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摘 要：DNA条形码被认为是一种强大、非定向、准确特异、低成本且适用广泛的方法，是分子生物学领域研究物种鉴定的热点技术。其基于DNA分子水平和通用引物扩增的鉴定方式规避了传统鉴别方法的不足，又超脱于许多分子检测方法只能定向检测的局限，现已被广泛应用于生态环境、医疗卫生、食品安全等各个领域。本文介绍了DNA条形码的基本原理、发展进程和研究现状，总结了其在深加工动物制品中的应用情况，包括在动物源性中药材、海产品、肉及肉制品、动物源性保健品以及皮革制品、动物标本等源性成分鉴别方面的应用，最后对DNA条形码技术鉴定物种的优势和不足以及发展趋势作了总结和展望。
关键词：DNA条形码；深加工；动物制品；动物源性成分
Abstract： DNA barcoding is considered to be a powerful， non-directional， specific， accurate and economical method that can be applied widely. As a technique of great interest for researchers to identify special origin in the field of molecular biology， DNA barcoding amplifies specific DNA sequences by using universal primers， which helps to overcome the shortcomings of the traditional detection methods and transcend the limitation of many molecular methods to directional detection. DNA barcoding nowadays has been widely applied in the fields of environmental and ecological protection， medicine and healthcare， and food safety. This paper outlines the basic principle， developmental process and current studies of DNA barcoding and summarizes its application in the detection of animal species in highly processed animal-derived products like animal-derived traditional Chinese medicinal materials， marine animal products， meat and meat products， animal-derived health products， leather products， and animal specimens. Finally we conclude this review with the advantages and disadvantages of DNA barcoding as well as some perspectives on the future development trend of DNA barcoding.
Key words： DNA barcoding； deep processing； animal-derived products； animal-derived ingredients
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201701009
中圖分类号：Q953 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）01-0048-07
引文格式：
凌胜男， 吴亚君， 韩建勋， 等. DNA条形码技术在深加工动物制品源性成分鉴定中的应用研究进展[J]. 肉类研究， 2017， 31（1）： 48-54. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201701009. http：//www.rlyj.pub
LING Shengnan， WU Yajun， HAN Jianxun， et al. A review of recent advances in the application of dna barcoding in identification of animal species in highly processed animal-derived products[J]. Meat Research， 2017， 31（1）： 48-54.
（in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201701009. http：//www.rlyj.pub
动物源性产品与人类生活生产关系密切，以食品、药品、肉及肉制品、保健品、饲料和纺织皮革制品等为主的动物产品是重要消费品。各国政府针对动物制品质量和安全监管制定严厉法规和措施，但不法分子在经济利益驱动下，通过各种手段进行造假掺杂。典型的案例如2013年席卷欧洲的“马肉丑闻”、2014年沃尔玛中国区被举报“挂驴头卖狐狸肉”以及国内市场时有曝光的“鸭肉假冒羊肉”、“牛肉添加猪肉”等事件，给政府的监管工作提出巨大挑战，也给动物产品的物种鉴别技术研究工作带来更高的要求，尤其对深加工产品中复杂成分、未知成分的准确和快速的判别方法提出迫切需求。
目前，国内外对动物原材料及其制品源性成分的鉴定方法主要有：一是以传统形态学检测方法和显微、光谱、色谱、传感器、质谱技术等为代表的理化鉴别方法；二是生物学鉴定方法，如蛋白质免疫电泳、免疫凝集技术和基于药理学的生物药效评价法；三是基于分子生物学的现代分子检测技术，如荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技术、环介导恒温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、测序技术和DNA条形码技术等。相比较而言，常规理化方法易受产品状态影响，如外观性状相似混淆不清、不同成熟度和加工程度致使成分复杂难辨等而失去准确性；另一类生物学鉴定方法如蛋白质免疫技术则通常存在特异性和灵敏度较低的局限。而基于DNA的分子生物学检测技术则由于高效特异、灵敏快速的特点及DNA样本存在的稳定性和广泛性，给检测工作带来可靠保障。这其中，DNA条形码技术基于使用通用引物的显著优势，无需针对目标物种设计特异性引物探针，可一次实现快速高通量地发现样品中多种未知掺杂成分，真正打破了许多传统分子方法定向检测的局限性，结合国际公认的多个数据库平台，其应用逐渐成熟。因此，DNA条形码技术有望在现代分子检测工作中发挥重要作用。 1 DNA条形码技术的发展
DNA条形码的概念最早由加拿大动物学家Hebert等[1]提出。Hebert在对鳞翅目物种进行种类鉴定的过程中，发现其所选取的编码细胞色素C氧化酶的线粒体COⅠ基因能成功识别出门、目及近缘种水平共200个独立物种的特定序列，从此提出将其作为动物DNA条形码以区分不同物种，DNA条形码概念由此诞生。如同超市商品以条形扫码确定信息一样，每个物种都能找到与其特异确定的DNA条形码序列，对该基因区段设计通用引物，扩增测序后将结果与数据库进行比对，便可获其相应物种信息（图1）。在DNA条形码技术中，确定条形码位点是最为关键的步骤，一段合适的条形码对物种鉴别至关重要。条形码要求能对物种种内的特异性和种间的差异性有良好的区分和包容，且便于设计通用引物，因此充当条形码的DNA片段通常是一段标准的、足够区分的、易扩增且一般较短的序列。目前植物涉及的候选片段主要分布在叶绿体基因编码区（rbcL和matK）和间隔区（trnH-psbA及核基因ITS）[2-4]，微生物（主要是真菌类）主要在核糖体ITS基因[5]，动物条形码技术发展相对较完善，线粒体COⅠ基因已成为公认条形码[6-7]。
自提出以来，DNA条形码技术就备受关注，且发展迅速。2003年3月和5月，国际生命条形码计划（International Barcode of Life，IBOL）提出，来自于全球50多个国家的200多个自然历史博物馆、样本馆以及研究机构参与进来，共同致力于实现DNA条形码物种鉴定的全球标准化。2010年，国际生命条形码计划正式启动，随后昆虫类[8-9]、鱼类[10]和鸟类[11]等动物物种的DNA条形码数据库成功建立，并收入美国国立生物技术信息中心（The National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库。此外已经开展的动物条形码计划还有入侵生物和害虫DNA条形码计划（INBIPS）[12]和生命DNA条形码数据库（Barcode of Life Database，BLOD）。
目前DNA条形码技术已经广泛应用在动物、植物和微生物领域，如食品真伪鉴别[13]、法医学鉴定[14]、植物药理性[15]或毒性[16]鉴定以及保护濒危动植物[18]和探索生物多样性[19-20]等。总体来说，植物各物种间由于广泛杂交，其种间差异逐渐减小，因而目前DNA条码技术对动物物种的适用性（>90%）总体大于植物（～70%）[21]，而微生物研究主要集中在真菌类群的鉴别区分上[22]。
DNA条形码的使用过程中，根據研究对象组织的完整程度，衍生出常规条形码和微型条形码2 种形式。常规条形码片段600～700 bp，适用于新鲜或初级加工的动物产品，例如生鲜肉品、带毛囊的动物毛发、巴氏消毒的乳品等。但对于经过高温高压和复杂物理化学工艺处理的动物产品，例如罐头、皮革、动物胶等，则需要采用微型条码（小于300 bp）来提高检测成功率。而无论是哪种条形码技术，一个重要的前提是高质量的DNA。加工过程的各项高温、高压和辐射等物理处理以及酸碱、添加剂加入等化学处理均会使原料DNA片段发生不同程度的变性、断裂或降解[23]等，断裂程度大的DNA样品会给检测带来很大困难[24]。相比较核DNA而言，线粒体基因及其作为动物DNA公认条形码的COⅠ基因由于具有更大的基因拷贝数，故在加工过程中更容易被保存下来[25-26]，同时，针对深加工样品中DNA断裂程度大的情况，可通过扩增短片段靶序列的微型条形码进行研究。因此总体而言，DNA条形码技术在加工制品的检测中仍占据重要优势，应用其对深加工动物制品源性成分进行检测仍是目前研究值得深入的热点。以下就深加工动物制品的几大类：中药材、海产品、保健品与药品和皮革制品、标本等方面展开详细论述。
2 DNA条形码技术在深加工动物制品中的应用
2.1 动物源性中药材
传统中药治疗（traditional Chinese medicine，TCM）在中国已经有几千年的历史，但直到最近的几十年才真正受到关注并风靡亚洲乃至世界。同选择西药一样，人们对于中药材关注较多的依然是药效、毒性或安全性及合法性等。然而目前在药用动物中药资源市场上，濒危动物药材、假冒伪劣药材和一些由于毒副作用过大（如重金属含量超标、植物毒素剂量过大）已被禁止使用的非法药材还是时有检出[27]。出于维护公众安全利益和保护生物多样性的国际事务的考虑，中药材质量评价及其来源检测工作不容忽视。
目前，应用DNA条形码技术鉴定的动物源性中药材主要有两大类，一是以龟甲水蛭[28]、蜈蚣[29]、鹿茸[30]等原料中药，二是以饮片和中成药为代表的加工动物源性药材产品，例如贾静等[31]利用COⅠ基因作为条形码分析市售65 种鹿茸粉基原，成功鉴定出62%非《中国药典》（2010版）基原待检样品；Kool等[32]基于植物ITS、matK、psbA-trnH和rpoC1基因设计组合条形码对111 份摩洛哥南部中药饮片样本进行质量评价，结果其设计的组合条形码可适用于大部分物种的检测；Yan等[33]设计DNA条形码对233 个牛科和鹿科动物角类制品及其混伪品的线粒体COⅠ基因进行检测，结果检出濒临灭绝动物赛加羚羊和非法动物成分，检测成功率为100%；张龙霏[34]设计线粒体COⅠ基因通用引物，基于条形码技术对8 种羚羊角中成药和6 种全蝎中成药进行鉴定，比对结果显示8 种羚羊角样品与赛加羚羊线粒体全基因组、6 种全蝎样品与东亚钳蝎的相关序列相似度均达到98%以上，由此得出2 组样品皆含真实羚羊角或全蝎成分的结论。
总体来说，在中药饮片及中成药成分检测方面，DNA条形码技术的应用正处于快速发展阶段，其多个可参考数据库，如NCBI中的Genbank、MMDBD数据库（http：//www.cuhk.edu.hk/icm/mmdbd.htm），及基于ITS2和psbA-trnH的中药DNA条形码数据库[35]等，也为其在深加工动物源性中药材检测中提供有效帮助。 2.2 海产品
近年来在食品产业中以低值鱼冒充高值鱼、非法捕捞濒危鱼类的现象时有发生，一些深加工制品如鱼片、罐头、鱼丸、烤鱼片等由于经加工后外形难辨，更予以企图者可乘之机。从“鱼类条形码计划”（fish barcode of life，FISH-BOL）（www.fishbol.org）[36]开展至今，应用DNA条形码技术已经成功对逾万种鱼类进行鉴定，涉及到鲷鱼[37]、鲨鱼[38]、鳕鱼及鳕鱼片[39]等高值鱼、海产品虚假标签的鉴定[39-40]、濒危物种和生物多样性的保护[18-20]等，其研究大多基于生鲜和冷冻样本展开。
在加工海产品的检测方面，Chin等[41]以BOLD和GenBank数据库中约700 bp和150 bp的2 组COⅠ条形码，对鱼丸、鱼松、调味鱼罐头、鱼球爆米花及蟹饺等形态的共54 种加工海产品进行扩增测序，结果除了少数几份经深度加工的罐头及鱼松制品外，83%的样本皆成功检测。类似的研究还有Armani等[42]参考Mikkelsen[43]、Handy[44]等的研究设计靶序列长约655 bp（FDB）和139 bp（MDB）的组合条形码，扩增49 种加工鱼类、软体动物和甲壳类动物样本COⅠ基因，扩增成功率分别为67%、79%；其中66%的样品存在虚假标签的问题，2 个标签为乌贼的样本检出河豚鱼成分，6 种罐头产品只能用MDB扩增，经干燥烟熏处理的1 种样品用2 组条形码均扩增失败。但是，对同样经烟熏工艺加工的鲱鱼片和鳕鱼片样本，Smith等[45]采用DNA条形码技术扩增出线粒体COⅠ基因，并成功測序。此外还有国内研究者[46]参照Ivanova[47]、柳淑芳[48]等的方法设计长约680 bp的COⅠ通用序列引物，扩增出所选15 种烤鱼片样本的COⅠ基因，成功率为100%。由此说明DNA条形码技术对大部分海产品检测应用已较成熟，但对罐头、深度油炸的样品仍具挑战性。
2.3 肉及肉制品
以家畜、家禽为主的肉及其制品在人们日常消费中占据很大比重，然而近年来国内外频频发生的肉制品质量掺假问题使得消费者对肉源及其质量的关注日益增强，且目前市场上肉类产品主要以包装和分块形式存在，难以依靠传统感官手段对其成分进行辨别，因此一种灵敏特异且高通量快速的检测技术对于肉制品掺假检测和消费者权益维护及野生动物保护具有重要意义。
在DNA条形码技术鉴定肉及其制品源性成分的研究中，线粒体COⅠ基因作为动物公认条形码的有效性已被广泛证实[49]。起初研究主要集中于地方品种鉴定和群体遗传多样性，例如高玉时[50]、徐向明[51]、Cai[52]等研究者曾分别对不同地方的多个鸡、鸭和牛的品种进行了区分，Francis等[53]探索了东南亚地区的哺乳动物生物多样性，皆证明了条形码技术在动物分类和鉴定中的准确性和有效性。近两年DNA条形码逐渐应用到肉类制品肉源成分的鉴定，Quinto等[54]以线粒体COⅠ基因为靶标对22 种共54 份美国境内的肉品零售商所售野生动物肉制品进行检测，检测结果发现18.5%的商品存在虚假标签等问题，如以家养牛肉替代牦牛肉，骆驼肉替代马鹿肉；其团队在另一批超市所售野生动物肉制品中还检出在美国被禁止出售的马肉成分[55]。此外D’Amato等[56]对南非132 份高值野味肉制品和14 份牛肉产品进行检测，结果从中鉴定出76.5%的野味肉制品样品存在掺假掺杂，皆为常见家禽家畜成分。
总体来说，尽管目前DNA条形码技术在鉴别肉及其制品源性成分的研究中仍存在较多问题，例如对深度加工肉制品如火腿香肠、动物源性饲料等成分鉴定的研究报道还鲜少见到，对于多次杂交育种筛选发生基因渗入现象的家畜、家禽物种其鉴定结果准确性受到干扰，尚未构建一个权威标准的畜禽类DNA条形码数据库等，但DNA条形码技术作为一种有效可靠且可鉴定未知物种的分子鉴定技术仍具有广阔的发展前景，上述问题可以通过优化DNA提取方法，寻找既有种间保守性又有种内特异性的基因片段作为条形码位点，采用复合条形码技术有望得到解决。
2.4 动物源性保健品
在国际市场上，保健品的需求非常大，超过80%的发达国家的人群都不同程度地消费保健品[57]。但保健品市场存在的虚假标签、以伪充真和添加非法成分等现象始终存在，涉及消费者健康、利益、宗教信仰，甚至触及法律。
不同于在中药制品、海产品及肉制品中的广泛应用，DNA条形码技术在动物源性保健品中的应用报道相对较少，还处于初始研究阶段。加拿大圭尔夫大学的几名研究者[57]曾报道DNA条形码技术在天然保健品掺伪鉴别中的有效率达到88%。开展该研究的学者Wallace等[58]选取了包含胶囊、片剂、根系组织、提取物、保健茶和干制粉末等6 种形式的95 种植物和动物源保健品，其中动物源性样本均采用650 bp COⅠ标准条形码，扩增失败样本再以130 bp微型条形码进行二次检测。结果成功检出75%的样本信息，其中19%的样本标签与实物不符，如老虎鱼翅中鲶鱼成分的检出。此外澳大利亚学者Coghlan等[59]
曾应用高通量二代测序技术，以质粒trnL基因p-loop区和线粒体16S核糖体RNA基因为靶标，对包含散剂、药片/丸、胶囊等各种深加工状态制品的15 种海关进口动植物源性保健品进行检测，鉴别出54%的样本成分信息，并在羚羊角胶囊中鉴定出濒危动物赛加羚羊的成分，认为高通量二代测序技术应用于深度加工的药品成分检测十分有效，由此可推测将DNA条形码与二代测序结合或将成为有效可靠的保健品鉴定技术。
2.5 动物纺织皮革制品
动物皮革制品如手包、腰带、钱包、皮鞋、皮草等是人们的日常生活消费品之一。随着皮革制品行业高端奢侈品牌的不断涌现，皮革来源由牛、猪、蛇、兔等常见动物皮类逐渐向野猪、鳄鱼等高值稀有皮种发展，与此同时对各种名牌仿冒品、非法捕获的珍稀动物如短吻鳄、野猪和羚羊皮的鉴别工作也亟需展开。 在纺织皮革动物源性成分检测方面，Jun等[60]以线粒体cytb基因为靶标，设计特异性引物对查处没收的4 个非法贸易虎皮样本进行扩增测序，结果成功鉴定这4 个样本源性成分皆为犬类动物，其NCBI数据库比对结果与西藏犬相似度达99%～100%。但是应用DNA条形码技术的检测就不那么顺利了。美国的研究者们[61]基于DNA条形码技术以线粒体COⅠ基因为靶标设计通用引物，对来自美国自然历史博物馆采集的血液和组织样本，和美国鱼类和野生动物服务中心没收的非法皮包、腰带和皮鞋共25 个样本进行了检测，这25 个物种样本均为国际贸易中出现最多的野生哺乳和爬行类动物，结果均因DNA断裂程度过大而扩增失败。此后至今关于DNA条形码技术检测纺织皮革制品动物源性成分的报道仍鲜少见刊，因此总体来说，应用DNA条形码技术鉴定皮革制品源性成分仍较困难，但可尝试适应短片段靶序列的微型条形码技术。
2.6 动物标本
在标本的基原鉴定中，由于自身固有的珍稀性，在鉴定时其损耗性样品用量显得尤为重要；除此之外，对于年限较久外形难辨的样本，很难通过定向目标物种实现检测。DNA条形码技术基于稳定且来源广泛的DNA分子水平，只需微量样本即可对未知样品进行高通量扩增测序分析，结合近年来出现的微型条形码和焦磷酸测序技术，越来越成为合适的标本鉴定方法。
目前针对年限较久标本的检测，微型条形码技术已被公认为较合适的方法。2011年，Shokralla等[62]设计目标片段长度为100 bp的线粒体COⅠ微型条形码，结合焦磷酸测序技术，对135 个新采集的（≤4 年）和50 个年限已达53～97 年的共185 個鳞翅类昆虫标本进行检测鉴定。结果新采集样本和年限较久样本的PCR成功率分别为99.3%和96.4%，测序结果96.3%的样本与参考序列匹配度大于98%。此外Han等[63]发现，对于亲缘关系较近的古标本，采用该物种特异性引物扩增可能成功率更高。实验设计了4 对动物COⅠ通用性引物和315 条物种特异性引物，对从1959—1980年的45 个涉及36 种蝴蝶的干标本进行扩增检测，结果通用引物扩增皆失败，但物种特异性引物成功扩增出了所有样本，其产物为71～417 bp间的多个长度片段。研究表明，对近缘性标本的检测，可以综合考虑条形码通用引物及该物种特异性引物。
在标本鉴定中，焦磷酸测序技术、微型条形码以及物种特异性通用引物这3 种基于DNA条形码技术检测的调整方式皆可在其各自适当的应用范围内提高条形码检测的成功率，关键要区分样本的属性，合理选择。
3 结 语
在各种现代分子生物学检测技术中，DNA条形码被认为是一种强大、非定向、准确特异、低成本且适用广泛的方法，是物种鉴定的有效工具。相比于形态观察和理化分析方法，基于DNA序列的检测方法超脱于产品外观混淆不清和理化性质多变的影响，具有特异灵敏、高效快速的优点，而相比于实时荧光PCR、单核苷酸多态性单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）等DNA检测方法，DNA条形码技术的非定向、高通量检测优势也使其越来越成为一项适用性广泛的分子诊断技术。
目前DNA条形码技术除了在上述所列举海产品、中成药、肉及肉制品、标本等深加工动物制品源性成分鉴定中有了较为成熟的应用外，对更多其他深加工动物制品也同时具有前景和挑战，如动物源性饲料，添加了动物成分的化妆品对其源性成分的检测等。随着DNA条形码数据库的不断构建和发展，其为动物制品的质量控制和源性成分鉴别提供了新的应用方向。这种基于通用引物的检测方法不受样本物种数量以及定性信息的影响，非常适用于未知样品的大规模扩增测序鉴定，已经在食品真伪鉴别、法医鉴定、医学研究及生物多样性保护中得到广泛应用。
尽管目前国际上对于DNA条形码技术还存在很多争议，例如它不能区分样本的地理来源，不能准确鉴定杂交物种种属信息[64]，对种间亲缘关系的定位可能与N-J树矛盾[65]等，但DNA条形码技术从来都不是独立的，这些问题可以在其基础之上，通过并联或串联其他分子检测手段得到解决，例如复合条形码技术、微型条形码技术的出现就在一定程度上对加工食品DNA片段高度断裂、多个未知物种混合样品的问题开辟了新的解决办法，此外，实际检测中还可以尝试将DNA条形码技术与基因芯片、RFLP、时间温度梯度电泳（temporal temperature gradient gel electrophoresis，TTGE）等技术结合，以实现更简便快速地检测[66]。事实上，没有任何一项技术在分子水平上鉴定物种是完美的，但DNA条形码技术却仍有着不可替代的优越性：它是一个通用、非定向靶标的检测方法；有一个专业而强大且还在逐步扩充的条形码数据库作为对比分析，这也促进了DNA条形码技术在深加工动物制品、物种鉴定方面的更广泛的应用。总之，DNA条形码技术快速、高通量、稳定等特点为各类学术和商业研究工作拓宽了道路，其应用前景将十分广阔。
参考文献：
[1] HEBERT P D N， CYWINSKA A， BALl S L. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proceedings of the Royal Society of London B： Biological Sciences， 2003， 270： 313-321.
[2] LI D Z， GAO L M， LI H T， et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal spacer （ITS） should be incorporated into the core barcode for seed plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2011， 108（49）： 19641-19646. DOI：10.1073/pnas.1104551108. [3] TABERLET P， COISSAC E， POMPANON F， et al. Power and limitations of the chloroplast trnL（UAA） intron for plant DNA barcoding[J]. Nucleic Acids Research， 2007， 35（3）： e14. DOI：10.1093/nar/gkl938.
[4] CHEN S， YAO H， HAN J， et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J]. PloS One， 2010， 5（1）： e8613. DOI：10.1371/journal.pone.0008613.
[5] SEIFERT K A. Progress towards DNA barcoding of fungi[J]. Molecular Ecology Resources， 2009， 9（Suppl1）： 83-89. DOI：10.1111/j.1755-0998.2009.02635.x.
[6] CHE J， CHEN H M A N， YANG J U N X， et al. Universal COⅠ primers for DNA barcoding amphibians[J]. Molecular Ecology Resources， 2012， 12（2）： 247-258. DOI：10.1111/j.1755-0998.2011.03090.x.
[7] MURPHY R W， CRAWFORD A J， BAUER A M， et al. Cold code： the global initiative to DNA barcode amphibians and nonavianreptiles[J]. Molecular Ecology Resources， 2013， 13（2）： 161-167. DOI：10.1111/1755-0998.12050.
[8] STORK N E， MCBROOM J， GELY C， et al. New approaches narrow global species estimates for beetles， insects， and terrestrial arthropods[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2015， 112（24）： 7519-7523. DOI：10.1073/pnas.1502408112.
[9] VERSTEIRT V， NAGY Z T， ROELANTS P， et al. Identification of Belgian mosquito species （Diptera： Culicidae） by DNA barcoding[J]. Molecular Ecology Resources， 2015， 15（2）： 449-457. DOI：10.1111/1755-0998.12318.
[10] KO H L， WANG Y T， CHIU T S， et al. Evaluating the accuracy of morphological identification of larval fishes by applying DNA barcoding[J]. PLoS One， 2013， 8（1）： e53451. DOI：10.1371/journal.pone.0053451.
[11] HEBERT P D N， STOECKLE M Y， ZEMLAK T S， et al. Identification of birds through DNA barcodes[J]. PLoS Biology， 2004， 2（10）： e312.DOI：10.1371/journal.pbio.0020312.
[12] CROSS H B， LOWE A J， GURGEL C F D. DNA barcoding of invasive species[M]//RICHARDSON D M P P. Fifty years of invasion ecology-the legacy of Charles Elton， 2011： 289-299. DOI：10.1002/9781444329988.ch22.
[13] VARTAK V R， NARASIMMALU R， ANNAM P K， et al. DNA barcoding detected improper labelling and supersession of crab food served by restaurants in India[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2015， 95（2）： 359-366. DOI：10.1002/jsfa.6728.
[14] BELL K L， BURGESS K S， OKAMOTO K C， et al. Review and future prospects for DNA barcoding methods in forensic palynology[J]. Forensic Science International： Genetics， 2016， 21： 110-116. DOI：10.1016/j.fsigen.2015.12.010. [15] GONG W， LIU Y， CHEN J， et al. DNA barcodes identify Chinese medicinal plants and detect geographical patterns of Sinosenecio （Asteraceae）[J]. Journal of Systematics and Evolution， 2016， 54（1）： 83-91. DOI：10.1111/jse.12166.
[16] LI M， AU K Y， LAM H， et al. Identification of Baiying （Herba Solani Lyrati） commodity and its toxic substitute Xungufeng （Herba Aristolochiae Mollissimae） using DNA barcoding and chemical profiling techniques[J]. Food Chemistry， 2012， 135（3）： 1653-1658. DOI：10.1016/j.foodchem.2012.06.049.
[17] GALIMBERTI A， LABRA M， SANDIONIGI A， et al. DNA barcoding for minor crops and food traceability[J]. Advances in Agriculture， 2014. DOI：10.1155/2014/831875.
[18] SEMBIRING A， PERTIWI N P D， MAHARDINI A， et al. DNA barcoding reveals targeted fisheries for endangered sharks in Indonesia[J]. Fisheries Research， 2015， 164： 130-134. DOI：10.1016/j.fishres.2014.11.003.
[19] BAFEEL S O， ARIF I A， BAKIR M A， et al. DNA barcoding of arid wild plants using rbcL gene sequences[J]. Genetics and Molecular Research： GMR， 2012， 11： 1934-1941. DOI：10.4238/2012.July.19.12.
[20] TRIVEDI S， ALOUFI A A， ANSARI A A， et al. Role of DNA barcoding in marine biodiversity assessment and conservation： an update[J]. Saudi Journal of Biological Sciences， 2016， 23： 161-171. DOI：10.1016/j.sjbs.2015.01.001.
[21] FAZEKAS A J， KESANAKURTI P R， BURGESS K S， et al. Are plant species inherently harder to discriminate than animal species using DNA barcoding markers？[J]. Molecular Ecology Resources， 2009， 9（Suppl1）： 130-139. DOI：10.1111/j.1755-0998.2009.02652.x.
[22] 陳念， 赵树进， 韩丽萍. DNA条形码真菌鉴定技术[J]. 国际检验医学杂志， 2008， 29（8）： 703-704. DOI：10.3969/j.issn.1673-4130.2008.08.013.
[23] BAUER T， WELLER P， HAMMES W P， et al. The effect of processing parameters on DNA degradation in food[J]. European Food Research and Technology， 2003， 217（4）： 338-343. DOI：10.1007/s00217-003-0743-y.
[24] HELLBERG R S R， MORRISSEY M T. Advances in DNA-based techniques for the detection of seafood species substitution on the commercial market[J]. Journal of the Association for Laboratory Automation， 2011， 16（4）： 308-321. DOI：10.1016/j.jala.2010.07.004.
[25] GALIMBERTI A， de MATTIA F， LOSA A， et al. DNA barcoding as a new tool for food traceability[J]. Food Research International， 2013， 50（1）： 55-63. DOI：10.1016/j.foodres.2012.09.036.
[26] ASLAN O， HAMILL R M， SWEENEY T， et al. Integrity of nuclear genomic deoxyribonucleic acid in cooked meat： implications for food traceability[J]. Journal of Animal Science， 2009， 87（1）： 57-61. DOI：10.2527/jas.2008-0995. [27] COGHLAN M L， HAILE J， HOUSTON J， et al. Deep sequencing of plant and animal DNA contained within traditional Chinese medicines reveals legality issues and health safety concerns[J]. PLoS Genet， 2012， 8（4）： e1002657. DOI：10.1371/journal.pgen.1002657.
[28] 劉晓帆. 龟甲， 水蛭的品种与质量研究[D]. 北京： 北京中医药大学， 2013.
[29] 张红印， 陈俊， 贾静， 等. 中药材蜈蚣及其混伪品DNA条形码鉴别研究[J]. 中国中药杂志， 2014， 39（12）： 2208-2208. DOI：10.4268/cjcmm20141212.
[30] 崔丽娜， 杜鹤， 刘新成， 等. 基于COⅠ条形码序列的鹿茸及其混伪品的DNA分子鉴定[J]. 吉林中医药， 2012， 32（4）： 384-387.
[31] 贾静， 石林春， 徐志超， 等. 市售鹿茸粉药材的DNA条形码鉴定[J]. 药学学报， 2015， 50（10）： 1356-1361.
[32] KOOL A， de BOER H J， KR?GER ?， et al. Molecular identification of commercialized medicinal plants in Southern Morocco[J]. PloS One， 2012， 7（6）： e39459. DOI：10.1371/journal.pone.0039459.
[33] YAN D， LUO J Y， HAN Y M， et al. Forensic DNA barcoding and bio-response studies of animal horn products used in traditional medicine[J]. PloS One， 2013， 8（2）： e55854. DOI：10.1371/journal.pone.0055854.
[34] 张龙霏. 基于 DNA 条形码的中成药中动物药材的检定[D]. 济南： 山东中医药大学， 2014.
[35] 程新玮， 赵焕新， 宁康， 等. DNA 条形码技术在中药质量评价中的研究进展[J]. 食品与药品， 2013， 15（4）： 295-299. DOI：10.3969/j.issn.1672-979X.2013.04.030.
[36] MITCHELL A， KEENA M A， GOPURENKO D， et al. Towards a global barcode library for Lymantria （Lepidoptera： Lymantriinae） tussock moths of biosecurity concern[J]. PLoS One， 2010， 5（12）： e14280. DOI：10.1371/journal.pone.0014280.
[37] ARMANI A， GUARDONE L， CASTIGLIEGO L， et al. DNA and Mini-DNA barcoding for the identification of Porgies species （family Sparidae） of commercial interest on the international market[J]. Food Control， 2015， 50： 589-596. DOI：10.1016/j.foodcont.2014.09.025.
[38] BARBUTO M， GALIMBERTI A， FERRI E， et al. DNA barcoding reveals fraudulent substitutions in shark seafood products： the Italian case of “palombo”（Mustelus spp.）[J]. Food Research International， 2010， 43（1）： 376-381. DOI：10.1016/j.foodres.2009.10.009.
[39] KANNUCHAMY N， PAVAN-KUMAR A， GUDIPATI V， et al.
Mislabeling in Indian seafood： an investigation using DNA barcoding[J]. Food Control， 2016， 59： 196-200. DOI：10.1016/j.foodcont.2015.05.018.
[40] CARVALHO D C， PALHARES R M， DRUMMOND M G， et al. DNA barcoding identification of commercialized seafood in South Brazil： a governmental regulatory forensic program[J]. Food Control， 2015， 50： 784-788. DOI：10.1016/j.foodcont.2014.10.025.
[41] CHIN T C， ADIBAH A B， HARIZ Z A D， et al. Detection of mislabelled seafood products in Malaysia by DNA barcoding： improving transparency in food market[J]. Food Control， 2016， 64： 247-256. DOI：10.1016/j.foodcont.2015.11.042. [42] ARMANI A， GUARDONE L， la CASTELLANA R， et al. DNA barcoding reveals commercial and health issues in ethnic seafood sold on the Italian market[J]. Food Control， 2015， 55： 206-214. DOI：10.1016/j.foodcont.2015.02.030.
[43] MIKKELSEN P M， BIELER R， KAPPNER I， et al. Phylogeny of Veneroidea （Mollusca： Bivalvia） based on morphology and molecules[J]. Zoological Journal of the Linnean Society， 2006， 148（3）： 439-521. DOI：10.1111/j.1096-3642.2006.00262.x.
[44] HANDY S M， DEEDS J R， IVANOVA N V， et al. A single-laboratory validated method for the generation of DNA barcodes for the identification of fish for regulatory compliance[J]. Journal of AOAC International， 2011， 94（1）： 201-210.
[45] SMITH P J， MCVEAGH S M， STEINKE D. DNA barcoding for the identification of smoked fish products[J]. Journal of Fish Biology， 2008， 72（2）： 464-471. DOI：10.1119/1.18980.
[46] 李新光， 王璐， 趙峰， 等. DNA 条形码技术在鱼肉及其制品鉴别中的应用[J]. 食品科学， 2013， 34（18）： 337-342. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201318069.
[47] IVANOVA N V， ZEMLAK T S， HANNER R H， et al. Universal primer cocktails for fish DNA barcoding[J]. Molecular Ecology Notes， 2007， 7（4）： 544-548. DOI：10.1111/j.1471-8286.2007.01748.x.
[48] 柳淑芳， 陈亮亮， 戴芳群， 等. 基于线粒体COⅠ基因的DNA条形码在石首鱼科（Sciaenidae）鱼类系统分类中的应用[J]. 海洋与湖沼， 2010， 41（2）： 223-232. DOI：10.11693/hyhz201002010010.
[49] LUO A， ZHANG A， HO S Y， et al. Potential efficacy of mitochondrial genes for animal DNA barcoding： a case study using eutherian mammals[J]. BMC Genomics， 2011， 12（1）： 1-13.
[50] 高玉时， 屠云洁， 童海兵， 等. 6 个地方鸡种线粒体COⅠ基因的DNA条形码[J]. 农业生物技术学报， 2007， 15（6）： 924-930.
[51] 徐向明. 我国3 个地方品种鸭线粒体DNA COⅠ基因的DNA条形码初步分析[J]. 畜牧与兽医， 2008， 40（11）： 51-53.
[52] CAI Y S， ZHANG L， SHEN F J， et al. DNA barcoding of 18 species of Bovidae[J]. Chinese Science Bulletin ， 2011， 56（2）： 164-168.
[53] FRANCIS C M， BORISENKO A V， IVANOVA N V， et al. The role of DNA barcodes in understanding and conservation of mammal diversity in Southeast Asia[J]. PLoS One， 2010， 5（9）： e12575-e12575.
[54] QUINTO C A， TINOCO R， HELLBERG R S. DNA barcoding reveals mislabeling of game meat species on the US commercial market[J]. Food Control， 2016， 59： 386-392.
[55] KANE D E， HELLBERG R S. Identification of species in ground meat products sold on the US commercial market using DNA-based methods[J]. Food Control， 2016， 59： 158-163.
[56] D’AMATO M E， ALECHINE E， CLOETE K W， et al. Where is the game？ Wild meat products authentication in South Africa： a case study[J]. Investigative genetics， 2013， 4（1）： 1-13. [57] WALLACE L J. DNA barcoding effective in authenticating natural health products[EB/OL]. （2012-09-20）[2016-12-25]. http：//www.news-medical.net/news/20120920/DNA-barcoding-effective-in-authenticating-natural-health-products.aspx
[58] WALLACE L J， BOILARD S M A L， EAGLE S H C， et al. DNA barcodes for everyday life： routine authentication of natural health products[J]. Food Research International， 2012， 49（1）： 446-452. DOI：10.1016/j.foodres.2012.07.048.
[59] COGHLAN M L， HAILE J， HOUSTON J， et al. Deep sequencing of plant and animal DNA contained within traditional Chinese medicines reveals legality issues and health safety concerns[J]. PLoS Genet， 2012， 8（4）： e1002657.
[60] JUN J， HAN S H， JEONG T J， et al. Wildlife forensics using mitochondrial DNA sequences： species identification based on hairs collected in the field and confiscated tanned Felidae leathers[J]. Genes and Genomics， 2011， 33（6）： 721-726. DOI：10.1007/s13258-011-0080-7.
[61] ALLEN U. “DNA Barcodes” help monitor illegal trade of wildlife products[EB/OL]. （2009-09-17）[2016-12-25]. http：//www.cabi.org/vetmedresource/news/19902.
[62] SHOKRALLA S， ZHOU X， JANZEN D H， et al. Pyrosequencing for mini-barcoding of fresh and old museum specimens[J]. PLoS One， 2011， 6（7）： 3007-3024. DOI：10.1371/journal.pone.0021252.
[63] HAN T， LEE W， LEE Y， et al. Barcoding old Korean lepidopteran specimens using newly designed specific primer pairs[J]. Journal of Asia-Pacific Entomology， 2014， 17（4）： 679-684. DOI：10.1016/j.aspen.2014.06.007.
[64] CLARK L F. The current status of DNA barcoding technology for species identification in fish value chains[J]. Food Policy， 2015， 54： 85-94. DOI：10.1016/j.foodpol.2015.05.005.
[65] COLLINS R A， CRUICKSHANK R H. The seven deadly sins of DNA barcoding[J]. Molecular Ecology Resources， 2013， 13（6）： 969-975. DOI：10.1111/1755-0998.12046.
[66] 邱德義， 胡佳， 刘德星， 等. DNA条形码技术在肉品防欺诈鉴别中的应用[J]. 肉类研究， 2013， 27（4）： 40-43.
关键词：DNA条形码；深加工；动物制品；动物源性成分
Abstract： DNA barcoding is considered to be a powerful， non-directional， specific， accurate and economical method that can be applied widely. As a technique of great interest for researchers to identify special origin in the field of molecular biology， DNA barcoding amplifies specific DNA sequences by using universal primers， which helps to overcome the shortcomings of the traditional detection methods and transcend the limitation of many molecular methods to directional detection. DNA barcoding nowadays has been widely applied in the fields of environmental and ecological protection， medicine and healthcare， and food safety. This paper outlines the basic principle， developmental process and current studies of DNA barcoding and summarizes its application in the detection of animal species in highly processed animal-derived products like animal-derived traditional Chinese medicinal materials， marine animal products， meat and meat products， animal-derived health products， leather products， and animal specimens. Finally we conclude this review with the advantages and disadvantages of DNA barcoding as well as some perspectives on the future development trend of DNA barcoding.
Key words： DNA barcoding； deep processing； animal-derived products； animal-derived ingredients
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201701009
中圖分类号：Q953 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）01-0048-07
引文格式：
凌胜男， 吴亚君， 韩建勋， 等. DNA条形码技术在深加工动物制品源性成分鉴定中的应用研究进展[J]. 肉类研究， 2017， 31（1）： 48-54. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201701009. http：//www.rlyj.pub
LING Shengnan， WU Yajun， HAN Jianxun， et al. A review of recent advances in the application of dna barcoding in identification of animal species in highly processed animal-derived products[J]. Meat Research， 2017， 31（1）： 48-54.
（in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201701009. http：//www.rlyj.pub
动物源性产品与人类生活生产关系密切，以食品、药品、肉及肉制品、保健品、饲料和纺织皮革制品等为主的动物产品是重要消费品。各国政府针对动物制品质量和安全监管制定严厉法规和措施，但不法分子在经济利益驱动下，通过各种手段进行造假掺杂。典型的案例如2013年席卷欧洲的“马肉丑闻”、2014年沃尔玛中国区被举报“挂驴头卖狐狸肉”以及国内市场时有曝光的“鸭肉假冒羊肉”、“牛肉添加猪肉”等事件，给政府的监管工作提出巨大挑战，也给动物产品的物种鉴别技术研究工作带来更高的要求，尤其对深加工产品中复杂成分、未知成分的准确和快速的判别方法提出迫切需求。
目前，国内外对动物原材料及其制品源性成分的鉴定方法主要有：一是以传统形态学检测方法和显微、光谱、色谱、传感器、质谱技术等为代表的理化鉴别方法；二是生物学鉴定方法，如蛋白质免疫电泳、免疫凝集技术和基于药理学的生物药效评价法；三是基于分子生物学的现代分子检测技术，如荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技术、环介导恒温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、测序技术和DNA条形码技术等。相比较而言，常规理化方法易受产品状态影响，如外观性状相似混淆不清、不同成熟度和加工程度致使成分复杂难辨等而失去准确性；另一类生物学鉴定方法如蛋白质免疫技术则通常存在特异性和灵敏度较低的局限。而基于DNA的分子生物学检测技术则由于高效特异、灵敏快速的特点及DNA样本存在的稳定性和广泛性，给检测工作带来可靠保障。这其中，DNA条形码技术基于使用通用引物的显著优势，无需针对目标物种设计特异性引物探针，可一次实现快速高通量地发现样品中多种未知掺杂成分，真正打破了许多传统分子方法定向检测的局限性，结合国际公认的多个数据库平台，其应用逐渐成熟。因此，DNA条形码技术有望在现代分子检测工作中发挥重要作用。 1 DNA条形码技术的发展
DNA条形码的概念最早由加拿大动物学家Hebert等[1]提出。Hebert在对鳞翅目物种进行种类鉴定的过程中，发现其所选取的编码细胞色素C氧化酶的线粒体COⅠ基因能成功识别出门、目及近缘种水平共200个独立物种的特定序列，从此提出将其作为动物DNA条形码以区分不同物种，DNA条形码概念由此诞生。如同超市商品以条形扫码确定信息一样，每个物种都能找到与其特异确定的DNA条形码序列，对该基因区段设计通用引物，扩增测序后将结果与数据库进行比对，便可获其相应物种信息（图1）。在DNA条形码技术中，确定条形码位点是最为关键的步骤，一段合适的条形码对物种鉴别至关重要。条形码要求能对物种种内的特异性和种间的差异性有良好的区分和包容，且便于设计通用引物，因此充当条形码的DNA片段通常是一段标准的、足够区分的、易扩增且一般较短的序列。目前植物涉及的候选片段主要分布在叶绿体基因编码区（rbcL和matK）和间隔区（trnH-psbA及核基因ITS）[2-4]，微生物（主要是真菌类）主要在核糖体ITS基因[5]，动物条形码技术发展相对较完善，线粒体COⅠ基因已成为公认条形码[6-7]。
自提出以来，DNA条形码技术就备受关注，且发展迅速。2003年3月和5月，国际生命条形码计划（International Barcode of Life，IBOL）提出，来自于全球50多个国家的200多个自然历史博物馆、样本馆以及研究机构参与进来，共同致力于实现DNA条形码物种鉴定的全球标准化。2010年，国际生命条形码计划正式启动，随后昆虫类[8-9]、鱼类[10]和鸟类[11]等动物物种的DNA条形码数据库成功建立，并收入美国国立生物技术信息中心（The National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库。此外已经开展的动物条形码计划还有入侵生物和害虫DNA条形码计划（INBIPS）[12]和生命DNA条形码数据库（Barcode of Life Database，BLOD）。
目前DNA条形码技术已经广泛应用在动物、植物和微生物领域，如食品真伪鉴别[13]、法医学鉴定[14]、植物药理性[15]或毒性[16]鉴定以及保护濒危动植物[18]和探索生物多样性[19-20]等。总体来说，植物各物种间由于广泛杂交，其种间差异逐渐减小，因而目前DNA条码技术对动物物种的适用性（>90%）总体大于植物（～70%）[21]，而微生物研究主要集中在真菌类群的鉴别区分上[22]。
DNA条形码的使用过程中，根據研究对象组织的完整程度，衍生出常规条形码和微型条形码2 种形式。常规条形码片段600～700 bp，适用于新鲜或初级加工的动物产品，例如生鲜肉品、带毛囊的动物毛发、巴氏消毒的乳品等。但对于经过高温高压和复杂物理化学工艺处理的动物产品，例如罐头、皮革、动物胶等，则需要采用微型条码（小于300 bp）来提高检测成功率。而无论是哪种条形码技术，一个重要的前提是高质量的DNA。加工过程的各项高温、高压和辐射等物理处理以及酸碱、添加剂加入等化学处理均会使原料DNA片段发生不同程度的变性、断裂或降解[23]等，断裂程度大的DNA样品会给检测带来很大困难[24]。相比较核DNA而言，线粒体基因及其作为动物DNA公认条形码的COⅠ基因由于具有更大的基因拷贝数，故在加工过程中更容易被保存下来[25-26]，同时，针对深加工样品中DNA断裂程度大的情况，可通过扩增短片段靶序列的微型条形码进行研究。因此总体而言，DNA条形码技术在加工制品的检测中仍占据重要优势，应用其对深加工动物制品源性成分进行检测仍是目前研究值得深入的热点。以下就深加工动物制品的几大类：中药材、海产品、保健品与药品和皮革制品、标本等方面展开详细论述。
2 DNA条形码技术在深加工动物制品中的应用
2.1 动物源性中药材
传统中药治疗（traditional Chinese medicine，TCM）在中国已经有几千年的历史，但直到最近的几十年才真正受到关注并风靡亚洲乃至世界。同选择西药一样，人们对于中药材关注较多的依然是药效、毒性或安全性及合法性等。然而目前在药用动物中药资源市场上，濒危动物药材、假冒伪劣药材和一些由于毒副作用过大（如重金属含量超标、植物毒素剂量过大）已被禁止使用的非法药材还是时有检出[27]。出于维护公众安全利益和保护生物多样性的国际事务的考虑，中药材质量评价及其来源检测工作不容忽视。
目前，应用DNA条形码技术鉴定的动物源性中药材主要有两大类，一是以龟甲水蛭[28]、蜈蚣[29]、鹿茸[30]等原料中药，二是以饮片和中成药为代表的加工动物源性药材产品，例如贾静等[31]利用COⅠ基因作为条形码分析市售65 种鹿茸粉基原，成功鉴定出62%非《中国药典》（2010版）基原待检样品；Kool等[32]基于植物ITS、matK、psbA-trnH和rpoC1基因设计组合条形码对111 份摩洛哥南部中药饮片样本进行质量评价，结果其设计的组合条形码可适用于大部分物种的检测；Yan等[33]设计DNA条形码对233 个牛科和鹿科动物角类制品及其混伪品的线粒体COⅠ基因进行检测，结果检出濒临灭绝动物赛加羚羊和非法动物成分，检测成功率为100%；张龙霏[34]设计线粒体COⅠ基因通用引物，基于条形码技术对8 种羚羊角中成药和6 种全蝎中成药进行鉴定，比对结果显示8 种羚羊角样品与赛加羚羊线粒体全基因组、6 种全蝎样品与东亚钳蝎的相关序列相似度均达到98%以上，由此得出2 组样品皆含真实羚羊角或全蝎成分的结论。
总体来说，在中药饮片及中成药成分检测方面，DNA条形码技术的应用正处于快速发展阶段，其多个可参考数据库，如NCBI中的Genbank、MMDBD数据库（http：//www.cuhk.edu.hk/icm/mmdbd.htm），及基于ITS2和psbA-trnH的中药DNA条形码数据库[35]等，也为其在深加工动物源性中药材检测中提供有效帮助。 2.2 海产品
近年来在食品产业中以低值鱼冒充高值鱼、非法捕捞濒危鱼类的现象时有发生，一些深加工制品如鱼片、罐头、鱼丸、烤鱼片等由于经加工后外形难辨，更予以企图者可乘之机。从“鱼类条形码计划”（fish barcode of life，FISH-BOL）（www.fishbol.org）[36]开展至今，应用DNA条形码技术已经成功对逾万种鱼类进行鉴定，涉及到鲷鱼[37]、鲨鱼[38]、鳕鱼及鳕鱼片[39]等高值鱼、海产品虚假标签的鉴定[39-40]、濒危物种和生物多样性的保护[18-20]等，其研究大多基于生鲜和冷冻样本展开。
在加工海产品的检测方面，Chin等[41]以BOLD和GenBank数据库中约700 bp和150 bp的2 组COⅠ条形码，对鱼丸、鱼松、调味鱼罐头、鱼球爆米花及蟹饺等形态的共54 种加工海产品进行扩增测序，结果除了少数几份经深度加工的罐头及鱼松制品外，83%的样本皆成功检测。类似的研究还有Armani等[42]参考Mikkelsen[43]、Handy[44]等的研究设计靶序列长约655 bp（FDB）和139 bp（MDB）的组合条形码，扩增49 种加工鱼类、软体动物和甲壳类动物样本COⅠ基因，扩增成功率分别为67%、79%；其中66%的样品存在虚假标签的问题，2 个标签为乌贼的样本检出河豚鱼成分，6 种罐头产品只能用MDB扩增，经干燥烟熏处理的1 种样品用2 组条形码均扩增失败。但是，对同样经烟熏工艺加工的鲱鱼片和鳕鱼片样本，Smith等[45]采用DNA条形码技术扩增出线粒体COⅠ基因，并成功測序。此外还有国内研究者[46]参照Ivanova[47]、柳淑芳[48]等的方法设计长约680 bp的COⅠ通用序列引物，扩增出所选15 种烤鱼片样本的COⅠ基因，成功率为100%。由此说明DNA条形码技术对大部分海产品检测应用已较成熟，但对罐头、深度油炸的样品仍具挑战性。
2.3 肉及肉制品
以家畜、家禽为主的肉及其制品在人们日常消费中占据很大比重，然而近年来国内外频频发生的肉制品质量掺假问题使得消费者对肉源及其质量的关注日益增强，且目前市场上肉类产品主要以包装和分块形式存在，难以依靠传统感官手段对其成分进行辨别，因此一种灵敏特异且高通量快速的检测技术对于肉制品掺假检测和消费者权益维护及野生动物保护具有重要意义。
在DNA条形码技术鉴定肉及其制品源性成分的研究中，线粒体COⅠ基因作为动物公认条形码的有效性已被广泛证实[49]。起初研究主要集中于地方品种鉴定和群体遗传多样性，例如高玉时[50]、徐向明[51]、Cai[52]等研究者曾分别对不同地方的多个鸡、鸭和牛的品种进行了区分，Francis等[53]探索了东南亚地区的哺乳动物生物多样性，皆证明了条形码技术在动物分类和鉴定中的准确性和有效性。近两年DNA条形码逐渐应用到肉类制品肉源成分的鉴定，Quinto等[54]以线粒体COⅠ基因为靶标对22 种共54 份美国境内的肉品零售商所售野生动物肉制品进行检测，检测结果发现18.5%的商品存在虚假标签等问题，如以家养牛肉替代牦牛肉，骆驼肉替代马鹿肉；其团队在另一批超市所售野生动物肉制品中还检出在美国被禁止出售的马肉成分[55]。此外D’Amato等[56]对南非132 份高值野味肉制品和14 份牛肉产品进行检测，结果从中鉴定出76.5%的野味肉制品样品存在掺假掺杂，皆为常见家禽家畜成分。
总体来说，尽管目前DNA条形码技术在鉴别肉及其制品源性成分的研究中仍存在较多问题，例如对深度加工肉制品如火腿香肠、动物源性饲料等成分鉴定的研究报道还鲜少见到，对于多次杂交育种筛选发生基因渗入现象的家畜、家禽物种其鉴定结果准确性受到干扰，尚未构建一个权威标准的畜禽类DNA条形码数据库等，但DNA条形码技术作为一种有效可靠且可鉴定未知物种的分子鉴定技术仍具有广阔的发展前景，上述问题可以通过优化DNA提取方法，寻找既有种间保守性又有种内特异性的基因片段作为条形码位点，采用复合条形码技术有望得到解决。
2.4 动物源性保健品
在国际市场上，保健品的需求非常大，超过80%的发达国家的人群都不同程度地消费保健品[57]。但保健品市场存在的虚假标签、以伪充真和添加非法成分等现象始终存在，涉及消费者健康、利益、宗教信仰，甚至触及法律。
不同于在中药制品、海产品及肉制品中的广泛应用，DNA条形码技术在动物源性保健品中的应用报道相对较少，还处于初始研究阶段。加拿大圭尔夫大学的几名研究者[57]曾报道DNA条形码技术在天然保健品掺伪鉴别中的有效率达到88%。开展该研究的学者Wallace等[58]选取了包含胶囊、片剂、根系组织、提取物、保健茶和干制粉末等6 种形式的95 种植物和动物源保健品，其中动物源性样本均采用650 bp COⅠ标准条形码，扩增失败样本再以130 bp微型条形码进行二次检测。结果成功检出75%的样本信息，其中19%的样本标签与实物不符，如老虎鱼翅中鲶鱼成分的检出。此外澳大利亚学者Coghlan等[59]
曾应用高通量二代测序技术，以质粒trnL基因p-loop区和线粒体16S核糖体RNA基因为靶标，对包含散剂、药片/丸、胶囊等各种深加工状态制品的15 种海关进口动植物源性保健品进行检测，鉴别出54%的样本成分信息，并在羚羊角胶囊中鉴定出濒危动物赛加羚羊的成分，认为高通量二代测序技术应用于深度加工的药品成分检测十分有效，由此可推测将DNA条形码与二代测序结合或将成为有效可靠的保健品鉴定技术。
2.5 动物纺织皮革制品
动物皮革制品如手包、腰带、钱包、皮鞋、皮草等是人们的日常生活消费品之一。随着皮革制品行业高端奢侈品牌的不断涌现，皮革来源由牛、猪、蛇、兔等常见动物皮类逐渐向野猪、鳄鱼等高值稀有皮种发展，与此同时对各种名牌仿冒品、非法捕获的珍稀动物如短吻鳄、野猪和羚羊皮的鉴别工作也亟需展开。 在纺织皮革动物源性成分检测方面，Jun等[60]以线粒体cytb基因为靶标，设计特异性引物对查处没收的4 个非法贸易虎皮样本进行扩增测序，结果成功鉴定这4 个样本源性成分皆为犬类动物，其NCBI数据库比对结果与西藏犬相似度达99%～100%。但是应用DNA条形码技术的检测就不那么顺利了。美国的研究者们[61]基于DNA条形码技术以线粒体COⅠ基因为靶标设计通用引物，对来自美国自然历史博物馆采集的血液和组织样本，和美国鱼类和野生动物服务中心没收的非法皮包、腰带和皮鞋共25 个样本进行了检测，这25 个物种样本均为国际贸易中出现最多的野生哺乳和爬行类动物，结果均因DNA断裂程度过大而扩增失败。此后至今关于DNA条形码技术检测纺织皮革制品动物源性成分的报道仍鲜少见刊，因此总体来说，应用DNA条形码技术鉴定皮革制品源性成分仍较困难，但可尝试适应短片段靶序列的微型条形码技术。
2.6 动物标本
在标本的基原鉴定中，由于自身固有的珍稀性，在鉴定时其损耗性样品用量显得尤为重要；除此之外，对于年限较久外形难辨的样本，很难通过定向目标物种实现检测。DNA条形码技术基于稳定且来源广泛的DNA分子水平，只需微量样本即可对未知样品进行高通量扩增测序分析，结合近年来出现的微型条形码和焦磷酸测序技术，越来越成为合适的标本鉴定方法。
目前针对年限较久标本的检测，微型条形码技术已被公认为较合适的方法。2011年，Shokralla等[62]设计目标片段长度为100 bp的线粒体COⅠ微型条形码，结合焦磷酸测序技术，对135 个新采集的（≤4 年）和50 个年限已达53～97 年的共185 個鳞翅类昆虫标本进行检测鉴定。结果新采集样本和年限较久样本的PCR成功率分别为99.3%和96.4%，测序结果96.3%的样本与参考序列匹配度大于98%。此外Han等[63]发现，对于亲缘关系较近的古标本，采用该物种特异性引物扩增可能成功率更高。实验设计了4 对动物COⅠ通用性引物和315 条物种特异性引物，对从1959—1980年的45 个涉及36 种蝴蝶的干标本进行扩增检测，结果通用引物扩增皆失败，但物种特异性引物成功扩增出了所有样本，其产物为71～417 bp间的多个长度片段。研究表明，对近缘性标本的检测，可以综合考虑条形码通用引物及该物种特异性引物。
在标本鉴定中，焦磷酸测序技术、微型条形码以及物种特异性通用引物这3 种基于DNA条形码技术检测的调整方式皆可在其各自适当的应用范围内提高条形码检测的成功率，关键要区分样本的属性，合理选择。
3 结 语
在各种现代分子生物学检测技术中，DNA条形码被认为是一种强大、非定向、准确特异、低成本且适用广泛的方法，是物种鉴定的有效工具。相比于形态观察和理化分析方法，基于DNA序列的检测方法超脱于产品外观混淆不清和理化性质多变的影响，具有特异灵敏、高效快速的优点，而相比于实时荧光PCR、单核苷酸多态性单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）等DNA检测方法，DNA条形码技术的非定向、高通量检测优势也使其越来越成为一项适用性广泛的分子诊断技术。
目前DNA条形码技术除了在上述所列举海产品、中成药、肉及肉制品、标本等深加工动物制品源性成分鉴定中有了较为成熟的应用外，对更多其他深加工动物制品也同时具有前景和挑战，如动物源性饲料，添加了动物成分的化妆品对其源性成分的检测等。随着DNA条形码数据库的不断构建和发展，其为动物制品的质量控制和源性成分鉴别提供了新的应用方向。这种基于通用引物的检测方法不受样本物种数量以及定性信息的影响，非常适用于未知样品的大规模扩增测序鉴定，已经在食品真伪鉴别、法医鉴定、医学研究及生物多样性保护中得到广泛应用。
尽管目前国际上对于DNA条形码技术还存在很多争议，例如它不能区分样本的地理来源，不能准确鉴定杂交物种种属信息[64]，对种间亲缘关系的定位可能与N-J树矛盾[65]等，但DNA条形码技术从来都不是独立的，这些问题可以在其基础之上，通过并联或串联其他分子检测手段得到解决，例如复合条形码技术、微型条形码技术的出现就在一定程度上对加工食品DNA片段高度断裂、多个未知物种混合样品的问题开辟了新的解决办法，此外，实际检测中还可以尝试将DNA条形码技术与基因芯片、RFLP、时间温度梯度电泳（temporal temperature gradient gel electrophoresis，TTGE）等技术结合，以实现更简便快速地检测[66]。事实上，没有任何一项技术在分子水平上鉴定物种是完美的，但DNA条形码技术却仍有着不可替代的优越性：它是一个通用、非定向靶标的检测方法；有一个专业而强大且还在逐步扩充的条形码数据库作为对比分析，这也促进了DNA条形码技术在深加工动物制品、物种鉴定方面的更广泛的应用。总之，DNA条形码技术快速、高通量、稳定等特点为各类学术和商业研究工作拓宽了道路，其应用前景将十分广阔。
参考文献：
[1] HEBERT P D N， CYWINSKA A， BALl S L. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proceedings of the Royal Society of London B： Biological Sciences， 2003， 270： 313-321.
[2] LI D Z， GAO L M， LI H T， et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal spacer （ITS） should be incorporated into the core barcode for seed plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2011， 108（49）： 19641-19646. DOI：10.1073/pnas.1104551108. [3] TABERLET P， COISSAC E， POMPANON F， et al. Power and limitations of the chloroplast trnL（UAA） intron for plant DNA barcoding[J]. Nucleic Acids Research， 2007， 35（3）： e14. DOI：10.1093/nar/gkl938.
[4] CHEN S， YAO H， HAN J， et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J]. PloS One， 2010， 5（1）： e8613. DOI：10.1371/journal.pone.0008613.
[5] SEIFERT K A. Progress towards DNA barcoding of fungi[J]. Molecular Ecology Resources， 2009， 9（Suppl1）： 83-89. DOI：10.1111/j.1755-0998.2009.02635.x.
[6] CHE J， CHEN H M A N， YANG J U N X， et al. Universal COⅠ primers for DNA barcoding amphibians[J]. Molecular Ecology Resources， 2012， 12（2）： 247-258. DOI：10.1111/j.1755-0998.2011.03090.x.
[7] MURPHY R W， CRAWFORD A J， BAUER A M， et al. Cold code： the global initiative to DNA barcode amphibians and nonavianreptiles[J]. Molecular Ecology Resources， 2013， 13（2）： 161-167. DOI：10.1111/1755-0998.12050.
[8] STORK N E， MCBROOM J， GELY C， et al. New approaches narrow global species estimates for beetles， insects， and terrestrial arthropods[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2015， 112（24）： 7519-7523. DOI：10.1073/pnas.1502408112.
[9] VERSTEIRT V， NAGY Z T， ROELANTS P， et al. Identification of Belgian mosquito species （Diptera： Culicidae） by DNA barcoding[J]. Molecular Ecology Resources， 2015， 15（2）： 449-457. DOI：10.1111/1755-0998.12318.
[10] KO H L， WANG Y T， CHIU T S， et al. Evaluating the accuracy of morphological identification of larval fishes by applying DNA barcoding[J]. PLoS One， 2013， 8（1）： e53451. DOI：10.1371/journal.pone.0053451.
[11] HEBERT P D N， STOECKLE M Y， ZEMLAK T S， et al. Identification of birds through DNA barcodes[J]. PLoS Biology， 2004， 2（10）： e312.DOI：10.1371/journal.pbio.0020312.
[12] CROSS H B， LOWE A J， GURGEL C F D. DNA barcoding of invasive species[M]//RICHARDSON D M P P. Fifty years of invasion ecology-the legacy of Charles Elton， 2011： 289-299. DOI：10.1002/9781444329988.ch22.
[13] VARTAK V R， NARASIMMALU R， ANNAM P K， et al. DNA barcoding detected improper labelling and supersession of crab food served by restaurants in India[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2015， 95（2）： 359-366. DOI：10.1002/jsfa.6728.
[14] BELL K L， BURGESS K S， OKAMOTO K C， et al. Review and future prospects for DNA barcoding methods in forensic palynology[J]. Forensic Science International： Genetics， 2016， 21： 110-116. DOI：10.1016/j.fsigen.2015.12.010. [15] GONG W， LIU Y， CHEN J， et al. DNA barcodes identify Chinese medicinal plants and detect geographical patterns of Sinosenecio （Asteraceae）[J]. Journal of Systematics and Evolution， 2016， 54（1）： 83-91. DOI：10.1111/jse.12166.
[16] LI M， AU K Y， LAM H， et al. Identification of Baiying （Herba Solani Lyrati） commodity and its toxic substitute Xungufeng （Herba Aristolochiae Mollissimae） using DNA barcoding and chemical profiling techniques[J]. Food Chemistry， 2012， 135（3）： 1653-1658. DOI：10.1016/j.foodchem.2012.06.049.
[17] GALIMBERTI A， LABRA M， SANDIONIGI A， et al. DNA barcoding for minor crops and food traceability[J]. Advances in Agriculture， 2014. DOI：10.1155/2014/831875.
[18] SEMBIRING A， PERTIWI N P D， MAHARDINI A， et al. DNA barcoding reveals targeted fisheries for endangered sharks in Indonesia[J]. Fisheries Research， 2015， 164： 130-134. DOI：10.1016/j.fishres.2014.11.003.
[19] BAFEEL S O， ARIF I A， BAKIR M A， et al. DNA barcoding of arid wild plants using rbcL gene sequences[J]. Genetics and Molecular Research： GMR， 2012， 11： 1934-1941. DOI：10.4238/2012.July.19.12.
[20] TRIVEDI S， ALOUFI A A， ANSARI A A， et al. Role of DNA barcoding in marine biodiversity assessment and conservation： an update[J]. Saudi Journal of Biological Sciences， 2016， 23： 161-171. DOI：10.1016/j.sjbs.2015.01.001.
[21] FAZEKAS A J， KESANAKURTI P R， BURGESS K S， et al. Are plant species inherently harder to discriminate than animal species using DNA barcoding markers？[J]. Molecular Ecology Resources， 2009， 9（Suppl1）： 130-139. DOI：10.1111/j.1755-0998.2009.02652.x.
[22] 陳念， 赵树进， 韩丽萍. DNA条形码真菌鉴定技术[J]. 国际检验医学杂志， 2008， 29（8）： 703-704. DOI：10.3969/j.issn.1673-4130.2008.08.013.
[23] BAUER T， WELLER P， HAMMES W P， et al. The effect of processing parameters on DNA degradation in food[J]. European Food Research and Technology， 2003， 217（4）： 338-343. DOI：10.1007/s00217-003-0743-y.
[24] HELLBERG R S R， MORRISSEY M T. Advances in DNA-based techniques for the detection of seafood species substitution on the commercial market[J]. Journal of the Association for Laboratory Automation， 2011， 16（4）： 308-321. DOI：10.1016/j.jala.2010.07.004.
[25] GALIMBERTI A， de MATTIA F， LOSA A， et al. DNA barcoding as a new tool for food traceability[J]. Food Research International， 2013， 50（1）： 55-63. DOI：10.1016/j.foodres.2012.09.036.
[26] ASLAN O， HAMILL R M， SWEENEY T， et al. Integrity of nuclear genomic deoxyribonucleic acid in cooked meat： implications for food traceability[J]. Journal of Animal Science， 2009， 87（1）： 57-61. DOI：10.2527/jas.2008-0995. [27] COGHLAN M L， HAILE J， HOUSTON J， et al. Deep sequencing of plant and animal DNA contained within traditional Chinese medicines reveals legality issues and health safety concerns[J]. PLoS Genet， 2012， 8（4）： e1002657. DOI：10.1371/journal.pgen.1002657.
[28] 劉晓帆. 龟甲， 水蛭的品种与质量研究[D]. 北京： 北京中医药大学， 2013.
[29] 张红印， 陈俊， 贾静， 等. 中药材蜈蚣及其混伪品DNA条形码鉴别研究[J]. 中国中药杂志， 2014， 39（12）： 2208-2208. DOI：10.4268/cjcmm20141212.
[30] 崔丽娜， 杜鹤， 刘新成， 等. 基于COⅠ条形码序列的鹿茸及其混伪品的DNA分子鉴定[J]. 吉林中医药， 2012， 32（4）： 384-387.
[31] 贾静， 石林春， 徐志超， 等. 市售鹿茸粉药材的DNA条形码鉴定[J]. 药学学报， 2015， 50（10）： 1356-1361.
[32] KOOL A， de BOER H J， KR?GER ?， et al. Molecular identification of commercialized medicinal plants in Southern Morocco[J]. PloS One， 2012， 7（6）： e39459. DOI：10.1371/journal.pone.0039459.
[33] YAN D， LUO J Y， HAN Y M， et al. Forensic DNA barcoding and bio-response studies of animal horn products used in traditional medicine[J]. PloS One， 2013， 8（2）： e55854. DOI：10.1371/journal.pone.0055854.
[34] 张龙霏. 基于 DNA 条形码的中成药中动物药材的检定[D]. 济南： 山东中医药大学， 2014.
[35] 程新玮， 赵焕新， 宁康， 等. DNA 条形码技术在中药质量评价中的研究进展[J]. 食品与药品， 2013， 15（4）： 295-299. DOI：10.3969/j.issn.1672-979X.2013.04.030.
[36] MITCHELL A， KEENA M A， GOPURENKO D， et al. Towards a global barcode library for Lymantria （Lepidoptera： Lymantriinae） tussock moths of biosecurity concern[J]. PLoS One， 2010， 5（12）： e14280. DOI：10.1371/journal.pone.0014280.
[37] ARMANI A， GUARDONE L， CASTIGLIEGO L， et al. DNA and Mini-DNA barcoding for the identification of Porgies species （family Sparidae） of commercial interest on the international market[J]. Food Control， 2015， 50： 589-596. DOI：10.1016/j.foodcont.2014.09.025.
[38] BARBUTO M， GALIMBERTI A， FERRI E， et al. DNA barcoding reveals fraudulent substitutions in shark seafood products： the Italian case of “palombo”（Mustelus spp.）[J]. Food Research International， 2010， 43（1）： 376-381. DOI：10.1016/j.foodres.2009.10.009.
[39] KANNUCHAMY N， PAVAN-KUMAR A， GUDIPATI V， et al.
Mislabeling in Indian seafood： an investigation using DNA barcoding[J]. Food Control， 2016， 59： 196-200. DOI：10.1016/j.foodcont.2015.05.018.
[40] CARVALHO D C， PALHARES R M， DRUMMOND M G， et al. DNA barcoding identification of commercialized seafood in South Brazil： a governmental regulatory forensic program[J]. Food Control， 2015， 50： 784-788. DOI：10.1016/j.foodcont.2014.10.025.
[41] CHIN T C， ADIBAH A B， HARIZ Z A D， et al. Detection of mislabelled seafood products in Malaysia by DNA barcoding： improving transparency in food market[J]. Food Control， 2016， 64： 247-256. DOI：10.1016/j.foodcont.2015.11.042. [42] ARMANI A， GUARDONE L， la CASTELLANA R， et al. DNA barcoding reveals commercial and health issues in ethnic seafood sold on the Italian market[J]. Food Control， 2015， 55： 206-214. DOI：10.1016/j.foodcont.2015.02.030.
[43] MIKKELSEN P M， BIELER R， KAPPNER I， et al. Phylogeny of Veneroidea （Mollusca： Bivalvia） based on morphology and molecules[J]. Zoological Journal of the Linnean Society， 2006， 148（3）： 439-521. DOI：10.1111/j.1096-3642.2006.00262.x.
[44] HANDY S M， DEEDS J R， IVANOVA N V， et al. A single-laboratory validated method for the generation of DNA barcodes for the identification of fish for regulatory compliance[J]. Journal of AOAC International， 2011， 94（1）： 201-210.
[45] SMITH P J， MCVEAGH S M， STEINKE D. DNA barcoding for the identification of smoked fish products[J]. Journal of Fish Biology， 2008， 72（2）： 464-471. DOI：10.1119/1.18980.
[46] 李新光， 王璐， 趙峰， 等. DNA 条形码技术在鱼肉及其制品鉴别中的应用[J]. 食品科学， 2013， 34（18）： 337-342. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201318069.
[47] IVANOVA N V， ZEMLAK T S， HANNER R H， et al. Universal primer cocktails for fish DNA barcoding[J]. Molecular Ecology Notes， 2007， 7（4）： 544-548. DOI：10.1111/j.1471-8286.2007.01748.x.
[48] 柳淑芳， 陈亮亮， 戴芳群， 等. 基于线粒体COⅠ基因的DNA条形码在石首鱼科（Sciaenidae）鱼类系统分类中的应用[J]. 海洋与湖沼， 2010， 41（2）： 223-232. DOI：10.11693/hyhz201002010010.
[49] LUO A， ZHANG A， HO S Y， et al. Potential efficacy of mitochondrial genes for animal DNA barcoding： a case study using eutherian mammals[J]. BMC Genomics， 2011， 12（1）： 1-13.
[50] 高玉时， 屠云洁， 童海兵， 等. 6 个地方鸡种线粒体COⅠ基因的DNA条形码[J]. 农业生物技术学报， 2007， 15（6）： 924-930.
[51] 徐向明. 我国3 个地方品种鸭线粒体DNA COⅠ基因的DNA条形码初步分析[J]. 畜牧与兽医， 2008， 40（11）： 51-53.
[52] CAI Y S， ZHANG L， SHEN F J， et al. DNA barcoding of 18 species of Bovidae[J]. Chinese Science Bulletin ， 2011， 56（2）： 164-168.
[53] FRANCIS C M， BORISENKO A V， IVANOVA N V， et al. The role of DNA barcodes in understanding and conservation of mammal diversity in Southeast Asia[J]. PLoS One， 2010， 5（9）： e12575-e12575.
[54] QUINTO C A， TINOCO R， HELLBERG R S. DNA barcoding reveals mislabeling of game meat species on the US commercial market[J]. Food Control， 2016， 59： 386-392.
[55] KANE D E， HELLBERG R S. Identification of species in ground meat products sold on the US commercial market using DNA-based methods[J]. Food Control， 2016， 59： 158-163.
[56] D’AMATO M E， ALECHINE E， CLOETE K W， et al. Where is the game？ Wild meat products authentication in South Africa： a case study[J]. Investigative genetics， 2013， 4（1）： 1-13. [57] WALLACE L J. DNA barcoding effective in authenticating natural health products[EB/OL]. （2012-09-20）[2016-12-25]. http：//www.news-medical.net/news/20120920/DNA-barcoding-effective-in-authenticating-natural-health-products.aspx
[58] WALLACE L J， BOILARD S M A L， EAGLE S H C， et al. DNA barcodes for everyday life： routine authentication of natural health products[J]. Food Research International， 2012， 49（1）： 446-452. DOI：10.1016/j.foodres.2012.07.048.
[59] COGHLAN M L， HAILE J， HOUSTON J， et al. Deep sequencing of plant and animal DNA contained within traditional Chinese medicines reveals legality issues and health safety concerns[J]. PLoS Genet， 2012， 8（4）： e1002657.
[60] JUN J， HAN S H， JEONG T J， et al. Wildlife forensics using mitochondrial DNA sequences： species identification based on hairs collected in the field and confiscated tanned Felidae leathers[J]. Genes and Genomics， 2011， 33（6）： 721-726. DOI：10.1007/s13258-011-0080-7.
[61] ALLEN U. “DNA Barcodes” help monitor illegal trade of wildlife products[EB/OL]. （2009-09-17）[2016-12-25]. http：//www.cabi.org/vetmedresource/news/19902.
[62] SHOKRALLA S， ZHOU X， JANZEN D H， et al. Pyrosequencing for mini-barcoding of fresh and old museum specimens[J]. PLoS One， 2011， 6（7）： 3007-3024. DOI：10.1371/journal.pone.0021252.
[63] HAN T， LEE W， LEE Y， et al. Barcoding old Korean lepidopteran specimens using newly designed specific primer pairs[J]. Journal of Asia-Pacific Entomology， 2014， 17（4）： 679-684. DOI：10.1016/j.aspen.2014.06.007.
[64] CLARK L F. The current status of DNA barcoding technology for species identification in fish value chains[J]. Food Policy， 2015， 54： 85-94. DOI：10.1016/j.foodpol.2015.05.005.
[65] COLLINS R A， CRUICKSHANK R H. The seven deadly sins of DNA barcoding[J]. Molecular Ecology Resources， 2013， 13（6）： 969-975. DOI：10.1111/1755-0998.12046.
[66] 邱德義， 胡佳， 刘德星， 等. DNA条形码技术在肉品防欺诈鉴别中的应用[J]. 肉类研究， 2013， 27（4）： 40-43.