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【摘 要】 目的：探讨冬虫夏草对Vitamin D Receptor（VDR） 沉默大鼠卵巢颗粒细胞中CYP19mRNA表达的影响。方法：将大鼠卵巢颗粒细胞随机分为6个组：1为空白对照组，2为基因沉默阴性对照组，3为VDR沉默组，4为VDR沉默+已烯雌酚组，5为VDR沉默+维生素D组，6为VDR沉默+虫草含药血清处理组。采用荧光定量PCR检测法检测各组大鼠卵巢颗粒细胞中CYP19mRNA表达。结果：与对照组、基因沉默阴性对照组相比，VDR沉默组CYP19mRNA表达明显下调（P<0.05），VDR沉默+己烯雌酚组、VDR沉默+VD组、VDR沉默+冬虫夏草含药血清组与VDR沉默组比较，CYP19mRNA表达明显上调（P<0.05）。结论：冬虫夏草可以通过调节CYP19产生类维生素D样作用，对大鼠的卵巢颗粒细胞分泌功能产生影响，同时通过调节维生素D轴对大鼠的卵巢产生保护作用。
【关键词】 卵巢颗粒细胞；冬虫夏草；CYP19；VDR沉默；维生素D
【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）09-0021-03
卵巢作为女性的生殖腺，在中枢神经系统-下丘脑-垂体轴的调控之下，完成排卵和内分泌的功能[1]。女性进入围绝经期以后，卵泡数量逐渐减少，引起骨质疏松、抑郁、心血管疾病等，严重影响妇女的身心健康和生活质量[2]。目前西医治疗主要采用激素替代疗法，长期应用不良反应较为突出。中医药补肾益精疗法有其独特优势，其机制有待进一步阐明。近年对Vitamin D Receptor（VDR） 和1a-羟化酶基因沉默动物不断深入研究发现，维生素D对生殖功能的影响发挥作用。VDRmRNA表达已被证实是在卵巢[3]，在混合卵巢细胞及净化的卵巢颗粒细胞培养物中对性激素类固醇生成起重要作用[3]。芳香化酶在雌激素合成过程中具有重要作用，无论雄性或雌性小鼠，VDR敲除后性腺芳香化酶（P450arom）活性低下，CYP19表达明显降低。
维生素D能直接调节CYP19基因表达，从而调控雌激素分泌[4]。维生素D通过25-羟基维生素D 1-羟化酶（CYP27B1）在肝脏和肾脏中的活性形式（1，25-二羟维生素D）进行修饰，激活的维生素D通过维生素D受体（VDR）产生作用，这个系统在国外称作维生素D轴[5]（ Vitamin D system），我国称其为维生素D轴（Vitamin D axis）[6-13]。肾精亏损将导致生殖功能发生障碍。笔者中药能使大鼠卵巢重量明显增长。补肾法治疗可以提高体内雌激素水平，增强各激素靶器官的反应性[14]。
冬虫夏草是一种含有氨基酸、甘露醇、核苷、多糖、甾醇等多种活性成分的名贵中药材，具有补肾填精、纳气平喘的功效。冬虫夏草具有调节雌激素分泌作用[15]，肾精亏损将导致生殖功能发生障碍。笔者基于前期文献及动物实验研究，探讨冬虫夏草对VDR沉默卵巢颗粒细胞CYP19mRNA表达的影响，揭示其对卵巢功能的保护作用并提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 清洁级SD雌性36只，大鼠购买于重庆解放军第三军医大学实验动物中心，体重约150～180 g。许可证号：SCXK-（军）20120011。
1.2 試剂及仪器 主要仪器：实时荧光定量PCR仪（Eppendorf，德国），电泳仪（Bio-rad，美国），凝胶成像仪稳压DNA电泳仪（Tianneng，美国），GDS8000凝胶扫描系统（UVP，美国），超净工作台（苏州净化设备公司），电热压力蒸汽消毒器（浙江绍兴医疗器械总厂），高速台式离心机（BACKMAN CS-15R，美国Beckman公司）。主要试剂：超纯RNA提取试剂盒、HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒、2×EsTaqMasterMix（含染料）（北京康为世纪生物科技有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 颗粒细胞培养 3～4周健康雌性SD大鼠，麻醉后取双侧卵巢，在解剖显微镜下剥离周围脂肪组织，PBS冲洗后剪碎，用0.2%胶原酶及与0.25%胰蛋白酶消化25～30 min，加入DMEM/F12终止消化，以1000 r /min转速离心5min后去除上清液，过筛后接种于25 cm2培养瓶，加入含10%的胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于37℃+5%CO2培养箱中培养，待培养的颗粒细胞（GC）密度适中进行传代。
1.3.2 大鼠卵巢颗粒细胞药物模型构建 将正常卵巢颗粒细胞及转染后的细胞分别接种于6孔细胞培养板，待细胞贴壁后进行相应处理。对照组、基因沉默阴性对照组、VDR沉默组按照常规培养的方式加入含15%血清的DMEM-F12完全培养基[16]。已烯雌酚组、维生素D组、虫草素处理组分别于正常大鼠卵巢颗粒细胞中加入含已烯雌酚、维生素D、高剂量虫草素的含药血清的培养基，干预处理24 h后进行后续实验。VDR沉默+已烯雌酚组、VDR沉默+维生素D组、VDR沉默+虫草素处理组分别于VDR沉默转染后的卵巢颗粒细胞加入含已烯雌酚、维生素D、高剂量虫草素的含药血清的培养基，干预处理24 h后进行后续实验。
1.3.3 实验分组 1：对照组；2：基因沉默阴性对照组；3：VDR沉默组；4：VDR沉默+已烯雌酚组；5：VDR沉默+维生素D组；6：VDR沉默+虫草含药血清处理组。采用荧光定量PCR检测法检测VDR沉默大鼠卵巢颗粒细胞CYP19 mRNA表达。
1.3.4 统计学方法 分析用SPSS 22.0统计软件，计量资料用（x[TX-*3]±s）表示，比较6组间的连续变量用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
实验结果显示，与对照组、基因沉默阴性对照组相比，VDR沉默组CYP19mRNA表达明显下调（P<0.05），VDR沉默+己烯雌酚组、VDR沉默+VD组、VDR沉默+冬虫夏草含药血清组与VDR沉默组比较，CYP19mRNA表达明显上调（P<0.05）。 3 讨论
中医认为肾藏精主生殖，生殖功能是通过肾中先天之精激发而产生的，卵巢功能低下就其本质而言即为肾精不足，故而临床对于卵巢功能低下的治疗多从补肾填精入手。由于中医与现代医学研究对象的同一性，现代医学研究证明维生素D缺乏影响卵巢的组织形态及性腺分泌功能，实验表明维生素D在调节卵巢活动中发挥重要作用。最新研究发现，维生素D不仅仅是维生素，还是一种激素，称之为维生素D内分泌系统[17]。该系统包括维生素D、代谢相关的酶以及维生素D作用的受体（VDR）[18]。除了钙磷代谢外，维生素D在调控细胞有丝分裂，抑制多种组织细胞增殖、分化等方面都发挥较大作用。维生素D还有调节免疫、糖代谢、调控肾素血管紧张素醛固酮系统（RAS）等多种生物学作用，作用广泛，在多个系统中发挥重大作用[8-9]。在下丘脑垂体轴的调控下，卵巢完成排卵和分泌性激素的功能。女性进入围绝经期以后，卵泡数量逐渐减少，可能诱发心血管疾病以及骨质疏松，严重影响妇女的身心健康和生活质量。目前西医治疗主要采用激素替代疗法，长期应用有很多不良反应。中医药补肾填精疗法有其独特优势，其疗效在临床已经逐步得到验证，而其机制有待进一步阐释。近年对VDR和1a-羟化酶基因沉默动物不断深入研究，可以发现维生素D对生殖功能的影响发挥作用。VDRmRNA表达已被证实是在卵巢，在混合卵巢细胞及净化的卵巢颗粒细胞培养物中对性激素类固醇生成起作重要作用。本研究采用荧光定量PCR检测法检测冬虫夏草对VDR沉默大鼠卵巢颗粒细胞中CYP19mRNA表达的影响，实验结果显示，与对照组、基因沉默阴性对照组相比，VDR沉默组CYP19mRNA表达明显下调（P<0.05），VDR沉默+己烯雌酚组、VDR沉默+VD组、VDR沉默+冬虫夏草含药血清组与VDR沉默组比较，CYP19mRNA表达明显上调（P<0.05）。从试验结果可以看出，冬虫夏草具有一定的调节维生素D轴的功能。
4 结论
综上所述，冬虫夏草对卵巢颗粒细胞的保护与促进作用与维生素D、己烯雌酚相似，动物实验结果证实冬虫夏草对卵巢功能的保护作用通过维生素D轴发挥效应，冬虫夏草可以通过调节CYP19产生类维生素D样作用，对大鼠的卵巢颗粒细胞分泌功能产生影响，同时通过调节维生素D轴对大鼠的卵巢产生保护作用。但导致卵巢功能低下的因素众多，冬虫夏草是否还可以通过其他机制来改善卵巢功能，还有待更进一步的研究。
参考文献
[1]姚晓. 脑内催乳素释放肽在电针调整去卵巢大鼠下丘脑—垂体—卵巢轴中的作用 [D].上海：复旦大学， 2004.
[2]关瑞锦， 胡锡衷， 林立芳， 等. 增龄与性激素变化规律的对照研究 [J]. 中国老年学， 1994（1）： 15-6.
[3]PARIKH G， VARADINOVA M， SUWANDHI P， et al. Vitamin D regulates steroidogenesis and insulin-like growth factor binding protein-1（IGFBP-1） production in human ovarian cells [J]. Hormone and metabolic research = Hormon- und Stoffwechselforschung = Hormones et métabolisme， 2010， 42（10）： 754.
[4]ENJUANES A， GARCIAGIRALT N， SUPERVIA A， et al. Regulation of CYP19 gene expression in primary human osteoblasts： effects of vitamin D and other treatments [J]. European Journal of Endocrinology， 2003， 148（5）： 519.
[5]COZZOLINO M， KETTELER M， ZEHNDER D. The vitamin D system： a crosstalk between the heart and kidney [J]. European journal of heart failure， 2010， 12（10）： 1031-41.
[6]柴艺汇，高洁，秦忠，等. 从类固醇激素生成探讨维生素D轴与肾虚证相关性 [J]. 时珍国医国药， 2014（9）： 2286-7.
[7]陈伟，柴艺汇，王焕珍，等. 基于ARROWSMITH探讨淫羊藿与维生素D轴功能的潜在相关性 [J]. 时珍国医国药， 2016（2）： 499-500.
[8]陈雨佳，康樱，管连城，等. 维生素D轴：补肾治疗慢性牙周炎的新靶点 [J]. 亚太传统医药， 2016（24）： 46-8.
[9]陈云志，陈家旭，秦忠，等. 从维生素D轴探讨巴戟天抗抑郁症的作用机制 [J]. 西部中医药， 2017（10）： 128-30.
[10]陈云志，管连城，高洁，等. 维生素D轴：中医补肾方药的潜在靶点 [J]. 时珍国医国药， 2017（9）： 2210-2.
[11]管连城，高洁，柴艺汇，等. 基于Arrowsmith探讨五味子与维生素D轴功能的潜在相关性 [J]. 辽宁中医杂志， 2017（4）： 738-40.
[12]管连城，高洁，柴艺汇，等. 从雌激素生成探讨维生素D轴与“肾藏精，主生殖”功能的相关性 [J]. 辽宁中医杂志， 2017（8）： 1634-6.
[13]管连城，李文，陈伟，等. 人参与维生素D轴的潜在相关性研究 [J]. 中华中医药学刊， 2017（8）： 2078-80.
[14]李炳如， 佘运初. 补肾药对下丘脑—垂体—性腺轴功能影响 [J]. 中医杂志， 1984（7）： 65-7.
[15]姚红， 黄少华， 苏子仁， 等. 葛根虫草软胶囊对大鼠实验性骨质疏松的影响 [J]. 广东药学院学报， 2005（5）： 41-2，7.
[16]赵笛. 基于FOXO3a轉录因子探讨二仙汤对顺铂损伤大鼠卵巢颗粒细胞的保护机制 [D].北京：北京中医药大学， 2017.
[17]HOLICK M F. Vitamin D： A millenium perspective [J]. Journal of cellular biochemistry， 2003， 88（2）： 296-307.
[18]霍本刚， 何娅妮. 活性维生素D的再认识——多种生物学功能 [J]. 肾脏病与透析肾移植杂志， 2009， 18（3）： 249-52.
（收稿日期：2018-03-19 编辑：陶希睿）
【关键词】 卵巢颗粒细胞；冬虫夏草；CYP19；VDR沉默；维生素D
【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）09-0021-03
卵巢作为女性的生殖腺，在中枢神经系统-下丘脑-垂体轴的调控之下，完成排卵和内分泌的功能[1]。女性进入围绝经期以后，卵泡数量逐渐减少，引起骨质疏松、抑郁、心血管疾病等，严重影响妇女的身心健康和生活质量[2]。目前西医治疗主要采用激素替代疗法，长期应用不良反应较为突出。中医药补肾益精疗法有其独特优势，其机制有待进一步阐明。近年对Vitamin D Receptor（VDR） 和1a-羟化酶基因沉默动物不断深入研究发现，维生素D对生殖功能的影响发挥作用。VDRmRNA表达已被证实是在卵巢[3]，在混合卵巢细胞及净化的卵巢颗粒细胞培养物中对性激素类固醇生成起重要作用[3]。芳香化酶在雌激素合成过程中具有重要作用，无论雄性或雌性小鼠，VDR敲除后性腺芳香化酶（P450arom）活性低下，CYP19表达明显降低。
维生素D能直接调节CYP19基因表达，从而调控雌激素分泌[4]。维生素D通过25-羟基维生素D 1-羟化酶（CYP27B1）在肝脏和肾脏中的活性形式（1，25-二羟维生素D）进行修饰，激活的维生素D通过维生素D受体（VDR）产生作用，这个系统在国外称作维生素D轴[5]（ Vitamin D system），我国称其为维生素D轴（Vitamin D axis）[6-13]。肾精亏损将导致生殖功能发生障碍。笔者中药能使大鼠卵巢重量明显增长。补肾法治疗可以提高体内雌激素水平，增强各激素靶器官的反应性[14]。
冬虫夏草是一种含有氨基酸、甘露醇、核苷、多糖、甾醇等多种活性成分的名贵中药材，具有补肾填精、纳气平喘的功效。冬虫夏草具有调节雌激素分泌作用[15]，肾精亏损将导致生殖功能发生障碍。笔者基于前期文献及动物实验研究，探讨冬虫夏草对VDR沉默卵巢颗粒细胞CYP19mRNA表达的影响，揭示其对卵巢功能的保护作用并提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 清洁级SD雌性36只，大鼠购买于重庆解放军第三军医大学实验动物中心，体重约150～180 g。许可证号：SCXK-（军）20120011。
1.2 試剂及仪器 主要仪器：实时荧光定量PCR仪（Eppendorf，德国），电泳仪（Bio-rad，美国），凝胶成像仪稳压DNA电泳仪（Tianneng，美国），GDS8000凝胶扫描系统（UVP，美国），超净工作台（苏州净化设备公司），电热压力蒸汽消毒器（浙江绍兴医疗器械总厂），高速台式离心机（BACKMAN CS-15R，美国Beckman公司）。主要试剂：超纯RNA提取试剂盒、HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒、2×EsTaqMasterMix（含染料）（北京康为世纪生物科技有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 颗粒细胞培养 3～4周健康雌性SD大鼠，麻醉后取双侧卵巢，在解剖显微镜下剥离周围脂肪组织，PBS冲洗后剪碎，用0.2%胶原酶及与0.25%胰蛋白酶消化25～30 min，加入DMEM/F12终止消化，以1000 r /min转速离心5min后去除上清液，过筛后接种于25 cm2培养瓶，加入含10%的胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于37℃+5%CO2培养箱中培养，待培养的颗粒细胞（GC）密度适中进行传代。
1.3.2 大鼠卵巢颗粒细胞药物模型构建 将正常卵巢颗粒细胞及转染后的细胞分别接种于6孔细胞培养板，待细胞贴壁后进行相应处理。对照组、基因沉默阴性对照组、VDR沉默组按照常规培养的方式加入含15%血清的DMEM-F12完全培养基[16]。已烯雌酚组、维生素D组、虫草素处理组分别于正常大鼠卵巢颗粒细胞中加入含已烯雌酚、维生素D、高剂量虫草素的含药血清的培养基，干预处理24 h后进行后续实验。VDR沉默+已烯雌酚组、VDR沉默+维生素D组、VDR沉默+虫草素处理组分别于VDR沉默转染后的卵巢颗粒细胞加入含已烯雌酚、维生素D、高剂量虫草素的含药血清的培养基，干预处理24 h后进行后续实验。
1.3.3 实验分组 1：对照组；2：基因沉默阴性对照组；3：VDR沉默组；4：VDR沉默+已烯雌酚组；5：VDR沉默+维生素D组；6：VDR沉默+虫草含药血清处理组。采用荧光定量PCR检测法检测VDR沉默大鼠卵巢颗粒细胞CYP19 mRNA表达。
1.3.4 统计学方法 分析用SPSS 22.0统计软件，计量资料用（x[TX-*3]±s）表示，比较6组间的连续变量用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
实验结果显示，与对照组、基因沉默阴性对照组相比，VDR沉默组CYP19mRNA表达明显下调（P<0.05），VDR沉默+己烯雌酚组、VDR沉默+VD组、VDR沉默+冬虫夏草含药血清组与VDR沉默组比较，CYP19mRNA表达明显上调（P<0.05）。 3 讨论
中医认为肾藏精主生殖，生殖功能是通过肾中先天之精激发而产生的，卵巢功能低下就其本质而言即为肾精不足，故而临床对于卵巢功能低下的治疗多从补肾填精入手。由于中医与现代医学研究对象的同一性，现代医学研究证明维生素D缺乏影响卵巢的组织形态及性腺分泌功能，实验表明维生素D在调节卵巢活动中发挥重要作用。最新研究发现，维生素D不仅仅是维生素，还是一种激素，称之为维生素D内分泌系统[17]。该系统包括维生素D、代谢相关的酶以及维生素D作用的受体（VDR）[18]。除了钙磷代谢外，维生素D在调控细胞有丝分裂，抑制多种组织细胞增殖、分化等方面都发挥较大作用。维生素D还有调节免疫、糖代谢、调控肾素血管紧张素醛固酮系统（RAS）等多种生物学作用，作用广泛，在多个系统中发挥重大作用[8-9]。在下丘脑垂体轴的调控下，卵巢完成排卵和分泌性激素的功能。女性进入围绝经期以后，卵泡数量逐渐减少，可能诱发心血管疾病以及骨质疏松，严重影响妇女的身心健康和生活质量。目前西医治疗主要采用激素替代疗法，长期应用有很多不良反应。中医药补肾填精疗法有其独特优势，其疗效在临床已经逐步得到验证，而其机制有待进一步阐释。近年对VDR和1a-羟化酶基因沉默动物不断深入研究，可以发现维生素D对生殖功能的影响发挥作用。VDRmRNA表达已被证实是在卵巢，在混合卵巢细胞及净化的卵巢颗粒细胞培养物中对性激素类固醇生成起作重要作用。本研究采用荧光定量PCR检测法检测冬虫夏草对VDR沉默大鼠卵巢颗粒细胞中CYP19mRNA表达的影响，实验结果显示，与对照组、基因沉默阴性对照组相比，VDR沉默组CYP19mRNA表达明显下调（P<0.05），VDR沉默+己烯雌酚组、VDR沉默+VD组、VDR沉默+冬虫夏草含药血清组与VDR沉默组比较，CYP19mRNA表达明显上调（P<0.05）。从试验结果可以看出，冬虫夏草具有一定的调节维生素D轴的功能。
4 结论
综上所述，冬虫夏草对卵巢颗粒细胞的保护与促进作用与维生素D、己烯雌酚相似，动物实验结果证实冬虫夏草对卵巢功能的保护作用通过维生素D轴发挥效应，冬虫夏草可以通过调节CYP19产生类维生素D样作用，对大鼠的卵巢颗粒细胞分泌功能产生影响，同时通过调节维生素D轴对大鼠的卵巢产生保护作用。但导致卵巢功能低下的因素众多，冬虫夏草是否还可以通过其他机制来改善卵巢功能，还有待更进一步的研究。
参考文献
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[10]陈云志，管连城，高洁，等. 维生素D轴：中医补肾方药的潜在靶点 [J]. 时珍国医国药， 2017（9）： 2210-2.
[11]管连城，高洁，柴艺汇，等. 基于Arrowsmith探讨五味子与维生素D轴功能的潜在相关性 [J]. 辽宁中医杂志， 2017（4）： 738-40.
[12]管连城，高洁，柴艺汇，等. 从雌激素生成探讨维生素D轴与“肾藏精，主生殖”功能的相关性 [J]. 辽宁中医杂志， 2017（8）： 1634-6.
[13]管连城，李文，陈伟，等. 人参与维生素D轴的潜在相关性研究 [J]. 中华中医药学刊， 2017（8）： 2078-80.
[14]李炳如， 佘运初. 补肾药对下丘脑—垂体—性腺轴功能影响 [J]. 中医杂志， 1984（7）： 65-7.
[15]姚红， 黄少华， 苏子仁， 等. 葛根虫草软胶囊对大鼠实验性骨质疏松的影响 [J]. 广东药学院学报， 2005（5）： 41-2，7.
[16]赵笛. 基于FOXO3a轉录因子探讨二仙汤对顺铂损伤大鼠卵巢颗粒细胞的保护机制 [D].北京：北京中医药大学， 2017.
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（收稿日期：2018-03-19 编辑：陶希睿）