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【摘要】 目的 研究瘦素对脂变肝细胞甘油三酯含量、脂滴形成和脂蛋白脂酶基因表达的影响。方法 以离体人肝L-02细胞株为研究对象。用含10%医用脂肪乳注射液和10%胎牛血清的RPMI-1640的完全培养基孵育人肝L-02细胞24小时,制备肝细胞脂肪变性模型。实验分为正常肝细胞组(A组)、脂变肝细胞模型组(B组)、瘦素组(10-7mol/L)、阳性对照组(C组)(即脂变肝细胞加入吉非罗齐,使其终浓度为1000mg/L);孵育24小时后,油红O染色观察细胞形态和细胞内脂滴的形成情况,高效液相色谱法检测细胞内甘油三酯的含量,半定量RT-PCR法检测LPL mRNA 水平的表达。实验数据以x±s表示,用SPSS11.0统计软件对数据进行分析,以P<0.05作为差异显著性标准。结果 用脂肪乳注射液孵育人肝L-02细胞24小时后,经油红O染色后倒置显微镜观察,人肝L-02细胞浆内见大量红色的小泡性脂滴;高效液相色谱法检测示细胞内甘油三酯含量明显增高,成功的制备肝细胞脂肪变性模型。加入瘦素(10-7mol/L,)孵育24小时后,油红O染色示胞浆内脂滴与模型组比较明显减低;高效液相色谱法结果发现瘦素能降低细胞内甘油三酯含量;半定量RT-PCR法检测各组细胞的LPL mRNA水平,结果显示:瘦素处理组与模型组相比,LPLmRNA表达明显上升,有统计学意义(P<0.05)。结论 1. 予以干预脂变肝细胞,瘦素能降低人L-02脂变肝细胞内甘油三酯的含量;2. 瘦素能促进、LPLmRNA的表达增强。
【关键词】 瘦素;人肝L-02细胞;甘油三酯;脂蛋白脂酶
【中图分类号】R329.2+8 【文献标识码】 B 【文章编号】1005-0515(2010)007-022-04
Effects of Leptin on the expression of lipoprotein lipase in human L-02 hepatocyte
ABSTRACT
Objects: To observe the effects of leptin on triglyceride levels , the formation of lipid droplets and the expresion of lipoprotein lipase(LPL)mRNA in human L-02 steatosis hepatocyte. Methods: To establish a model of hepatocyte steatosis, we incubate the normal human L-02 hepatocyte in RPMI-1640 complete medium with 10% fetal bovine serum plus 10% medical fat emulsion injection for 24 hours. The experiment is divided into 7 groups: The first group is normal hepatocytes(A group); the second group is fatty change hepatocytes(B group); the third group(C group) is added leptin to the fatty changed hepatocytes to make the concentration to be 10-7mol/L. Group 4 is the positive control group(D group), i.e Gemifibrozil is added to the hepatocyte with fatty change to make the concentration to be 1000 mg/L. Incubate these human L-02 hepatocyte for another 24 hours. And observe the formation of cellular morphology and lipid droplets in the cells under oil red O stain and determin the intracellular triglyceride levels through high performance liquid chromatography (HPLC). The semiquantitative RT-PCR was used to detect the mRNA levels of LPL each group. All the data was analyzed by SPSS11.0 statistical software, P value of <0.05 is considered significantly important.Results: After incubate in fat emulsion injection for 24 hours,Inverted microscope find out numerous lipid droplets in the cytolymph of the cells ,which can be dyed to red with oil red O dye, and intracellular TG levels were found out to be increase dramatically through measurement of HPLC. Thus the model of steatosis hepatocytes was established successfully. After exposed to leptin(10-7mol/L ) for 24 hours, by oil red O stain the intracellular lipid droplets of steatosis hepatocytes were much less than the model group, the intracellular TG levels decreased remarkablely by measurement of HPLC. The semi quantitative RT-PCR to detect the mRNA levels of LPL each group, genes expression was found out to be much higher in the group treated with leptin than in the model group,these have statistical significance(P<0.05).
Conclusions:1 Leptin can decrease the quantity of intracellular triglyceride in steatosis hepatocyte with a time and dose dependent manner.2The treatment of leptin could promote the mRNA expression of LPL.
Keywords: Leptin, Human L-02 hepatocyte, TG, LPL,
脂蛋白脂酶 (lipoprotein lipase(LPL))活性或量的改变功能的失衡,不仅产生血脂紊乱(高甘油三酯血症、低HDL血症)与代谢综合征血脂异常有一致的表现,而且与代谢综合征、胰岛素抵抗及代谢失调众多表现如中心性肥胖、血糖调节失调、高血压、脂肪肝等密切相连。
本研究以离体人肝L-02细胞为研究对象,用游离脂肪酸制备肝细胞脂肪变性模型,用重组人瘦素作为处理因素,通过油红O染色观察细胞形态和细胞内脂滴的形成情况,高效液相色谱法检测细胞内甘油三酯的含量,半定量RT-PCR法检测脂蛋白脂酶的mRNA表达,初步探讨瘦素对脂肪肝甘油三酯的含量及脂蛋白脂肪酶基因表达的影响,为脂肪肝防治提供依据。
材料与方法
1 实验材料
人肝L-02细胞株购自武汉大学典型物保藏中心。本实验所用细胞株为第10—13代。医用脂肪乳注射液 ,华瑞制药有限公司。重组人瘦素,美国Sigma公司。吉非罗齐,意大利Sigma-TauS.P.A公司。即用PCR扩增试剂盒 ,上海生物工程公司。LPL和GAPDH引物,上海生物工程公司。
2 实验方法
2.1 细胞培养、冻存、复苏
2.1.1细胞培养:人肝L-02细胞在含体积分数10%的灭活胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中,置37℃、体积分数5% CO2、饱和湿度的孵箱内培养。用培养液调细胞密度至1×106个/ml,24小时后换入含0.1%胎牛血清的1640培养液中,使细胞静止24小时后,再做相应的处理。
2.1.2细胞冻存:取对数生长期的细胞,收集前24小时换液一次。用0.25%的胰蛋白酶与室温消化细胞,待细胞收缩、部分脱壁时加入含10%胎牛血清的RPMI-1640终止,收集细胞悬液,离心(1000rpm,5min),弃上清,细胞沉淀物中加入冻存培养液(10%DMSO的胎牛血清培养基),冻存液中细胞最终密度为5×106/ml,分装于冻存管中。将冻存液直立放置于塑料盒中周围固定,放入4℃冰箱30分钟,再放入-20℃冰箱,经过2h以后,再转入-80℃冰箱,过夜后取出冻存管移入液氮容器中。
2.1.3 细胞复苏:将含冻存细胞的冻存管迅速置于37℃温水中,并不时搅动令其尽快融化,约一分钟后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球檫拭冻存管外壁拿入超镜台内,用吸管吸出细胞悬液,注入离心管并加入10ml培养液,混合后1000 rpm,离心5分钟,除去上清液,再重复用培养液洗涤一次。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞,台盼蓝染色计数,成活率为90%以上。次日观察,换液一次,继续培养。
2.2 肝细胞脂肪变性模型的制备
人肝L-02细胞达1×106个/ml时用完全培养基重新悬浮,并以1:3的比例传代,取对数生长期细胞,更换新鲜培养液后,用含体积分数10%医用脂肪乳注射液和10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基孵育人肝L-02细胞24小时,出现细胞内脂滴或泡沫样物沉积,则制成肝细胞脂肪变性模型。将所得细胞改置于含0.1%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,使其静止24小时后,再做相应的处理。
2.3 实验分组(表1)
2.4油红O染色
采用Lillie氏油红O染色法:将细胞培养于预先放有无菌盖玻片的6孔培养板,处理结束后,用PBS冲洗盖玻片3次,每次5分钟,50%异丙醇固定1分钟,油红O染色液染色10分钟,蒸馏水冲洗3次,每次1分钟,苏木素染色5分钟,蒸馏水冲洗3次,0.1%盐酸分色2秒后蒸馏水冲洗,氨水浸泡返蓝,明胶封片,HPIAS-1000型图像分析系统收集图像。
2.5 HPLC测量细胞内甘油三酯含量
2.5.1标准溶液和内标溶液的配置 精密量取色标纯甘油适量,20%的异丙醇-水溶液稀释,制备浓度为0.565,1.129,2.259,3.388,4.517 mmol/L的标准溶液(相当于50-400mg/dL的三油酸甘油酯),用于总甘油测定; 制备浓度为0.0565,0.1129, 0.2259, 0.3388, 0.4517 mmol/L的标准溶液(相当于5-40mg/dL的三油酸甘油酯), 用于游离甘油测定。称取色标纯1,2-丙二醇适量,用水稀释成0.25 mmol/L的内标液用于细胞内总甘油和游离甘油测定。
2.5.2细胞内甘油三酯的测定 参照文献[5,6]方法,待细胞处理结束后,弃去培养基,PBS洗3遍,收集细胞后,冰浴中超声破碎细胞。采用C-18柱,柱温4℃,流速1ml/min, 230nm 紫外光检测,以峰面积定量,内标校准,计算细胞内游离甘油三酯与总甘油三酯的比值,以mmol/g细胞蛋白为单位。
2.6 RT-PCR检测细胞中脂蛋白脂酶mRNA水平
2.6.1 总RNA提取 处理因素作用后,吸弃50mL培养瓶中上清液,用PBS洗涤每组细胞各3次。每瓶加入1ml Trizol,待细胞溶解后,移入1%DEPC处理过的1.5ml EP管中。避光加入氯仿200μL,振荡混匀,室温下静置5分钟。4℃12000转/分离心10分钟。可见EP管中液体分为三层:无色的水相,中间层和红色的有机相,RNA主要在水相(上层)。 吸取上层水相转移至另一离心管中。 加入异丙醇500μL振荡混匀,常温下静置15分钟。 4℃ 12000转/分,离心10分钟。离心后可见RNA的白色粉末样物贴于管底管壁。 去上清,加入75%冰乙醇1ml,充分洗涤沉淀,振荡摇匀。 4℃ 5000转/分,离心5分钟去上清,置EP管于通风厨中干燥RNA 10分钟。 将沉淀溶于20μL DEPC水。分装,-86℃保存备用。
2.6.2总RNA定量 取2μL总RNA样本,在1%琼脂糖凝胶(含0.5%ng/mlEB)上进行电泳,电泳缓冲液为0.5×TBE,电压为5V/cm,电泳时间为15分钟。电泳后在紫外透射仪上观察,如果RNA无降解,可见28S,18S和5S三条清晰的橘黄色带,28S与18S的亮度之比约为2:1。取无明显降解的总RNA样本1μL, 稀释1000倍,在紫外分光光度计上测定其OD260nm值和OD280nm值,两者比值约为2.0,按1 OD260nm相当于1ug/μLRNA计算RNA样本的含量。
2.6.3 合成cDNA 逆转录合成采用Biometra PCR扩增仪。细胞总RNA反应量均取1ug,再加入Oligo(dT) primer 1μL于Eppendorf管中,加入DEPC-H2O使其总体积为12μL,小心混匀后离心5秒,70℃水浴5分钟,冰浴30秒,离心5秒,再加入4μL 5×Reaction Buffer、1μL RNase Inhibitor、 2μLdNTP Mix, 小心混匀后离心5秒,37℃水浴5分钟,加入1μL M-MμLV Reverse Transcriptase,终体积20 μL。37℃水浴60分钟,70℃加热10分钟,即得逆转录产物(cDNA)。分装,-20℃保存。
2.6.4 PCR以l μg逆转录产物(cDNA)为模板。通过半定量RT—PCR.以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照,进行半定量RT-PCR反应,分别检测各组脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase ,LPL)的mRNA水平的表达。脂蛋白脂肪酶(LPL) 、内参照GAPDH引物见表2 。LPL扩增条件:94 ℃变性1 min、49 ℃退火1 min、72 ℃延伸1min ,共30 次循环,继续72 ℃延伸10 min。内参照GAPDH 扩增条件:94 ℃变性1 min、56 ℃退火1 min、72 ℃延伸1min ,共30 次循环,继续72 ℃延伸10 min。取PCR产物经2 %琼脂糖凝胶(含溴化乙锭1μgPL) 电泳,紫外灯下凝胶成像分析系统记录结果,待测基因mRNA 相对表达量以其扩增带吸光度值与相应内参照扩增带吸光度值的比值表示。
表2 引物序列
2.7 统计学处理:
计量资料均以 ±s表示,先进行方差齐性检验,如具有方差齐性,采用方差分析,多个样本均数间的两两比较采用SNK-q检验;方差不齐则采用秩和检验。所有数据均采用SPSS12.0 for windows统计软件进行分析,以P<0.05为有统计学意义。
实验结果
1 油红O染色:
正常组肝细胞油红O染色后,光镜下观察:肝细胞形态正常,为多边形,胞核蓝染,胞膜界限清楚,胞浆内未见脂滴。模型组肝细胞系用含体积分数10%医用脂肪乳注射液和10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基孵育人肝L-02细胞24小时,油红O染色显示胞浆内见大量红色的小泡性脂滴,肝细胞肿大,细胞核位于细胞中央,符合肝细胞小泡性脂肪变性特征(见图1,2)。高效液相测定细胞内甘油三酯含量,正常组与模型组比较,细胞内甘油三酯含量由0.417±0.045mmol/g蛋白上升至1.612±0.104mmol/g蛋白,明显增高,差别有统计学意义(p<0.01)。瘦素处理组及阳性对照组细胞浆内仅少量红色的小泡性脂滴(见图3,4)。
2 瘦素处理细胞内甘油三酯含量的变化
瘦素(10-7mol/ L)分别加入正常肝细胞组及模型组中,处理24小时后高效液相色谱分析结果发现:瘦素处理组及阳性对照组细胞内甘油三酯含量分别为,0.648±0.023mmol/g蛋白,0.865±0.143mmol/g蛋白,与模型组比较明显降低,差别有统计学意义(p<0.05)(见表3)。
3.瘦素对肝细胞LPL mRNA表达的影响
为进一步研究瘦素降低细胞内甘油三酯与LPL mRNA水平上表达的关系。我们采用了半定量RT-PCR法检测了人肝L-02细胞的LPL mRNA水平。结果显示,经瘦素处理后,较模型组相比,LPL mRNA表达明显上升,有统计学意义。(见图5, P<0.05)
讨论
脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase(LPL))分布于全身多种组织 ,而以脂肪和肌肉组织中的活性最高。脂蛋白脂酶在肌肉和脂肪组织的细胞中合成后 ,经过一系列的细胞内加工 ,如折叠、活化和糖化 ,再分泌出胞。经浓度梯度的转运 ,胞外的脂蛋白脂酶在血管内皮的表面与粘多糖类物质结合 ,在血管的内腔面与血浆中的底物直接接触 ,迅速分解乳糜微粒和VLDL中的甘油三酯 ,使得生成的脂肪酸进入细胞内参与能量代谢 (肌肉中 )或重新合成甘油三酯储存起来 (脂肪中 )。脂蛋白脂酶活性的降低,可引起高脂血症,主要为甘油三酯[1,2,3]。脂蛋白脂酶缺乏的人和鼠均表现出HDL水平的显著降低。已有研究发现LPL基因内含子3C→T突变引起高甘油三酯血症,研究者认为该突变是日本人群高甘油三酯血症的主要遗传因素[4]。
动物模型发现脂蛋白脂酶 (lipoprotein lipase(LPL))活性的降低与脂肪肝有关[5,6]。倪燕君等探讨肝脂酶(HL)和脂蛋白脂肪酶(LPL)在脂肪肝发病中的作用,结果发现,脂肪肝组与正常对照组及其他各组肝病相比,血脂明显升高,主要表现为血甘油三酯升高,肝素后血浆中HL、LPL活性显著降低,脂肪肝组患者肝组织中LPL活性亦明显降低[7]。本研究中我们以离体人肝L-02细胞株为研究对象。用含10%医用脂肪乳注射液和10%胎牛血清制备肝细胞脂肪变性模型,研究瘦素对脂变肝细胞甘油三酯含量、脂滴形成和脂蛋白脂酶基因表达的影响。结果发现,瘦素处理组与模型组相比,LPLmRNA表达明显上升,有统计学意义(P<0.05)。结果提示,瘦素可以通过影响脂蛋白脂酶活性改善脂肪变性肝细胞甘油三酯代谢。
参考文献
1.Goldberg IJ. Association of plasma lipoprotein with postheparin lipas activities. J Clin Invest, 1986,78:1523-1528.
2 郭朝阳,隋少玉,郭朝晖.脂蛋白脂酶活性与老年2型糖尿病关系的研究.中国老年病杂志,2004,24(6):510-511.
3 Nakamura T, Suehiro T,Yasuoka N,et al. A novel nonsense mutation in exon 1and a transition in 3 of the Lipoprotein lipase gene.J Atherocler Tromb,1996,3(1):17-24.
4 杨天宇,葛林,赵郁,等.脂蛋白脂酶内含子3C→T突变. 中国动脉硬化杂志,2003,11(6):570-572.
5.Reue K, Doolittle MH. Naturally occuring mutations in mice affecting lipid transport and metabolism. J Lipid Res, 1996,37:1387-1405.
6. Benhizia F, Hainault I, Serougne C, et al. Effects of a fish oil-larddiet on rat plasma lipoproteins, liver FAS, and lipolytic enzymes.Am J Physiol, 1994,267(6 pt 1):975-982.
7.倪燕君刘厚钰张顺财韩琴琴赵振泽徐俊华。肝脂酶、脂蛋白脂肪酶在脂肪肝发病中的作用。中华消化杂志 1999,19(5)324-326
(责任审校:李林)
【关键词】 瘦素;人肝L-02细胞;甘油三酯;脂蛋白脂酶
【中图分类号】R329.2+8 【文献标识码】 B 【文章编号】1005-0515(2010)007-022-04
Effects of Leptin on the expression of lipoprotein lipase in human L-02 hepatocyte
ABSTRACT
Objects: To observe the effects of leptin on triglyceride levels , the formation of lipid droplets and the expresion of lipoprotein lipase(LPL)mRNA in human L-02 steatosis hepatocyte. Methods: To establish a model of hepatocyte steatosis, we incubate the normal human L-02 hepatocyte in RPMI-1640 complete medium with 10% fetal bovine serum plus 10% medical fat emulsion injection for 24 hours. The experiment is divided into 7 groups: The first group is normal hepatocytes(A group); the second group is fatty change hepatocytes(B group); the third group(C group) is added leptin to the fatty changed hepatocytes to make the concentration to be 10-7mol/L. Group 4 is the positive control group(D group), i.e Gemifibrozil is added to the hepatocyte with fatty change to make the concentration to be 1000 mg/L. Incubate these human L-02 hepatocyte for another 24 hours. And observe the formation of cellular morphology and lipid droplets in the cells under oil red O stain and determin the intracellular triglyceride levels through high performance liquid chromatography (HPLC). The semiquantitative RT-PCR was used to detect the mRNA levels of LPL each group. All the data was analyzed by SPSS11.0 statistical software, P value of <0.05 is considered significantly important.Results: After incubate in fat emulsion injection for 24 hours,Inverted microscope find out numerous lipid droplets in the cytolymph of the cells ,which can be dyed to red with oil red O dye, and intracellular TG levels were found out to be increase dramatically through measurement of HPLC. Thus the model of steatosis hepatocytes was established successfully. After exposed to leptin(10-7mol/L ) for 24 hours, by oil red O stain the intracellular lipid droplets of steatosis hepatocytes were much less than the model group, the intracellular TG levels decreased remarkablely by measurement of HPLC. The semi quantitative RT-PCR to detect the mRNA levels of LPL each group, genes expression was found out to be much higher in the group treated with leptin than in the model group,these have statistical significance(P<0.05).
Conclusions:1 Leptin can decrease the quantity of intracellular triglyceride in steatosis hepatocyte with a time and dose dependent manner.2The treatment of leptin could promote the mRNA expression of LPL.
Keywords: Leptin, Human L-02 hepatocyte, TG, LPL,
脂蛋白脂酶 (lipoprotein lipase(LPL))活性或量的改变功能的失衡,不仅产生血脂紊乱(高甘油三酯血症、低HDL血症)与代谢综合征血脂异常有一致的表现,而且与代谢综合征、胰岛素抵抗及代谢失调众多表现如中心性肥胖、血糖调节失调、高血压、脂肪肝等密切相连。
本研究以离体人肝L-02细胞为研究对象,用游离脂肪酸制备肝细胞脂肪变性模型,用重组人瘦素作为处理因素,通过油红O染色观察细胞形态和细胞内脂滴的形成情况,高效液相色谱法检测细胞内甘油三酯的含量,半定量RT-PCR法检测脂蛋白脂酶的mRNA表达,初步探讨瘦素对脂肪肝甘油三酯的含量及脂蛋白脂肪酶基因表达的影响,为脂肪肝防治提供依据。
材料与方法
1 实验材料
人肝L-02细胞株购自武汉大学典型物保藏中心。本实验所用细胞株为第10—13代。医用脂肪乳注射液 ,华瑞制药有限公司。重组人瘦素,美国Sigma公司。吉非罗齐,意大利Sigma-TauS.P.A公司。即用PCR扩增试剂盒 ,上海生物工程公司。LPL和GAPDH引物,上海生物工程公司。
2 实验方法
2.1 细胞培养、冻存、复苏
2.1.1细胞培养:人肝L-02细胞在含体积分数10%的灭活胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中,置37℃、体积分数5% CO2、饱和湿度的孵箱内培养。用培养液调细胞密度至1×106个/ml,24小时后换入含0.1%胎牛血清的1640培养液中,使细胞静止24小时后,再做相应的处理。
2.1.2细胞冻存:取对数生长期的细胞,收集前24小时换液一次。用0.25%的胰蛋白酶与室温消化细胞,待细胞收缩、部分脱壁时加入含10%胎牛血清的RPMI-1640终止,收集细胞悬液,离心(1000rpm,5min),弃上清,细胞沉淀物中加入冻存培养液(10%DMSO的胎牛血清培养基),冻存液中细胞最终密度为5×106/ml,分装于冻存管中。将冻存液直立放置于塑料盒中周围固定,放入4℃冰箱30分钟,再放入-20℃冰箱,经过2h以后,再转入-80℃冰箱,过夜后取出冻存管移入液氮容器中。
2.1.3 细胞复苏:将含冻存细胞的冻存管迅速置于37℃温水中,并不时搅动令其尽快融化,约一分钟后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球檫拭冻存管外壁拿入超镜台内,用吸管吸出细胞悬液,注入离心管并加入10ml培养液,混合后1000 rpm,离心5分钟,除去上清液,再重复用培养液洗涤一次。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞,台盼蓝染色计数,成活率为90%以上。次日观察,换液一次,继续培养。
2.2 肝细胞脂肪变性模型的制备
人肝L-02细胞达1×106个/ml时用完全培养基重新悬浮,并以1:3的比例传代,取对数生长期细胞,更换新鲜培养液后,用含体积分数10%医用脂肪乳注射液和10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基孵育人肝L-02细胞24小时,出现细胞内脂滴或泡沫样物沉积,则制成肝细胞脂肪变性模型。将所得细胞改置于含0.1%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,使其静止24小时后,再做相应的处理。
2.3 实验分组(表1)
2.4油红O染色
采用Lillie氏油红O染色法:将细胞培养于预先放有无菌盖玻片的6孔培养板,处理结束后,用PBS冲洗盖玻片3次,每次5分钟,50%异丙醇固定1分钟,油红O染色液染色10分钟,蒸馏水冲洗3次,每次1分钟,苏木素染色5分钟,蒸馏水冲洗3次,0.1%盐酸分色2秒后蒸馏水冲洗,氨水浸泡返蓝,明胶封片,HPIAS-1000型图像分析系统收集图像。
2.5 HPLC测量细胞内甘油三酯含量
2.5.1标准溶液和内标溶液的配置 精密量取色标纯甘油适量,20%的异丙醇-水溶液稀释,制备浓度为0.565,1.129,2.259,3.388,4.517 mmol/L的标准溶液(相当于50-400mg/dL的三油酸甘油酯),用于总甘油测定; 制备浓度为0.0565,0.1129, 0.2259, 0.3388, 0.4517 mmol/L的标准溶液(相当于5-40mg/dL的三油酸甘油酯), 用于游离甘油测定。称取色标纯1,2-丙二醇适量,用水稀释成0.25 mmol/L的内标液用于细胞内总甘油和游离甘油测定。
2.5.2细胞内甘油三酯的测定 参照文献[5,6]方法,待细胞处理结束后,弃去培养基,PBS洗3遍,收集细胞后,冰浴中超声破碎细胞。采用C-18柱,柱温4℃,流速1ml/min, 230nm 紫外光检测,以峰面积定量,内标校准,计算细胞内游离甘油三酯与总甘油三酯的比值,以mmol/g细胞蛋白为单位。
2.6 RT-PCR检测细胞中脂蛋白脂酶mRNA水平
2.6.1 总RNA提取 处理因素作用后,吸弃50mL培养瓶中上清液,用PBS洗涤每组细胞各3次。每瓶加入1ml Trizol,待细胞溶解后,移入1%DEPC处理过的1.5ml EP管中。避光加入氯仿200μL,振荡混匀,室温下静置5分钟。4℃12000转/分离心10分钟。可见EP管中液体分为三层:无色的水相,中间层和红色的有机相,RNA主要在水相(上层)。 吸取上层水相转移至另一离心管中。 加入异丙醇500μL振荡混匀,常温下静置15分钟。 4℃ 12000转/分,离心10分钟。离心后可见RNA的白色粉末样物贴于管底管壁。 去上清,加入75%冰乙醇1ml,充分洗涤沉淀,振荡摇匀。 4℃ 5000转/分,离心5分钟去上清,置EP管于通风厨中干燥RNA 10分钟。 将沉淀溶于20μL DEPC水。分装,-86℃保存备用。
2.6.2总RNA定量 取2μL总RNA样本,在1%琼脂糖凝胶(含0.5%ng/mlEB)上进行电泳,电泳缓冲液为0.5×TBE,电压为5V/cm,电泳时间为15分钟。电泳后在紫外透射仪上观察,如果RNA无降解,可见28S,18S和5S三条清晰的橘黄色带,28S与18S的亮度之比约为2:1。取无明显降解的总RNA样本1μL, 稀释1000倍,在紫外分光光度计上测定其OD260nm值和OD280nm值,两者比值约为2.0,按1 OD260nm相当于1ug/μLRNA计算RNA样本的含量。
2.6.3 合成cDNA 逆转录合成采用Biometra PCR扩增仪。细胞总RNA反应量均取1ug,再加入Oligo(dT) primer 1μL于Eppendorf管中,加入DEPC-H2O使其总体积为12μL,小心混匀后离心5秒,70℃水浴5分钟,冰浴30秒,离心5秒,再加入4μL 5×Reaction Buffer、1μL RNase Inhibitor、 2μLdNTP Mix, 小心混匀后离心5秒,37℃水浴5分钟,加入1μL M-MμLV Reverse Transcriptase,终体积20 μL。37℃水浴60分钟,70℃加热10分钟,即得逆转录产物(cDNA)。分装,-20℃保存。
2.6.4 PCR以l μg逆转录产物(cDNA)为模板。通过半定量RT—PCR.以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照,进行半定量RT-PCR反应,分别检测各组脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase ,LPL)的mRNA水平的表达。脂蛋白脂肪酶(LPL) 、内参照GAPDH引物见表2 。LPL扩增条件:94 ℃变性1 min、49 ℃退火1 min、72 ℃延伸1min ,共30 次循环,继续72 ℃延伸10 min。内参照GAPDH 扩增条件:94 ℃变性1 min、56 ℃退火1 min、72 ℃延伸1min ,共30 次循环,继续72 ℃延伸10 min。取PCR产物经2 %琼脂糖凝胶(含溴化乙锭1μgPL) 电泳,紫外灯下凝胶成像分析系统记录结果,待测基因mRNA 相对表达量以其扩增带吸光度值与相应内参照扩增带吸光度值的比值表示。
表2 引物序列
2.7 统计学处理:
计量资料均以 ±s表示,先进行方差齐性检验,如具有方差齐性,采用方差分析,多个样本均数间的两两比较采用SNK-q检验;方差不齐则采用秩和检验。所有数据均采用SPSS12.0 for windows统计软件进行分析,以P<0.05为有统计学意义。
实验结果
1 油红O染色:
正常组肝细胞油红O染色后,光镜下观察:肝细胞形态正常,为多边形,胞核蓝染,胞膜界限清楚,胞浆内未见脂滴。模型组肝细胞系用含体积分数10%医用脂肪乳注射液和10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基孵育人肝L-02细胞24小时,油红O染色显示胞浆内见大量红色的小泡性脂滴,肝细胞肿大,细胞核位于细胞中央,符合肝细胞小泡性脂肪变性特征(见图1,2)。高效液相测定细胞内甘油三酯含量,正常组与模型组比较,细胞内甘油三酯含量由0.417±0.045mmol/g蛋白上升至1.612±0.104mmol/g蛋白,明显增高,差别有统计学意义(p<0.01)。瘦素处理组及阳性对照组细胞浆内仅少量红色的小泡性脂滴(见图3,4)。
2 瘦素处理细胞内甘油三酯含量的变化
瘦素(10-7mol/ L)分别加入正常肝细胞组及模型组中,处理24小时后高效液相色谱分析结果发现:瘦素处理组及阳性对照组细胞内甘油三酯含量分别为,0.648±0.023mmol/g蛋白,0.865±0.143mmol/g蛋白,与模型组比较明显降低,差别有统计学意义(p<0.05)(见表3)。
3.瘦素对肝细胞LPL mRNA表达的影响
为进一步研究瘦素降低细胞内甘油三酯与LPL mRNA水平上表达的关系。我们采用了半定量RT-PCR法检测了人肝L-02细胞的LPL mRNA水平。结果显示,经瘦素处理后,较模型组相比,LPL mRNA表达明显上升,有统计学意义。(见图5, P<0.05)
讨论
脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase(LPL))分布于全身多种组织 ,而以脂肪和肌肉组织中的活性最高。脂蛋白脂酶在肌肉和脂肪组织的细胞中合成后 ,经过一系列的细胞内加工 ,如折叠、活化和糖化 ,再分泌出胞。经浓度梯度的转运 ,胞外的脂蛋白脂酶在血管内皮的表面与粘多糖类物质结合 ,在血管的内腔面与血浆中的底物直接接触 ,迅速分解乳糜微粒和VLDL中的甘油三酯 ,使得生成的脂肪酸进入细胞内参与能量代谢 (肌肉中 )或重新合成甘油三酯储存起来 (脂肪中 )。脂蛋白脂酶活性的降低,可引起高脂血症,主要为甘油三酯[1,2,3]。脂蛋白脂酶缺乏的人和鼠均表现出HDL水平的显著降低。已有研究发现LPL基因内含子3C→T突变引起高甘油三酯血症,研究者认为该突变是日本人群高甘油三酯血症的主要遗传因素[4]。
动物模型发现脂蛋白脂酶 (lipoprotein lipase(LPL))活性的降低与脂肪肝有关[5,6]。倪燕君等探讨肝脂酶(HL)和脂蛋白脂肪酶(LPL)在脂肪肝发病中的作用,结果发现,脂肪肝组与正常对照组及其他各组肝病相比,血脂明显升高,主要表现为血甘油三酯升高,肝素后血浆中HL、LPL活性显著降低,脂肪肝组患者肝组织中LPL活性亦明显降低[7]。本研究中我们以离体人肝L-02细胞株为研究对象。用含10%医用脂肪乳注射液和10%胎牛血清制备肝细胞脂肪变性模型,研究瘦素对脂变肝细胞甘油三酯含量、脂滴形成和脂蛋白脂酶基因表达的影响。结果发现,瘦素处理组与模型组相比,LPLmRNA表达明显上升,有统计学意义(P<0.05)。结果提示,瘦素可以通过影响脂蛋白脂酶活性改善脂肪变性肝细胞甘油三酯代谢。
参考文献
1.Goldberg IJ. Association of plasma lipoprotein with postheparin lipas activities. J Clin Invest, 1986,78:1523-1528.
2 郭朝阳,隋少玉,郭朝晖.脂蛋白脂酶活性与老年2型糖尿病关系的研究.中国老年病杂志,2004,24(6):510-511.
3 Nakamura T, Suehiro T,Yasuoka N,et al. A novel nonsense mutation in exon 1and a transition in 3 of the Lipoprotein lipase gene.J Atherocler Tromb,1996,3(1):17-24.
4 杨天宇,葛林,赵郁,等.脂蛋白脂酶内含子3C→T突变. 中国动脉硬化杂志,2003,11(6):570-572.
5.Reue K, Doolittle MH. Naturally occuring mutations in mice affecting lipid transport and metabolism. J Lipid Res, 1996,37:1387-1405.
6. Benhizia F, Hainault I, Serougne C, et al. Effects of a fish oil-larddiet on rat plasma lipoproteins, liver FAS, and lipolytic enzymes.Am J Physiol, 1994,267(6 pt 1):975-982.
7.倪燕君刘厚钰张顺财韩琴琴赵振泽徐俊华。肝脂酶、脂蛋白脂肪酶在脂肪肝发病中的作用。中华消化杂志 1999,19(5)324-326
(责任审校:李林)