论文部分内容阅读
（黑龙江省华信药业有限公司 黑龙江省绿航世纪医药科技开发有限公司 哈药集团世一堂制药厂150000）
[摘要] 目的： ？ 采用RP-HPLC法测定巴洛沙星的有关物质。 方法： ？ 使用SMT C18柱（250mm×4.6mm，5μm）， 流动相为乙腈-0.4%十二烷基硫酸钠溶液（47：53）[用枸橼酸（1.5mol/L）调pH值至3.0]，检测波长为295nm，流速为1.0ml/min。 结果 ？ 巴洛沙星与各有关物质在上述色谱条件下能有效地分离。 结论 ？ 该方法结果准确、操作简单、灵敏度高、专属性强，适用于巴洛沙星的有关物质测定。
[关键词] 巴洛沙星；反相高效液相色谱法
中图分类号：R92712 文献标识码：A 文章编号：
巴洛沙星（balofloxacin）系由日本中外制药株式会社与韩国Choongwae公司共同开发的氟喹诺酮类抗菌药，于2002年首次在韩国上市。对革兰阳性菌、革兰阴性菌及厌氧菌具有广谱抗菌活性，对细菌具有选择性抑制作用，体外抗菌活性是环丙沙星、氧氟沙星和洛美沙星的4～16倍；与托氟沙星和司帕沙星类似。由于巴洛沙星在其母核的8位引入了一甲氧基，使其不仅增加了对革兰阳性菌的抗菌活性，而且避免或减少光过敏或光毒性及细胞毒性。巴洛沙星是以羧酸乙酯为起始原料，先和三乙酸硼反应生成螯合物Ⅰ，再和3-甲胺基哌啶二盐酸盐缩合反应得螯合物Ⅱ，然后水解制得。该路线是目前制备巴洛沙星的最优路线。测定巴洛沙星的有关物质常用液相色谱法，俞红等报道，用流动相为0.05mol/L柠檬酸-乙腈（60：40）[三乙胺调pH=4]的反相液相色谱法测定主要中间体羧酸乙酯在巴洛沙星中的含量。本实验通过摸索新的色谱条件，采用乙腈-0.4%十二烷基硫酸钠溶液为流动相的高效液相色谱法，能同时测定了巴洛沙星的合成中间体羧酸乙酯、螯合物Ⅰ及螯合物Ⅱ。该方法简单准确、分离效果好，对巴洛沙星的质量控制具有明显的实用价值。？？？
1 实验部分
1.1 仪器与试剂？ 高效液相色谱仪—Waters 515泵；2487紫外检测器。巴洛沙星样品自制，样品批号：20041015、20041020、20041024；对照品自制，含量：99.7%；羧酸乙酯（江阴市永达化工有限公司），螯合物Ⅰ、螯合物Ⅱ均自制；乙腈为色谱纯试剂，其他试剂均为分析纯试剂。
1.2 实验溶液的制备？ 供试品溶液：取巴洛沙星（批号：20041024）约10.2mg，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；中间体溶液：取羧酸乙酯14.0mg、螯合物Ⅰ11.3mg、螯合物Ⅱ10.3mg，分别置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；混合溶液：取供试品溶液及各中间体溶液各1份，混合，即得。
2 结果与讨论
2.1 测定波长的选择？ 分别称取巴洛沙星及各中间体适量，分别加乙腈溶解制成每1ml中约含6μg的溶液，照分光光度法（ 中国 药典2000年版二部附录ⅣA），在200～400nm的波长处扫描，结果显示巴洛沙星在295nm处吸收最强，且其他中间体在295nm附近有较大的吸收，故选择295nm为本品有关物质测定的检测波长。
？？？ 2.2 ？ 色谱柱及流动相的选择？ 色谱柱：（1）DiamonsilTM C18柱（5μm， 4.6mm×200mm）；（2）Kromasil C18柱（5μm， 4.6mm×200mm）；（3）SMT C18柱（5μm， 4.6mm×250mm）。流動相：（1）参照中国药典2000年版二部沙星类药物有关物质测定，采用流动相：乙腈-0.05mol/L枸橼酸溶液（20： 80）[用三乙胺调pH值至3.5]；（2）乙腈—0.4%十二烷基硫酸钠溶液（47：53）[用枸橼酸（1.5mol/L）调pH值至3.0]。
采用上述不同的色谱柱和流动相进行实验，结果表明：采用色谱柱（1）或（2）及流动相（1），虽然主峰出峰时间适中且峰形较好，但各中间体在此流动相中50min都未见出峰；采用色谱柱（1）或（2）及流动相（2），样品及各中间体出峰时间适中，但峰拖尾严重；采用色谱柱（3）及流动相（2），样品及各中间体出峰时间适中，且峰形较好。所以选择采用色谱柱（3）及流动相（2）来检测本品的有关物质。？？？
2.3 系统适用性试验？ 取1.2项溶液各20μl分别注入液相色谱仪进行测定，并记录色谱图。试验结果表明：巴洛沙星与各中间体在上述色谱条件下能有效地分离。
2.4 专属性试验？ 取供试品溶液9ml，加1.0mol/L盐酸溶液1ml，置水浴（60℃）中放置12h，加1.0mol/L氢氧化钠溶液调节溶液的pH至中性，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为酸破坏溶液；取供试品溶液9ml，加1.0mol/L氢氧化钠溶液1ml，置水浴（60℃）中放置12h，加1.0mol/L盐酸溶液调节溶液的pH值至中性，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为碱破坏溶液；取供试品溶液9ml，加30%过氧化氢1ml，置水浴（60℃）中放置12h，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为氧化破坏溶液。经强酸、强碱、强氧化破坏试验，结果表明：在此色谱条件下，各降解产物峰与主峰均能达到基线分离。
2.5 最低检出量？？ 取巴洛沙星对照品及各中间体适量，分别用流动相逐级稀释后进样，当信噪比为3：1时，测得巴洛沙星、羧酸乙酯、螯合物Ⅰ、螯合物Ⅱ的最低检出量分别为1.12×10-2ng、0.272ng、2.016ng、0.208ng。
2.6 溶液的稳定性试验？ 取供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12h测定，测得溶液在12h内的平均峰面积为99497023.7，RSD为0.35%，说明本品溶液基本稳定。
2.7 有关物质的测定？ 各取3批巴洛沙星供试品适量，分别加流动相溶解并稀释制成每1ml中含巴洛沙星约为0.1mg的溶液，按1.3色谱条件检查有关物质，实验结果表明：3批供试品有关物质结果均小于1.0%。
参考文献：
1、刘红辉，刘艳飞，反相高效液相色谱法测定巴洛沙星有关物质的方法学研究，论文网，2011.06
[摘要] 目的： ？ 采用RP-HPLC法测定巴洛沙星的有关物质。 方法： ？ 使用SMT C18柱（250mm×4.6mm，5μm）， 流动相为乙腈-0.4%十二烷基硫酸钠溶液（47：53）[用枸橼酸（1.5mol/L）调pH值至3.0]，检测波长为295nm，流速为1.0ml/min。 结果 ？ 巴洛沙星与各有关物质在上述色谱条件下能有效地分离。 结论 ？ 该方法结果准确、操作简单、灵敏度高、专属性强，适用于巴洛沙星的有关物质测定。
[关键词] 巴洛沙星；反相高效液相色谱法
中图分类号：R92712 文献标识码：A 文章编号：
巴洛沙星（balofloxacin）系由日本中外制药株式会社与韩国Choongwae公司共同开发的氟喹诺酮类抗菌药，于2002年首次在韩国上市。对革兰阳性菌、革兰阴性菌及厌氧菌具有广谱抗菌活性，对细菌具有选择性抑制作用，体外抗菌活性是环丙沙星、氧氟沙星和洛美沙星的4～16倍；与托氟沙星和司帕沙星类似。由于巴洛沙星在其母核的8位引入了一甲氧基，使其不仅增加了对革兰阳性菌的抗菌活性，而且避免或减少光过敏或光毒性及细胞毒性。巴洛沙星是以羧酸乙酯为起始原料，先和三乙酸硼反应生成螯合物Ⅰ，再和3-甲胺基哌啶二盐酸盐缩合反应得螯合物Ⅱ，然后水解制得。该路线是目前制备巴洛沙星的最优路线。测定巴洛沙星的有关物质常用液相色谱法，俞红等报道，用流动相为0.05mol/L柠檬酸-乙腈（60：40）[三乙胺调pH=4]的反相液相色谱法测定主要中间体羧酸乙酯在巴洛沙星中的含量。本实验通过摸索新的色谱条件，采用乙腈-0.4%十二烷基硫酸钠溶液为流动相的高效液相色谱法，能同时测定了巴洛沙星的合成中间体羧酸乙酯、螯合物Ⅰ及螯合物Ⅱ。该方法简单准确、分离效果好，对巴洛沙星的质量控制具有明显的实用价值。？？？
1 实验部分
1.1 仪器与试剂？ 高效液相色谱仪—Waters 515泵；2487紫外检测器。巴洛沙星样品自制，样品批号：20041015、20041020、20041024；对照品自制，含量：99.7%；羧酸乙酯（江阴市永达化工有限公司），螯合物Ⅰ、螯合物Ⅱ均自制；乙腈为色谱纯试剂，其他试剂均为分析纯试剂。
1.2 实验溶液的制备？ 供试品溶液：取巴洛沙星（批号：20041024）约10.2mg，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；中间体溶液：取羧酸乙酯14.0mg、螯合物Ⅰ11.3mg、螯合物Ⅱ10.3mg，分别置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；混合溶液：取供试品溶液及各中间体溶液各1份，混合，即得。
2 结果与讨论
2.1 测定波长的选择？ 分别称取巴洛沙星及各中间体适量，分别加乙腈溶解制成每1ml中约含6μg的溶液，照分光光度法（ 中国 药典2000年版二部附录ⅣA），在200～400nm的波长处扫描，结果显示巴洛沙星在295nm处吸收最强，且其他中间体在295nm附近有较大的吸收，故选择295nm为本品有关物质测定的检测波长。
？？？ 2.2 ？ 色谱柱及流动相的选择？ 色谱柱：（1）DiamonsilTM C18柱（5μm， 4.6mm×200mm）；（2）Kromasil C18柱（5μm， 4.6mm×200mm）；（3）SMT C18柱（5μm， 4.6mm×250mm）。流動相：（1）参照中国药典2000年版二部沙星类药物有关物质测定，采用流动相：乙腈-0.05mol/L枸橼酸溶液（20： 80）[用三乙胺调pH值至3.5]；（2）乙腈—0.4%十二烷基硫酸钠溶液（47：53）[用枸橼酸（1.5mol/L）调pH值至3.0]。
采用上述不同的色谱柱和流动相进行实验，结果表明：采用色谱柱（1）或（2）及流动相（1），虽然主峰出峰时间适中且峰形较好，但各中间体在此流动相中50min都未见出峰；采用色谱柱（1）或（2）及流动相（2），样品及各中间体出峰时间适中，但峰拖尾严重；采用色谱柱（3）及流动相（2），样品及各中间体出峰时间适中，且峰形较好。所以选择采用色谱柱（3）及流动相（2）来检测本品的有关物质。？？？
2.3 系统适用性试验？ 取1.2项溶液各20μl分别注入液相色谱仪进行测定，并记录色谱图。试验结果表明：巴洛沙星与各中间体在上述色谱条件下能有效地分离。
2.4 专属性试验？ 取供试品溶液9ml，加1.0mol/L盐酸溶液1ml，置水浴（60℃）中放置12h，加1.0mol/L氢氧化钠溶液调节溶液的pH至中性，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为酸破坏溶液；取供试品溶液9ml，加1.0mol/L氢氧化钠溶液1ml，置水浴（60℃）中放置12h，加1.0mol/L盐酸溶液调节溶液的pH值至中性，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为碱破坏溶液；取供试品溶液9ml，加30%过氧化氢1ml，置水浴（60℃）中放置12h，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为氧化破坏溶液。经强酸、强碱、强氧化破坏试验，结果表明：在此色谱条件下，各降解产物峰与主峰均能达到基线分离。
2.5 最低检出量？？ 取巴洛沙星对照品及各中间体适量，分别用流动相逐级稀释后进样，当信噪比为3：1时，测得巴洛沙星、羧酸乙酯、螯合物Ⅰ、螯合物Ⅱ的最低检出量分别为1.12×10-2ng、0.272ng、2.016ng、0.208ng。
2.6 溶液的稳定性试验？ 取供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12h测定，测得溶液在12h内的平均峰面积为99497023.7，RSD为0.35%，说明本品溶液基本稳定。
2.7 有关物质的测定？ 各取3批巴洛沙星供试品适量，分别加流动相溶解并稀释制成每1ml中含巴洛沙星约为0.1mg的溶液，按1.3色谱条件检查有关物质，实验结果表明：3批供试品有关物质结果均小于1.0%。
参考文献：
1、刘红辉，刘艳飞，反相高效液相色谱法测定巴洛沙星有关物质的方法学研究，论文网，2011.06