194 EST—SSR were detected from these EST and 147 primer pairs were designed by BatchPrimer3 online software.A subset （47 pairs） was synthesized to test the amplification and polymorphism in 11 celery cultivars.The results showed that 8 primer pairs presented genetic diversity.The Excel—based digital fingerprinting was established.UPGMA cluster analysis was used to estimate the genetic distances and to construct a dendrogram by SLT—NTSYS.The results showed that the coefficient of genetic similarity range was 0.409～0.864，with an average of 0.664.The celery EST—SSR fingerprinting was reliable and convenient，and could be used in germplasm identification.
Key words： celery；SSR marker；molecular fingerprinting；genetic diversity
簡单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR），也称微卫星DNA，是一类由几个（一般为1～5个）核苷酸为重复单位组成的核苷酸串联重复序列。SSR具有多态性丰富、重复性好、共显性、分布广等优点，常用于蔬菜遗传育种[1]、基因定位[2]、遗传图谱构建[3]、种质鉴定等。玉米[4]、小麦[5]、棉花[6]等主要农作物已建立成熟的基于SSR标记的种子鉴定技术及配套的指纹图谱。
芹菜（Apium graveolens L.）属伞形科植物，原产于地中海地区和中东，富含膳食纤维和维生素，具有预防高血压、动脉硬化等药用价值，深受种植者和消费者的喜爱。芹菜为二年生蔬菜，生长期长，且易受到环境和人为因素影响，从形态学上较难区分品种间差异。因此，建立芹菜分子标记指纹图谱十分必要。本研究以天津市津南宏程芹菜研究所的11个育种材料为对象，筛选芹菜EST—SSR位点，构建EST—SSR指纹图谱，为芹菜优良性状早期鉴定、遗传关系分析、种子纯度及真实性鉴定奠定基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
11个芹菜育种材料由津南宏程芹菜研究所提供，分别编号1，2，3，4……11，取叶片用于DNA提取。
1.2 芹菜基因组DNA提取
参照Murray等 [7]方法，做适当改良后用于芹菜嫩叶基因组DNA提取。DNA浓度用NanoDrop—1000 spectrophotometer（Thermol）检测并稀释至50 ng·uL—1，—20 ℃保存备用。 1.3 SSR分析
PCR反应采用10 μL体系：其中2×GoTaq Green Master Mix（Promega）5 μL，上下游引物（10 μmol·L—1）各0.25 μL，DNA模板0.5 μL（50 ng·uL—1），灭菌去离子水补足至10 μL。反应程序为94 ℃预变性5 min；35个循环反应（94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR仪为ABI veriti 96 well Thermol cycler。
聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，电压250 V，电泳1 h；采用银染法进行显色。
1.4 数据分析
凝胶显色后置于凝胶成像系统拍照，使用GeneTools（Sygene）软件对电泳图谱中稳定且易分辨的条带进行分子量分析；聚类分析使用SLT—NTSYS（2.10）软件。
2 结果与分析
2.1 芹菜EST序列信息分析及SSR—PCR引物设计
以celery为关键词查询GenBank数据库公布的芹菜EST序列，用BatchPrimer3（v1.0）[8]在线软件扫描分析芹菜EST序列中候选EST—SSR位点信息，并设计候选EST—SSR位点PCR扩增引物，包括上游引物和下游引物。
从GenBank数据库共查询到1 122条芹菜EST序列，扫描分析获得194个候选SSR位点，分布在114条芹菜EST序列中，平均每3.3 kb EST序列含1个SSR位点。芹菜EST—SSR种类较为丰富，二至六核苷酸重复类型均存在，但出现频率差异较大；三核苷酸重复类型出现频率最高，共82个（42.3%），其次是二核苷酸重复类型69个（35.6%）、四核苷酸重复类型27个（13.9%），五核苷酸10个（5.2%）和六核苷酸重复类型6个（3.1%）。所有重复类型平均SSR长度为15 bp，其中二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸平均SSR长度分别为16，14，12，15，18 bp。
依据候选EST—SSR位点上下游序列信息，共设计141对EST—PCR引物，包括上游引物和下游引物，本研究选用其中47对SSR引物进行后续试验。引物由上海生物工程有限公司合成。
2.2 芹菜EST—SSR多态性检测
用11个芹菜DNA混合液为模板，对47对引物进行PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳。筛选结果发现，47对引物中有22对引物扩增出条带，其中有8对引物扩增出的条带大于1条，分别为Scel—6、Scel—8、Scel—11、Scel—12、Scel—93、Scel—102、Scel—103和Scel—107号引物，说明该8个EST—SSR位点在11个材料中具有多态性，适合供试材料EST—SSR分子指纹图谱的构建。
以11个芹菜DNA为模板，对具有多态性的8对引物进行PCR扩增及聚丙烯凝胶电泳。结果显示，8对引物在11个材料中呈现丰富的多态性。
2.3 芹菜EST—SSR指纹图谱构建
将8对SSR引物扩增电泳图片导入GeneTools（Sygene）软件，定义DNA分子量Marker，对目标条带进行分子量分析；构建基于Excel数据格式的EST—SSR指纹图谱，记录目标条带分子量大小，在有条带处记作×，无条带处不记录。EST—SSR指纹图谱包含了11个芹菜育种材料8个EST—SSR位点信息，共44个條带，平均每对引物 5.05 条。
2.4 芹菜品种遗传多样性分析
将基于Excel数据格式的EST—SSR指纹图谱数据导入SLT—Ntsys（2.10）软件，利用UPGMA 方法进行聚类分析。结果表明，11份芹菜材料相似系数变化范围为0.409～0.864，平均为0.664；在相似系数0.66处可被分为2簇。A簇包括7份芹菜品种，B簇包括4份芹菜品种；在相似系数0.77处A簇和B簇又可被分为2个亚簇。利用该指纹图谱，可将11份材料完全区分。
3 讨论
与国外相比，我国芹菜育种起步较晚，育种方法主要采用国内地方资源的收集和国外品种的引进、驯化等方式，耗时费力，而且市场上同物异名、同名异物现象严重，品种间形态特征差异难以区分。SSR标记具有鉴别力高、开发成本低、操作相对自动化、不受环境影响等优点，被普遍认为是最接近于理想化的品种鉴定技术。本研究以天津市津南芹菜11个育种材料为研究对象，采用EST序列收集、SSR位点扫描、多态性确认的技术路线，构建小规模芹菜EST—SSR指纹图谱。该指纹图谱包括了8个EST—SSR位点，可完全区分11个芹菜育种材料。
目前我国芹菜遗传多样性的研究较少。鞠剑锋[从81对AFLP引物中筛选出8对选择性扩增引物，分析了24份芹菜资源的遗传多样性，材料间遗传相似系数变化范围为0.385～0.987，在遗传相似系数为0.6水平上，聚类分析结果可将供试材料分为3类。王武台等[13]采用ISSR分子标记技术分析了105份芹菜资源的遗传多样性，筛选出5对优选引物经组合可将供试材料分为5大类。本研究从47个EST—SSR引物中筛选出8个具有多态性的引物，在引物筛选效率上明显高于AFLP标记；对试验材料遗传多样性进行分析，相似系数变化范围与鞠剑锋研究结果相比略窄，聚类分析分类结果也小于鞠剑锋和王武台等研究结果，该差异可能是由于样本数量和范围的不同造成的。
随着测序技术和生物信息学技术的发展，通过网络可以免费获得海量的EST等序列信息及具有SSR扫描及引物设计功能的生物软件，为EST—SSR标记的开发提供经济、便利的条件。本研究采用目前成熟的技术路线开发芹菜EST—SSR分子标记并构建小规模的指纹图谱，旨在为芹菜育种材料的分类及品种区分奠定基础，但还存在样本基数小、筛选位点少等问题，需要进一步从全国范围内扩大种质资源的搜集，开展大规模的EST—SSR位点筛选。 参考文献：
[1] 王笑一，于拴仓，张凤兰，等.小白菜品种的SSR指纹图谱及遗传特异性分析[J].华北农学报，2008，23（5）：97—103.
[2] 张海英，王振国，毛爱军，等.与黄瓜白粉病抗病基因紧密连锁的SSR分子标记[J].华北农学报，2008，23（6）：77—80.
[3] 金凤媚，薛俊，夏时云，等.SSR标记技术在番茄遗传育种上的应用[J].天津农业科学，2004，10（4）：13—17.
[4] Gadaleta A，Mangini G，Mulè G，et al.Characterization of dinucleotide and trinucleotide EST—derived microsatellites in the wheat genome[J].Euphytica，2007，153：73—85.
[5] 王凤格，赵久然，郭景伦，等.中国玉米新品种标准DNA指纹库构建研究的几点思考[J].植物学通报，2005，22（1）：121—128.
[6] 韩宗福，王景会，申贵芳，等.黄河流域棉花主要品种SSR指纹图谱构建及遗传差异分析棉花学报[J].棉花学报，2011，23（6）：545—551.
[7] Murray M，Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic Acid Res，1980，8：4321—4325.
[8] Frank M Y，Naxin H，Yong Q G，et al.Batch Primer3：A high throughput web application for PCR and sequencing primer designing[J].BMC Bioinformatics，2008（9）：253.
[9] 张飞，王炜勇，张智，等.光萼荷属植物SSR反应体系确立与指纹图谱构建[J].植物研究，2012，32（1）：115—119.
[10] Heckenberger M，Vander V J R，Melchinger A E，et al.Variation of DNA fingerprints among accessions within maize inbred lines and implications for identification of essentially derived varieties：II.Genetic and technical sources of variation in AFLP data and comparison with SSR data[J].Molecular Breeding，2003，12：97—106.
[11] 陆光远，伍晓明，张冬晓，等.SSR标记分析国家油菜区试品种的特异性和一致性[J].中国农业科学，2008，41（1）：32—42.
[12] 鞠剑峰.芹菜 AFLP 遗传多样性分析[J].中国农学通报，2007，23（7）：120—123.
[13] 王武臺，古瑜，韩启厚，等.芹菜种质资源亲缘关系的ISSR分析[J].中国蔬菜，2011（8）：22—27.
关键词：芹菜；SSR标记；指纹图谱；遗传多样性
中图分类号：S636.3 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006—6500.2012.05.002
Construction of SSR—based Molecular Fingerprinting and Analysis of Genetic Diversity for Celery Varieties from Tianjin
LAN Qing—kuo1，LI Ou—jing1，ZHANG Ji—bo2，ZHAO Xin1，ZHU Zhu1，CHEN Rui1，XU Shi—yong1，WANG Yong1，GUO Yong—ze1
（1.Tianjin Institute of Agriculture Quality Standard and Testing Technology，Tianjin 300381，China；2.Tianjin Hongcheng Celery Research Institute，Tianjin 300350，China）
Abstract： SSR markers were used to construct the fingerprinting and genetic diversity of 11 celery varieties from Jinnan， Tianjin city.A total of 1 122 celery EST were hunted from the Genebank database.114 microsatellites sequences containing 194 EST—SSR were detected from these EST and 147 primer pairs were designed by BatchPrimer3 online software.A subset （47 pairs） was synthesized to test the amplification and polymorphism in 11 celery cultivars.The results showed that 8 primer pairs presented genetic diversity.The Excel—based digital fingerprinting was established.UPGMA cluster analysis was used to estimate the genetic distances and to construct a dendrogram by SLT—NTSYS.The results showed that the coefficient of genetic similarity range was 0.409～0.864，with an average of 0.664.The celery EST—SSR fingerprinting was reliable and convenient，and could be used in germplasm identification.
Key words： celery；SSR marker；molecular fingerprinting；genetic diversity
簡单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR），也称微卫星DNA，是一类由几个（一般为1～5个）核苷酸为重复单位组成的核苷酸串联重复序列。SSR具有多态性丰富、重复性好、共显性、分布广等优点，常用于蔬菜遗传育种[1]、基因定位[2]、遗传图谱构建[3]、种质鉴定等。玉米[4]、小麦[5]、棉花[6]等主要农作物已建立成熟的基于SSR标记的种子鉴定技术及配套的指纹图谱。
芹菜（Apium graveolens L.）属伞形科植物，原产于地中海地区和中东，富含膳食纤维和维生素，具有预防高血压、动脉硬化等药用价值，深受种植者和消费者的喜爱。芹菜为二年生蔬菜，生长期长，且易受到环境和人为因素影响，从形态学上较难区分品种间差异。因此，建立芹菜分子标记指纹图谱十分必要。本研究以天津市津南宏程芹菜研究所的11个育种材料为对象，筛选芹菜EST—SSR位点，构建EST—SSR指纹图谱，为芹菜优良性状早期鉴定、遗传关系分析、种子纯度及真实性鉴定奠定基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
11个芹菜育种材料由津南宏程芹菜研究所提供，分别编号1，2，3，4……11，取叶片用于DNA提取。
1.2 芹菜基因组DNA提取
参照Murray等 [7]方法，做适当改良后用于芹菜嫩叶基因组DNA提取。DNA浓度用NanoDrop—1000 spectrophotometer（Thermol）检测并稀释至50 ng·uL—1，—20 ℃保存备用。 1.3 SSR分析
PCR反应采用10 μL体系：其中2×GoTaq Green Master Mix（Promega）5 μL，上下游引物（10 μmol·L—1）各0.25 μL，DNA模板0.5 μL（50 ng·uL—1），灭菌去离子水补足至10 μL。反应程序为94 ℃预变性5 min；35个循环反应（94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR仪为ABI veriti 96 well Thermol cycler。
聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，电压250 V，电泳1 h；采用银染法进行显色。
1.4 数据分析
凝胶显色后置于凝胶成像系统拍照，使用GeneTools（Sygene）软件对电泳图谱中稳定且易分辨的条带进行分子量分析；聚类分析使用SLT—NTSYS（2.10）软件。
2 结果与分析
2.1 芹菜EST序列信息分析及SSR—PCR引物设计
以celery为关键词查询GenBank数据库公布的芹菜EST序列，用BatchPrimer3（v1.0）[8]在线软件扫描分析芹菜EST序列中候选EST—SSR位点信息，并设计候选EST—SSR位点PCR扩增引物，包括上游引物和下游引物。
从GenBank数据库共查询到1 122条芹菜EST序列，扫描分析获得194个候选SSR位点，分布在114条芹菜EST序列中，平均每3.3 kb EST序列含1个SSR位点。芹菜EST—SSR种类较为丰富，二至六核苷酸重复类型均存在，但出现频率差异较大；三核苷酸重复类型出现频率最高，共82个（42.3%），其次是二核苷酸重复类型69个（35.6%）、四核苷酸重复类型27个（13.9%），五核苷酸10个（5.2%）和六核苷酸重复类型6个（3.1%）。所有重复类型平均SSR长度为15 bp，其中二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸平均SSR长度分别为16，14，12，15，18 bp。
依据候选EST—SSR位点上下游序列信息，共设计141对EST—PCR引物，包括上游引物和下游引物，本研究选用其中47对SSR引物进行后续试验。引物由上海生物工程有限公司合成。
2.2 芹菜EST—SSR多态性检测
用11个芹菜DNA混合液为模板，对47对引物进行PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳。筛选结果发现，47对引物中有22对引物扩增出条带，其中有8对引物扩增出的条带大于1条，分别为Scel—6、Scel—8、Scel—11、Scel—12、Scel—93、Scel—102、Scel—103和Scel—107号引物，说明该8个EST—SSR位点在11个材料中具有多态性，适合供试材料EST—SSR分子指纹图谱的构建。
以11个芹菜DNA为模板，对具有多态性的8对引物进行PCR扩增及聚丙烯凝胶电泳。结果显示，8对引物在11个材料中呈现丰富的多态性。
2.3 芹菜EST—SSR指纹图谱构建
将8对SSR引物扩增电泳图片导入GeneTools（Sygene）软件，定义DNA分子量Marker，对目标条带进行分子量分析；构建基于Excel数据格式的EST—SSR指纹图谱，记录目标条带分子量大小，在有条带处记作×，无条带处不记录。EST—SSR指纹图谱包含了11个芹菜育种材料8个EST—SSR位点信息，共44个條带，平均每对引物 5.05 条。
2.4 芹菜品种遗传多样性分析
将基于Excel数据格式的EST—SSR指纹图谱数据导入SLT—Ntsys（2.10）软件，利用UPGMA 方法进行聚类分析。结果表明，11份芹菜材料相似系数变化范围为0.409～0.864，平均为0.664；在相似系数0.66处可被分为2簇。A簇包括7份芹菜品种，B簇包括4份芹菜品种；在相似系数0.77处A簇和B簇又可被分为2个亚簇。利用该指纹图谱，可将11份材料完全区分。
3 讨论
与国外相比，我国芹菜育种起步较晚，育种方法主要采用国内地方资源的收集和国外品种的引进、驯化等方式，耗时费力，而且市场上同物异名、同名异物现象严重，品种间形态特征差异难以区分。SSR标记具有鉴别力高、开发成本低、操作相对自动化、不受环境影响等优点，被普遍认为是最接近于理想化的品种鉴定技术。本研究以天津市津南芹菜11个育种材料为研究对象，采用EST序列收集、SSR位点扫描、多态性确认的技术路线，构建小规模芹菜EST—SSR指纹图谱。该指纹图谱包括了8个EST—SSR位点，可完全区分11个芹菜育种材料。
目前我国芹菜遗传多样性的研究较少。鞠剑锋[从81对AFLP引物中筛选出8对选择性扩增引物，分析了24份芹菜资源的遗传多样性，材料间遗传相似系数变化范围为0.385～0.987，在遗传相似系数为0.6水平上，聚类分析结果可将供试材料分为3类。王武台等[13]采用ISSR分子标记技术分析了105份芹菜资源的遗传多样性，筛选出5对优选引物经组合可将供试材料分为5大类。本研究从47个EST—SSR引物中筛选出8个具有多态性的引物，在引物筛选效率上明显高于AFLP标记；对试验材料遗传多样性进行分析，相似系数变化范围与鞠剑锋研究结果相比略窄，聚类分析分类结果也小于鞠剑锋和王武台等研究结果，该差异可能是由于样本数量和范围的不同造成的。
随着测序技术和生物信息学技术的发展，通过网络可以免费获得海量的EST等序列信息及具有SSR扫描及引物设计功能的生物软件，为EST—SSR标记的开发提供经济、便利的条件。本研究采用目前成熟的技术路线开发芹菜EST—SSR分子标记并构建小规模的指纹图谱，旨在为芹菜育种材料的分类及品种区分奠定基础，但还存在样本基数小、筛选位点少等问题，需要进一步从全国范围内扩大种质资源的搜集，开展大规模的EST—SSR位点筛选。 参考文献：
[1] 王笑一，于拴仓，张凤兰，等.小白菜品种的SSR指纹图谱及遗传特异性分析[J].华北农学报，2008，23（5）：97—103.
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[4] Gadaleta A，Mangini G，Mulè G，et al.Characterization of dinucleotide and trinucleotide EST—derived microsatellites in the wheat genome[J].Euphytica，2007，153：73—85.
[5] 王凤格，赵久然，郭景伦，等.中国玉米新品种标准DNA指纹库构建研究的几点思考[J].植物学通报，2005，22（1）：121—128.
[6] 韩宗福，王景会，申贵芳，等.黄河流域棉花主要品种SSR指纹图谱构建及遗传差异分析棉花学报[J].棉花学报，2011，23（6）：545—551.
[7] Murray M，Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic Acid Res，1980，8：4321—4325.
[8] Frank M Y，Naxin H，Yong Q G，et al.Batch Primer3：A high throughput web application for PCR and sequencing primer designing[J].BMC Bioinformatics，2008（9）：253.
[9] 张飞，王炜勇，张智，等.光萼荷属植物SSR反应体系确立与指纹图谱构建[J].植物研究，2012，32（1）：115—119.
[10] Heckenberger M，Vander V J R，Melchinger A E，et al.Variation of DNA fingerprints among accessions within maize inbred lines and implications for identification of essentially derived varieties：II.Genetic and technical sources of variation in AFLP data and comparison with SSR data[J].Molecular Breeding，2003，12：97—106.
[11] 陆光远，伍晓明，张冬晓，等.SSR标记分析国家油菜区试品种的特异性和一致性[J].中国农业科学，2008，41（1）：32—42.
[12] 鞠剑峰.芹菜 AFLP 遗传多样性分析[J].中国农学通报，2007，23（7）：120—123.
[13] 王武臺，古瑜，韩启厚，等.芹菜种质资源亲缘关系的ISSR分析[J].中国蔬菜，2011（8）：22—27.