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（淮南师范学院，安徽 淮南 232000）
【摘要】：化学发光分析方法是一种根据发光反应对化学发光物质由激发态跃迁回基态时所发出的光信号尽心测量的方法。这种方法具有操作便捷、分析速度快、智能化的實现性高以及结果较精确等优势。化学发光在医疗等领域有较为广泛的应用。本文主要对化学发光技术在DNA、生物酶、以及蛋白质检测等等中的应用进行了论述。
【关键词】：生化分析；化学发光；应用
化学发光是一种物质在进行化学反应时发生的光辐射现象。化学发光包括直接和间接发光两种。从本质上来说，化学发光分析方法主要是根据化学发光反应，对化学发光物质由激发态跃迁回基态时所发出的光信号进行测量的方法。化学发光从鲁米诺化学发光试剂的产生到如今，历经了一百多年的发展，奠定了其在生化分析中的重要地位。
一、化学发光简介
目前最常用的三个化学发光体系分别为鲁米诺-H2O2、四价锰离子和联吡啶钌电化学发光体系。
1、鲁米诺-H2O2
鲁米诺是最常用的化学发光剂。最早在20世纪20年代末时，国外学者将H2O2加入到鲁米诺碱性溶剂，发现会产生氧化还原反应并有微弱的藍色发光现象。而加入HRP类的催化剂或者氧化剂时，反应强度也会相应增加。DNA酶也具有催化能力，例如氯高铁血红素/G-四联体DNA酶能够对鲁米诺-H2O2反应进行催化，从而产生化学发光。目前DNA酶已经形成了多种化学发光体系并被应用于转录因子、金属离子以及生物酶活性等的检测。
2、四价锰离子
虽然作为化学发光剂，酸性KMnO4的应用时间和范围都具有优势，但四价锰化合物被作为化学发光剂的使用却较少。固体MnO2首次被作为化学发光剂检测异烟肼是在20世纪90年代末，但其应用范围非常有限，原因是MnO2无法溶于水。进入21世纪，国外学者第一次使用Mn4+，将其作为化学发光剂来对吗啡和可卡因进行检测。具体来说，是将溶解于H3PO4和甲醛当中的Mn4+作为化学发光剂。
3、联吡啶钌电化学
ECL也就是电致化学发光是先对电极施加电压造成电化学反应，继而引起高能级电子的转移反应，从而使得化学发光发生。电致化学发光的特点主要包括背景干扰小、发光空间和时间可控等。三价联吡啶钌是目前应用范围最广的电致化学发光剂。联吡啶钌化合物在稳定性、发光效率等方面具有很大的优势，而且还可重复激发，并且电化学可逆。但由于其在水中易氧化，不稳定，因此应用范围受到限制。
二、化学发光与其他技术的联合应用
由于单一的化学发光分析在抗干扰性等方面存在缺陷，因此一般和其他技术联合使用。
1、以非扩增技术为基础的化学发光分析
以非扩增技术为基础的化学发光分析主要包括以高效液相色谱、毛细管电泳、量子点和微流体芯片以及微阵列为基础的化学发光分析。高效液相色谱与化学发光分析联合使用，综合了二者的优势，具有高灵敏度和高效率的特点，但不足之处在于动态范围较窄；毛细管电泳法与高效液相色谱相比，动态范围变宽，而且能达到分离速度快、分离效果好的结果；量子点法作为新型发光材料，具有量子产率高、光学稳定性好以及宽激发窄发射等优势；微流体芯片以及微阵列使得化学发光分析的微型化趋势更加明显，同时具有携带方便、分析成本低以及分析速度快的优势。
2、以扩增技术为基础的化学发光分析
将化学发光与核酸扩增技术结合起来使用能够使检测结果更精确。等温扩增是一项以酶促反应为基础的核算扩增技术。该技术主要包括链置换扩增、滚环扩增、等温指数扩增以及切口酶信号扩增等等。由于等温扩增的发生对于温度的要求并不是很高，在反应过程中不需要对温度进行严格控制，因此以扩增技术为基础的化学发光分析具有扩增流程简单且时间较短的优势。
三、化学发光在生化分析中的应用
1、对DNA进行检测
核酸分析在现代生物科学领域中占据着不可缺少的重要位置。目前使用最广泛的核酸分析基本上都需要标记技术，例如电化学分析中的二茂铁以及其他氧化还原标记，还有光学分析中的荧光标记。由于化学发光分析在操作流程、成本等方面有较强的优势，因此在DNA检测中被广泛应用。最常用的例如联合使用颜色不同的量子点和DNA酶催化的化学发光，以此对多种DNA进行同时检测。这种检测方法主要是使用CRET促成量子点发光，使得检测结果更精确。
2、对生物小分子进行检测
二硫化物和低分子量硫醇也在细胞的氧化还原反应中起着重要作用。与传统的样品处理方法相比，HPLC和Mn（IV）化合物介导的化学发光克服了分析物降解或者氧化的弊端，提高了检测结果的精确度。具体来说，二者结合能够对血液中的CSH和GSSG进行快速检测。部分学者设计了两条DNA，一条含有DNA酶序列，另一条含有抗ATP适配体序列，并在ATP检测过程中将基于DNA酶催化的化学发光共振能量进行利用。在ATP存在的情况下，就会形成稳定的G-四联体结构，从而生成化学发光。
3、对生物酶活性进行检测
以往的端粒重复序列扩增技术在检测端粒酶方面具有耗时长以及检测流程繁琐的缺陷，因此将化学发光与两级等温扩增相结合，免去了分离和洗涤的环节使得检测时间更短、操作更灵活，而且检测结果更灵敏，结果更精确。此外，还有一种能使引发指数扩增的方式，那就是利用DNA甲基化转移酶。设计具有一定规则的环状DNA模板，在DNA甲基化转移酶存在时能够使得指数扩增并产生大量的DNA酶，从而产生化学发光信号。
4、对蛋白质进行检测
转录因子是一种与糖尿病、癌症等疾病关系较为密切的DNA结合蛋白。使用化学发光与等温指数扩增相结合的方法，对转录因子NF-kB p50进行超灵敏检测。同时使用转录因子和探针，能够使外切酶III不发生切割，然后在T7 RNA聚合酶的作用下产生大量RNA引物，并使等温指数扩增，DNA酶顺势产生，从而促使化学发光的发生。
5、对金属离子进行检测
对金属离子进行检测的最典型表现为将化学发光应用于Hg2+的检测。设计两个分别包含DNA酶亚基I和II以及胸腺嘧啶识别位点的亚基III和IV的DNA探针。胸腺嘧啶位点的作用是对Hg2+进行识别，亚基III和IV中含有部分互补序列。Hg2+能使得亚基III和IV形成T-Hg2+-T复合物，从而两个探针自动形成稳定G-四联体，并催化产生鲁米诺-H2O2化学发光。
结束语：
化学发光分析在检测方面具有耗时短、成本低、检测效率高以及检测结果精确的优势，因此在很多领域尤其是医学和环境监测方面得到了广泛应用。尤其是在毛细管电泳、等温扩增等技术与化学发光相结合之后，化学发光技术克服了以往技术中存在的抗干扰能力差等缺陷，检测方式更便捷，检测过程更容易，因此其应用前景更加光明。
参考文献：
[1]李小花.纳米金属氧化物催化鲁米诺化学发光新体系的研究及其应用[D].陕西师范大学，2013.
[2]肖勤，林金明.化学发光免疫分析方法的应用研究进展[J].分析化学，2015，（06）：929-938.
[3]赵建文，陈艳宁，路士州.化学发光免疫检测仪涉及的关键技术[J].发光学报，2012（12）：1381-1388.
【摘要】：化学发光分析方法是一种根据发光反应对化学发光物质由激发态跃迁回基态时所发出的光信号尽心测量的方法。这种方法具有操作便捷、分析速度快、智能化的實现性高以及结果较精确等优势。化学发光在医疗等领域有较为广泛的应用。本文主要对化学发光技术在DNA、生物酶、以及蛋白质检测等等中的应用进行了论述。
【关键词】：生化分析；化学发光；应用
化学发光是一种物质在进行化学反应时发生的光辐射现象。化学发光包括直接和间接发光两种。从本质上来说，化学发光分析方法主要是根据化学发光反应，对化学发光物质由激发态跃迁回基态时所发出的光信号进行测量的方法。化学发光从鲁米诺化学发光试剂的产生到如今，历经了一百多年的发展，奠定了其在生化分析中的重要地位。
一、化学发光简介
目前最常用的三个化学发光体系分别为鲁米诺-H2O2、四价锰离子和联吡啶钌电化学发光体系。
1、鲁米诺-H2O2
鲁米诺是最常用的化学发光剂。最早在20世纪20年代末时，国外学者将H2O2加入到鲁米诺碱性溶剂，发现会产生氧化还原反应并有微弱的藍色发光现象。而加入HRP类的催化剂或者氧化剂时，反应强度也会相应增加。DNA酶也具有催化能力，例如氯高铁血红素/G-四联体DNA酶能够对鲁米诺-H2O2反应进行催化，从而产生化学发光。目前DNA酶已经形成了多种化学发光体系并被应用于转录因子、金属离子以及生物酶活性等的检测。
2、四价锰离子
虽然作为化学发光剂，酸性KMnO4的应用时间和范围都具有优势，但四价锰化合物被作为化学发光剂的使用却较少。固体MnO2首次被作为化学发光剂检测异烟肼是在20世纪90年代末，但其应用范围非常有限，原因是MnO2无法溶于水。进入21世纪，国外学者第一次使用Mn4+，将其作为化学发光剂来对吗啡和可卡因进行检测。具体来说，是将溶解于H3PO4和甲醛当中的Mn4+作为化学发光剂。
3、联吡啶钌电化学
ECL也就是电致化学发光是先对电极施加电压造成电化学反应，继而引起高能级电子的转移反应，从而使得化学发光发生。电致化学发光的特点主要包括背景干扰小、发光空间和时间可控等。三价联吡啶钌是目前应用范围最广的电致化学发光剂。联吡啶钌化合物在稳定性、发光效率等方面具有很大的优势，而且还可重复激发，并且电化学可逆。但由于其在水中易氧化，不稳定，因此应用范围受到限制。
二、化学发光与其他技术的联合应用
由于单一的化学发光分析在抗干扰性等方面存在缺陷，因此一般和其他技术联合使用。
1、以非扩增技术为基础的化学发光分析
以非扩增技术为基础的化学发光分析主要包括以高效液相色谱、毛细管电泳、量子点和微流体芯片以及微阵列为基础的化学发光分析。高效液相色谱与化学发光分析联合使用，综合了二者的优势，具有高灵敏度和高效率的特点，但不足之处在于动态范围较窄；毛细管电泳法与高效液相色谱相比，动态范围变宽，而且能达到分离速度快、分离效果好的结果；量子点法作为新型发光材料，具有量子产率高、光学稳定性好以及宽激发窄发射等优势；微流体芯片以及微阵列使得化学发光分析的微型化趋势更加明显，同时具有携带方便、分析成本低以及分析速度快的优势。
2、以扩增技术为基础的化学发光分析
将化学发光与核酸扩增技术结合起来使用能够使检测结果更精确。等温扩增是一项以酶促反应为基础的核算扩增技术。该技术主要包括链置换扩增、滚环扩增、等温指数扩增以及切口酶信号扩增等等。由于等温扩增的发生对于温度的要求并不是很高，在反应过程中不需要对温度进行严格控制，因此以扩增技术为基础的化学发光分析具有扩增流程简单且时间较短的优势。
三、化学发光在生化分析中的应用
1、对DNA进行检测
核酸分析在现代生物科学领域中占据着不可缺少的重要位置。目前使用最广泛的核酸分析基本上都需要标记技术，例如电化学分析中的二茂铁以及其他氧化还原标记，还有光学分析中的荧光标记。由于化学发光分析在操作流程、成本等方面有较强的优势，因此在DNA检测中被广泛应用。最常用的例如联合使用颜色不同的量子点和DNA酶催化的化学发光，以此对多种DNA进行同时检测。这种检测方法主要是使用CRET促成量子点发光，使得检测结果更精确。
2、对生物小分子进行检测
二硫化物和低分子量硫醇也在细胞的氧化还原反应中起着重要作用。与传统的样品处理方法相比，HPLC和Mn（IV）化合物介导的化学发光克服了分析物降解或者氧化的弊端，提高了检测结果的精确度。具体来说，二者结合能够对血液中的CSH和GSSG进行快速检测。部分学者设计了两条DNA，一条含有DNA酶序列，另一条含有抗ATP适配体序列，并在ATP检测过程中将基于DNA酶催化的化学发光共振能量进行利用。在ATP存在的情况下，就会形成稳定的G-四联体结构，从而生成化学发光。
3、对生物酶活性进行检测
以往的端粒重复序列扩增技术在检测端粒酶方面具有耗时长以及检测流程繁琐的缺陷，因此将化学发光与两级等温扩增相结合，免去了分离和洗涤的环节使得检测时间更短、操作更灵活，而且检测结果更灵敏，结果更精确。此外，还有一种能使引发指数扩增的方式，那就是利用DNA甲基化转移酶。设计具有一定规则的环状DNA模板，在DNA甲基化转移酶存在时能够使得指数扩增并产生大量的DNA酶，从而产生化学发光信号。
4、对蛋白质进行检测
转录因子是一种与糖尿病、癌症等疾病关系较为密切的DNA结合蛋白。使用化学发光与等温指数扩增相结合的方法，对转录因子NF-kB p50进行超灵敏检测。同时使用转录因子和探针，能够使外切酶III不发生切割，然后在T7 RNA聚合酶的作用下产生大量RNA引物，并使等温指数扩增，DNA酶顺势产生，从而促使化学发光的发生。
5、对金属离子进行检测
对金属离子进行检测的最典型表现为将化学发光应用于Hg2+的检测。设计两个分别包含DNA酶亚基I和II以及胸腺嘧啶识别位点的亚基III和IV的DNA探针。胸腺嘧啶位点的作用是对Hg2+进行识别，亚基III和IV中含有部分互补序列。Hg2+能使得亚基III和IV形成T-Hg2+-T复合物，从而两个探针自动形成稳定G-四联体，并催化产生鲁米诺-H2O2化学发光。
结束语：
化学发光分析在检测方面具有耗时短、成本低、检测效率高以及检测结果精确的优势，因此在很多领域尤其是医学和环境监测方面得到了广泛应用。尤其是在毛细管电泳、等温扩增等技术与化学发光相结合之后，化学发光技术克服了以往技术中存在的抗干扰能力差等缺陷，检测方式更便捷，检测过程更容易，因此其应用前景更加光明。
参考文献：
[1]李小花.纳米金属氧化物催化鲁米诺化学发光新体系的研究及其应用[D].陕西师范大学，2013.
[2]肖勤，林金明.化学发光免疫分析方法的应用研究进展[J].分析化学，2015，（06）：929-938.
[3]赵建文，陈艳宁，路士州.化学发光免疫检测仪涉及的关键技术[J].发光学报，2012（12）：1381-1388.