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【摘要】 目的 探讨BRCA-1 基因在结直肠癌组织中的表达及其意义。方法 采用北京中杉金桥生物技术有限公司的二步法免疫组化法检测结直肠癌组织中BRCA-1 的表达。结果 BRCA-1结直肠癌组织中阳性率为4/56,在结直肠粘膜组织中的阳性率为25/28,相互比较有统计学意义。结论BRCA-1 在结直肠癌的发生发展过程中可能具有重要意义。
【关键词】 BRCA-1、结直肠癌、免疫组化
【中图分类号】R735.3+7【文献标识码】 B 【文章编号】1005-0515(2010)007-056-02
结直肠癌是世界上高发恶性肿瘤之一。结直肠癌的发生发展是一个涉及多种基因改变和多阶段致癌的复杂过程。其中抑癌基因的异常在结直肠癌的发生发展中起重要作用。乳腺和卵巢肿瘤易感基因BRCA1(breast and ovarian cancer susceptibility gene)是1990年由Hall等[1]发现,1994年由Skolnick[2]等克隆成功。BRCA1是家族性乳腺癌(familial breast cancer, FBC)的主要易感基因,为抑癌基因。BRCA1的异常与45%的家族性乳腺癌、卵巢癌有关。为了探讨BRCA1基因是否与结直肠癌有关,我们进行本实验。本试验采用免疫组化法检测结直肠癌组织中BRCA-1 的表达,现报告如下。
1材料与方法
1.1材料 收集山西省汾阳医院2009年10月至2010年5月住院病人手术切除结直肠癌标本56例,均未经放疗和化疗。其中,男性32例,女性24例;平均年龄53岁;最大67岁,最小37岁;高分化9例,中分化腺癌32例,低分化15例;有淋巴结转移23例,无淋巴结转移33例。4%甲醛固定,经HE染色、病理检查确诊,对照的正常结直肠粘膜中没有癌细胞存在。
BRCA-1 免疫组化采用二步法试剂,购自北京中杉金桥生物技术有限公司,产品型号:PV-6000-G。
1.2方法免疫组化染色步骤
石蜡切片脱蜡至水。
蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟,高亚热修复2分钟。
3% H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS冲洗,2分钟×3次。
滴加BRCA-1工作液, 4℃过夜。
PBS冲洗,2分钟×3次。
滴加通用型IgG抗体(Fab段)-HRP多聚体,室温15分钟,PBS冲洗,2分钟×3次。
滴加DAB溶液显色。
蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片。
结果判定显微镜下观察BRCA-1在每例癌组织、正常结直肠粘膜中的表达,每张切片于10个高倍视野(物镜40×,目镜10×),应用图象分析仪,记数阳性细胞所占实质细胞数的百分比。
统计学方法:采用SPSS 13.0软件包进行分析,比较采用χ2检验确切概率法,P≦0.05为差异有统计学意义。
2 结果
BRCA-1的蛋白表达位于胞浆(见附图1、2)。正常结直肠粘膜中的BRCA-1蛋白表达阳性(25/28),与结直肠癌组织中BRCA-1阳性(4/56),而且均为弱阳性,比较有统计学意义(P≦0.05)(见表1)。
3讨论
肿瘤易感基因BRCA1是近年来发现的重要的肿瘤抑制基因。BRCA1基因组长约80kb,编码区5 711bp,定位于染色体17q21,包含24个外显子,其中22个外显子编码一个包含锌指结构由1 863个氨基酸残基构成的蛋白质。大量的实验结果表明BRCA1基因为抑癌基因,其抑癌作用可能是通过其蛋白对其它基因的表达及细胞分化、增殖的调控实现的。其中一种重要功能是修复DNA损伤,并参与基因表达的调节。BRCA 1蛋白也与转录因子有关,并和其它转录成分有着相互的作用。当BRCA1发生基因突变使其蛋白表达结构异常或表达水平下降,致使抑制功能消失或减弱,或者由于其它原因造成BRCA1蛋白合成减少,从而导致细胞恶变和肿瘤的发生[3]。本组资料显示:正常结直肠粘膜中的BRCA-1蛋白表达率为(25/28),在结直肠癌组织中BRCA-1蛋白表达率显著降低达(4/56),与上述观点相吻合。通过研究表明BRCA1基因不仅与乳腺癌、卵巢癌发生有密切联系[4],而且与结直肠癌的发生也有关系。
Jackson等[5]研究认为,微卫星序列长度的改变是与复制过程中“滑链(miss-chain)”有关。在酵母等非肿瘤细胞中,这种“滑链(miss-chain)”由错配修复系统修复,而在肿瘤细胞中,这种修复不能进行,所以他们强调,错配修复系统异常是导致MSI产生的原因。错配修复基因缺陷是肿瘤发生的早期事件,本身并不引起肿瘤,但它使DNA复制的忠实性降低,抑癌基因或原癌基因的突变增多,最终导致肿瘤的发生。LOH是由于杂合性位点的等位基因丢失所致,肿瘤抑制基因的失活是结直肠癌进展的遗传机制之一。LOH是发现抑癌基因有效的分子遗传标志。
董立慧等[6]采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP),对41例大肠癌标本及对应的正常组织进行BRCA1基因D17S579位点MSI、LOH检测。实验中,在大肠癌TNMⅠ+Ⅱ期,D17S579位点的MSI检出率高于TNMⅢ+Ⅳ期,提示MSI与判断肿瘤进展的TNM临床分期有关,并发现随着大肠癌进展,MSI发生趋于减少,所以,他们认为MSI可作为散发性大肠癌的早期分子学诊断指标。他们的研究还发现在TNMⅠ+Ⅱ期,D17S579位点LOH检出率明显低于TNMⅢ+Ⅳ期。提示LOH多发生于大肠癌晚期,可作为大肠癌恶性程度、预后转归的判断指标。本组资料显示:正常结直肠粘膜中的BRCA-1蛋白表达率为(25/28),在结直肠癌组织中BRCA-1蛋白表达率显著降低达(4/56),从另一个侧面证实BRCA-1基因在结直肠癌的发生中所起的重要作用。
综上所说,BRCA1在结直肠癌组织中的表达急剧减低,在结直肠癌的发生发展过程中可能具有重要意义。结直肠癌组织中BRCA1基因表达降低除了MSI、LOH外很可能还存在其他的类似于在乳腺癌中的的突变位点,或者失活方式,还需要进一步采用各种方法进行细致的的研究才可以确定。
参考文献
1. Hall JM,Lee MK,Newman B,etal. Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome 17 q21[J].Science,1990,250(4988)∶1684-1689.
2. Miki Y,Swensen J,Shattuck-Eidens D,etal. A Strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1[J]. Science,1994,266(5182)∶66-71.
3. lph S,David ML.In search of the tumour suppressor functions of BRCA1 and BRCA2[J]. Nature,2000,408:429-432.
4.马怡红,付坚,吴秉铨,等.53例家族性乳腺癌BRCA1和BRCA2基因部分序列的突变分析[J].北京医科大学学报,2000,32(1),86-87.
5. Jackson AL,Loeb LA.Microsatellite instability by hydro-gen peroxide in Escherichia coli[J].Mutat Res,2000,447(2):187-198.
6. 董立慧,杨文杰,岳秀兰,等。BRCA1抑癌基因遗传不稳定性与大肠癌关系的研究[J].包头医学院学报,2009,25(5), 6-8。
(责任审校:杨怡岚)
【关键词】 BRCA-1、结直肠癌、免疫组化
【中图分类号】R735.3+7【文献标识码】 B 【文章编号】1005-0515(2010)007-056-02
结直肠癌是世界上高发恶性肿瘤之一。结直肠癌的发生发展是一个涉及多种基因改变和多阶段致癌的复杂过程。其中抑癌基因的异常在结直肠癌的发生发展中起重要作用。乳腺和卵巢肿瘤易感基因BRCA1(breast and ovarian cancer susceptibility gene)是1990年由Hall等[1]发现,1994年由Skolnick[2]等克隆成功。BRCA1是家族性乳腺癌(familial breast cancer, FBC)的主要易感基因,为抑癌基因。BRCA1的异常与45%的家族性乳腺癌、卵巢癌有关。为了探讨BRCA1基因是否与结直肠癌有关,我们进行本实验。本试验采用免疫组化法检测结直肠癌组织中BRCA-1 的表达,现报告如下。
1材料与方法
1.1材料 收集山西省汾阳医院2009年10月至2010年5月住院病人手术切除结直肠癌标本56例,均未经放疗和化疗。其中,男性32例,女性24例;平均年龄53岁;最大67岁,最小37岁;高分化9例,中分化腺癌32例,低分化15例;有淋巴结转移23例,无淋巴结转移33例。4%甲醛固定,经HE染色、病理检查确诊,对照的正常结直肠粘膜中没有癌细胞存在。
BRCA-1 免疫组化采用二步法试剂,购自北京中杉金桥生物技术有限公司,产品型号:PV-6000-G。
1.2方法免疫组化染色步骤
石蜡切片脱蜡至水。
蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟,高亚热修复2分钟。
3% H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS冲洗,2分钟×3次。
滴加BRCA-1工作液, 4℃过夜。
PBS冲洗,2分钟×3次。
滴加通用型IgG抗体(Fab段)-HRP多聚体,室温15分钟,PBS冲洗,2分钟×3次。
滴加DAB溶液显色。
蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片。
结果判定显微镜下观察BRCA-1在每例癌组织、正常结直肠粘膜中的表达,每张切片于10个高倍视野(物镜40×,目镜10×),应用图象分析仪,记数阳性细胞所占实质细胞数的百分比。
统计学方法:采用SPSS 13.0软件包进行分析,比较采用χ2检验确切概率法,P≦0.05为差异有统计学意义。
2 结果
BRCA-1的蛋白表达位于胞浆(见附图1、2)。正常结直肠粘膜中的BRCA-1蛋白表达阳性(25/28),与结直肠癌组织中BRCA-1阳性(4/56),而且均为弱阳性,比较有统计学意义(P≦0.05)(见表1)。
3讨论
肿瘤易感基因BRCA1是近年来发现的重要的肿瘤抑制基因。BRCA1基因组长约80kb,编码区5 711bp,定位于染色体17q21,包含24个外显子,其中22个外显子编码一个包含锌指结构由1 863个氨基酸残基构成的蛋白质。大量的实验结果表明BRCA1基因为抑癌基因,其抑癌作用可能是通过其蛋白对其它基因的表达及细胞分化、增殖的调控实现的。其中一种重要功能是修复DNA损伤,并参与基因表达的调节。BRCA 1蛋白也与转录因子有关,并和其它转录成分有着相互的作用。当BRCA1发生基因突变使其蛋白表达结构异常或表达水平下降,致使抑制功能消失或减弱,或者由于其它原因造成BRCA1蛋白合成减少,从而导致细胞恶变和肿瘤的发生[3]。本组资料显示:正常结直肠粘膜中的BRCA-1蛋白表达率为(25/28),在结直肠癌组织中BRCA-1蛋白表达率显著降低达(4/56),与上述观点相吻合。通过研究表明BRCA1基因不仅与乳腺癌、卵巢癌发生有密切联系[4],而且与结直肠癌的发生也有关系。
Jackson等[5]研究认为,微卫星序列长度的改变是与复制过程中“滑链(miss-chain)”有关。在酵母等非肿瘤细胞中,这种“滑链(miss-chain)”由错配修复系统修复,而在肿瘤细胞中,这种修复不能进行,所以他们强调,错配修复系统异常是导致MSI产生的原因。错配修复基因缺陷是肿瘤发生的早期事件,本身并不引起肿瘤,但它使DNA复制的忠实性降低,抑癌基因或原癌基因的突变增多,最终导致肿瘤的发生。LOH是由于杂合性位点的等位基因丢失所致,肿瘤抑制基因的失活是结直肠癌进展的遗传机制之一。LOH是发现抑癌基因有效的分子遗传标志。
董立慧等[6]采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP),对41例大肠癌标本及对应的正常组织进行BRCA1基因D17S579位点MSI、LOH检测。实验中,在大肠癌TNMⅠ+Ⅱ期,D17S579位点的MSI检出率高于TNMⅢ+Ⅳ期,提示MSI与判断肿瘤进展的TNM临床分期有关,并发现随着大肠癌进展,MSI发生趋于减少,所以,他们认为MSI可作为散发性大肠癌的早期分子学诊断指标。他们的研究还发现在TNMⅠ+Ⅱ期,D17S579位点LOH检出率明显低于TNMⅢ+Ⅳ期。提示LOH多发生于大肠癌晚期,可作为大肠癌恶性程度、预后转归的判断指标。本组资料显示:正常结直肠粘膜中的BRCA-1蛋白表达率为(25/28),在结直肠癌组织中BRCA-1蛋白表达率显著降低达(4/56),从另一个侧面证实BRCA-1基因在结直肠癌的发生中所起的重要作用。
综上所说,BRCA1在结直肠癌组织中的表达急剧减低,在结直肠癌的发生发展过程中可能具有重要意义。结直肠癌组织中BRCA1基因表达降低除了MSI、LOH外很可能还存在其他的类似于在乳腺癌中的的突变位点,或者失活方式,还需要进一步采用各种方法进行细致的的研究才可以确定。
参考文献
1. Hall JM,Lee MK,Newman B,etal. Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome 17 q21[J].Science,1990,250(4988)∶1684-1689.
2. Miki Y,Swensen J,Shattuck-Eidens D,etal. A Strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1[J]. Science,1994,266(5182)∶66-71.
3. lph S,David ML.In search of the tumour suppressor functions of BRCA1 and BRCA2[J]. Nature,2000,408:429-432.
4.马怡红,付坚,吴秉铨,等.53例家族性乳腺癌BRCA1和BRCA2基因部分序列的突变分析[J].北京医科大学学报,2000,32(1),86-87.
5. Jackson AL,Loeb LA.Microsatellite instability by hydro-gen peroxide in Escherichia coli[J].Mutat Res,2000,447(2):187-198.
6. 董立慧,杨文杰,岳秀兰,等。BRCA1抑癌基因遗传不稳定性与大肠癌关系的研究[J].包头医学院学报,2009,25(5), 6-8。
(责任审校:杨怡岚)