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摘要 [目的]筛选柴胡外植体组织培养的最佳消毒条件。[方法]选择饱满的“川北柴1号”种子，经25、100、200 g/L NaClO分别消毒处理5、10、30 min，接种于MS培养基中，考察其污染率及存活率。[结果]柴胡种子作为外植体组织培养最佳消毒条件是100 g/L NaClO处理30 min，污染率仅为6.7%，存活率为86.7%。[结论]为柴胡进一步的组织培养研究提供依据。
关键词 柴胡；外植体；组织培养；消毒条件
中图分类号 S567.7+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）12-057-02
Abstract [Objective] To obtain the optimal sterilization conditions of Bupleurum explants in tissue culture.[Method] Preparation plump seed of “Chuanbeichai NO.1” which treated severally by 25，100， 200 g/L sodium hypochlorite in 5，10 and 30 min.Then inoculated in MS medium，the pollution rate and survival rate was examined.[Result] Seed of Bupleurum as explant in tissue culture for optimal disinfection conditions is 100 g/L NaClO treatment 30 min，and contamination rate was 6.7%，the survival rate was 86.7%.[Conclusion] The study will provide the basis for further tissue culture studies of Bupleurum.
Key words Bupleurum； Explant； Tissue culture； Disinfection condition
柴胡为临床常用中药，具有较高的经济价值。伞形科植物北柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根是2010年版《中国药典》一部收载的正品柴胡[1]。药理研究表明柴胡具有解热、抗病毒、降血脂、保肝、抗炎、抗肿瘤等作用[2-3]。柴胡化学成分复杂，主要含有皂苷、黄酮、挥发油、有机酸、多糖类等[4-5]。近几年，药材市场正面临着药用资源短缺的问题，柴胡的驯化栽培已经存在，但长期栽培易导致柴胡品种退化、病害发生，从而导致柴胡产量和品质下降。因此，脱毒培养获得无毒苗很有必要，再大量繁殖可以恢复品种特性，以满足生产需要。此外，利用外植体组织培养与超低温条件可以长期保存，给离体保存的种植资源引种提供方便[6-8]。
组织培养中首先要解决且较难控制的问题是污染，如果不能将污染率降低到一定范围内，组织培养技术就失去了推广的意义，工艺也难以进行下去。在自然条件下，作为外植体的植物材料，无论外部还是内部都带有很多细菌和霉菌。因此，探索外植体的最佳消毒条件是柴胡组织培养的关键，也为其进一步研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为北柴胡新审定品系“川北柴1号”种子。“川北柴1号”系四川德培源公司选育，在四川多年多点品比试验中具有良好适应性，该品系已在2014年通过品系审定。
1.2 试验方法 将“川北柴1号”种子在流水下冲洗4 h，用70%乙醇浸泡50 s，无菌水冲洗3次后浸泡在消毒剂中进行消毒，无菌水冲洗至无明显颜色出现为止。消毒试验设计9个处理（表1）。用无菌滤纸吸干消毒处理后种子上的蒸馏水，接种到MS+1.5 mg/L 6BA+1.0 mg/L IAA的诱导培养基中，每个处理接种10瓶，每瓶接种一个外植体，重复3次。培养14 d后统计其污染率和存活率。比较消毒效果，筛选最佳外植体消毒条件。
试验所用培养基都以MS为基本培养基，以6 g/L琼脂粉为固化剂，附加30 g蔗糖，pH在5.8～6.0。培养箱温度在（25±1）℃。光照强度为2 000 lx。光照时间为14 h/d。
2 结果与分析
2.1 不同消毒时间对柴胡外植体的消毒效果
由表2可知，25 g/L NaClO消毒处理柴胡种子5 min的效果最差，污染率为100%；100 g/L NaClO消毒处理柴胡种子30 min的消毒效果最好，污染率低至6.7%，存活率为867%。
用100 g/L NaClO消毒处理柴胡种子，不同时间外植体消毒效果见图1。由图1可知，随着消毒时间的增加柴胡外植体污染率降低，最低为6.7%，成活率上升，最高86.7%。因此，消毒时间为30 min时消毒效果最佳。
2.2 不同浓度NaClO对柴胡外植体的消毒效果
选定30 min为最佳消毒时间，考察不同浓度NaClO的消毒效果，发现NaClO浓度为25 g/L时消毒效果最差，污染率达667%。NaClO浓度为100 g/L时消毒效果最好，污染率仅为6.7%，成活率为86.7%。为获得更好的消毒效果，将NaClO浓度提高到200 g/L，发现其污染率升高，而外植体的存活率由86.7%降低为80%（图2）。因此，消毒剂NaClO最佳消毒浓度为100 g/L。
方差分析表明，NaClO浓度对柴胡外植体消毒的污染率和存活率有极显著影响（P<0.01）。消毒时间对柴胡外植体消毒的污染率和存活率有显著影响（P<0.05）。 3 结论与讨论
植物组织培养中的首个问题就是控制污染率，一般而言，污染率应控制在8%以内，但在实际生产中污染率达20%，有时高达50%，甚至100%[9]。组织培养中消毒剂既要杀灭材料上的病菌，也要易被蒸馏水冲洗掉或自行分解，而且不会损伤或轻微损伤组织，影响其生长。因此，该研究选择的消毒剂为NaClO，杀菌效果好，且易清除干净。此外，消毒过程中要选择合适的浓度和时间，低浓度的NaClO不能使外植体消毒彻底，高浓度又会破坏外植体的细胞，细胞处于自我保护，会产生大量的次生物质，引起细胞毒害，导致外植体褐变甚至死亡。若消毒时间过长会对外植体造成一定程度损伤，产生次生代谢物，毒害细胞，使外植体死亡率增加；如果为了降低死亡率减少消毒时间，就会导致消毒不彻底，污染率升高。因此，消毒剂浓度和消毒时间对组织培养中灭菌过程有显著影响。选择合适的消毒剂和相对适宜的消毒时间成为“川北柴1号”组织培养中的关键。
该研究选用柴胡种子作为外植体进行组织培养研究，以期为推广柴胡新品种“川北柴1号”寻求最佳繁殖模式。该试验采用不同浓度的NaClO 对柴胡种子进行消毒处理，得到“川北柴1号”组织培养中最佳外植体消毒条件：100 g/L NaClO处理柴胡种子30 min的消毒效果最好，污染率低至67%，成活率86.7%。王腾越等[10]研究了土沉香外植体的最佳消毒方法，污染率43.33%，成活率31.67%。李键等[11]研究了雷公藤外植体最佳消毒条件，污染率21.08%，成活率6566%。林妃等[12]研究了花梨木外植体的最佳消毒方法，污染率400%，成活率51.4%。因此，相对于这些植物的消毒效果，柴胡组织培养中污染率可以得到控制。这可能是因为该试验选择的外植体为柴胡种子，本身体积小，携带的细菌少且消毒剂的危害不大。因为组织培养中污染率不仅与消毒剂的浓度及消毒时间有关，也可能是由于接种过程中培养材料被污染或是培养过程中环境的温度、湿度不合适造成的。所以在组织培养接种过程中要注意工作台面的干净，使用镊子等工具要预先进行乙醇消毒；也要选择湿度、温度都适宜且病菌少的环境。此外，组织培养中的存活率不仅与消毒剂及消毒时间有关，也可能是材料本身相对老化或者是培养基激素影响。因此，要保证组织培养中材料低污染率高存活率，除选择最佳的消毒处理，也须选择合适的外植体、适宜的生长激素和环境。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：263-264.
[2] 杨柳，王雪莹，刘畅，等.北柴胡化学成分与药理作用的研究进展[J].中医药信息，2012，29（3）：143-145.
[3] 徐献梅，张雪，杨亮.论柴胡的产地来源及药理作用[J].贵阳中医学院学报，2012，34（4）：18-20.
[4] 沃源，姚琳，孙世伟.北柴胡化学成分的研究进展[J].黑龙江医药，2011，21（2）：215-217.
[5] 谢东浩，蔡宝昌，安益强，等.柴胡皂苷类化学成分及药理作用研究进展[J].南京中医药大学学报，2007，23（1）：63-65.
[6] 周钟瑞.植物细胞、组织培养在药材生产中的应用[J].中国民族民间医药杂志，1994（11）：29-31.
[7] 张淑红.植物组织培养及其发展方向[J].垦殖与稻作，2003（6）：43-45.
[8] 范玉清，任国华.国内植物组织培养进展概况[J].晋东南师范专科学校学报，2004，19（2）：23-24.
[9] 王利民，周毅，陈友龙，等.植物组织培养中消毒剂的运用[J].贵州师范大学学报：自然科学版，2002，20（1）：15-17.
[10] 王腾越，周再知，裘珍飞，等.土沉香组织培养外植体消毒方法的研究[J].中南林业科技大学学报，2012，32（3）：44-48.
[11] 李键，李建鹃，吴承祯.等.雷公藤组织培养外植体消毒和选择[J].中南林业科技大学学报，2010，30（8）：18-21.
[12] 林妃，李敬阳，常胜合，等.花梨木组织培养外植体消毒方法初步探讨[J].基因组学与应用生物学，2013，32（4）：522-525.
关键词 柴胡；外植体；组织培养；消毒条件
中图分类号 S567.7+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）12-057-02
Abstract [Objective] To obtain the optimal sterilization conditions of Bupleurum explants in tissue culture.[Method] Preparation plump seed of “Chuanbeichai NO.1” which treated severally by 25，100， 200 g/L sodium hypochlorite in 5，10 and 30 min.Then inoculated in MS medium，the pollution rate and survival rate was examined.[Result] Seed of Bupleurum as explant in tissue culture for optimal disinfection conditions is 100 g/L NaClO treatment 30 min，and contamination rate was 6.7%，the survival rate was 86.7%.[Conclusion] The study will provide the basis for further tissue culture studies of Bupleurum.
Key words Bupleurum； Explant； Tissue culture； Disinfection condition
柴胡为临床常用中药，具有较高的经济价值。伞形科植物北柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根是2010年版《中国药典》一部收载的正品柴胡[1]。药理研究表明柴胡具有解热、抗病毒、降血脂、保肝、抗炎、抗肿瘤等作用[2-3]。柴胡化学成分复杂，主要含有皂苷、黄酮、挥发油、有机酸、多糖类等[4-5]。近几年，药材市场正面临着药用资源短缺的问题，柴胡的驯化栽培已经存在，但长期栽培易导致柴胡品种退化、病害发生，从而导致柴胡产量和品质下降。因此，脱毒培养获得无毒苗很有必要，再大量繁殖可以恢复品种特性，以满足生产需要。此外，利用外植体组织培养与超低温条件可以长期保存，给离体保存的种植资源引种提供方便[6-8]。
组织培养中首先要解决且较难控制的问题是污染，如果不能将污染率降低到一定范围内，组织培养技术就失去了推广的意义，工艺也难以进行下去。在自然条件下，作为外植体的植物材料，无论外部还是内部都带有很多细菌和霉菌。因此，探索外植体的最佳消毒条件是柴胡组织培养的关键，也为其进一步研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为北柴胡新审定品系“川北柴1号”种子。“川北柴1号”系四川德培源公司选育，在四川多年多点品比试验中具有良好适应性，该品系已在2014年通过品系审定。
1.2 试验方法 将“川北柴1号”种子在流水下冲洗4 h，用70%乙醇浸泡50 s，无菌水冲洗3次后浸泡在消毒剂中进行消毒，无菌水冲洗至无明显颜色出现为止。消毒试验设计9个处理（表1）。用无菌滤纸吸干消毒处理后种子上的蒸馏水，接种到MS+1.5 mg/L 6BA+1.0 mg/L IAA的诱导培养基中，每个处理接种10瓶，每瓶接种一个外植体，重复3次。培养14 d后统计其污染率和存活率。比较消毒效果，筛选最佳外植体消毒条件。
试验所用培养基都以MS为基本培养基，以6 g/L琼脂粉为固化剂，附加30 g蔗糖，pH在5.8～6.0。培养箱温度在（25±1）℃。光照强度为2 000 lx。光照时间为14 h/d。
2 结果与分析
2.1 不同消毒时间对柴胡外植体的消毒效果
由表2可知，25 g/L NaClO消毒处理柴胡种子5 min的效果最差，污染率为100%；100 g/L NaClO消毒处理柴胡种子30 min的消毒效果最好，污染率低至6.7%，存活率为867%。
用100 g/L NaClO消毒处理柴胡种子，不同时间外植体消毒效果见图1。由图1可知，随着消毒时间的增加柴胡外植体污染率降低，最低为6.7%，成活率上升，最高86.7%。因此，消毒时间为30 min时消毒效果最佳。
2.2 不同浓度NaClO对柴胡外植体的消毒效果
选定30 min为最佳消毒时间，考察不同浓度NaClO的消毒效果，发现NaClO浓度为25 g/L时消毒效果最差，污染率达667%。NaClO浓度为100 g/L时消毒效果最好，污染率仅为6.7%，成活率为86.7%。为获得更好的消毒效果，将NaClO浓度提高到200 g/L，发现其污染率升高，而外植体的存活率由86.7%降低为80%（图2）。因此，消毒剂NaClO最佳消毒浓度为100 g/L。
方差分析表明，NaClO浓度对柴胡外植体消毒的污染率和存活率有极显著影响（P<0.01）。消毒时间对柴胡外植体消毒的污染率和存活率有显著影响（P<0.05）。 3 结论与讨论
植物组织培养中的首个问题就是控制污染率，一般而言，污染率应控制在8%以内，但在实际生产中污染率达20%，有时高达50%，甚至100%[9]。组织培养中消毒剂既要杀灭材料上的病菌，也要易被蒸馏水冲洗掉或自行分解，而且不会损伤或轻微损伤组织，影响其生长。因此，该研究选择的消毒剂为NaClO，杀菌效果好，且易清除干净。此外，消毒过程中要选择合适的浓度和时间，低浓度的NaClO不能使外植体消毒彻底，高浓度又会破坏外植体的细胞，细胞处于自我保护，会产生大量的次生物质，引起细胞毒害，导致外植体褐变甚至死亡。若消毒时间过长会对外植体造成一定程度损伤，产生次生代谢物，毒害细胞，使外植体死亡率增加；如果为了降低死亡率减少消毒时间，就会导致消毒不彻底，污染率升高。因此，消毒剂浓度和消毒时间对组织培养中灭菌过程有显著影响。选择合适的消毒剂和相对适宜的消毒时间成为“川北柴1号”组织培养中的关键。
该研究选用柴胡种子作为外植体进行组织培养研究，以期为推广柴胡新品种“川北柴1号”寻求最佳繁殖模式。该试验采用不同浓度的NaClO 对柴胡种子进行消毒处理，得到“川北柴1号”组织培养中最佳外植体消毒条件：100 g/L NaClO处理柴胡种子30 min的消毒效果最好，污染率低至67%，成活率86.7%。王腾越等[10]研究了土沉香外植体的最佳消毒方法，污染率43.33%，成活率31.67%。李键等[11]研究了雷公藤外植体最佳消毒条件，污染率21.08%，成活率6566%。林妃等[12]研究了花梨木外植体的最佳消毒方法，污染率400%，成活率51.4%。因此，相对于这些植物的消毒效果，柴胡组织培养中污染率可以得到控制。这可能是因为该试验选择的外植体为柴胡种子，本身体积小，携带的细菌少且消毒剂的危害不大。因为组织培养中污染率不仅与消毒剂的浓度及消毒时间有关，也可能是由于接种过程中培养材料被污染或是培养过程中环境的温度、湿度不合适造成的。所以在组织培养接种过程中要注意工作台面的干净，使用镊子等工具要预先进行乙醇消毒；也要选择湿度、温度都适宜且病菌少的环境。此外，组织培养中的存活率不仅与消毒剂及消毒时间有关，也可能是材料本身相对老化或者是培养基激素影响。因此，要保证组织培养中材料低污染率高存活率，除选择最佳的消毒处理，也须选择合适的外植体、适宜的生长激素和环境。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：263-264.
[2] 杨柳，王雪莹，刘畅，等.北柴胡化学成分与药理作用的研究进展[J].中医药信息，2012，29（3）：143-145.
[3] 徐献梅，张雪，杨亮.论柴胡的产地来源及药理作用[J].贵阳中医学院学报，2012，34（4）：18-20.
[4] 沃源，姚琳，孙世伟.北柴胡化学成分的研究进展[J].黑龙江医药，2011，21（2）：215-217.
[5] 谢东浩，蔡宝昌，安益强，等.柴胡皂苷类化学成分及药理作用研究进展[J].南京中医药大学学报，2007，23（1）：63-65.
[6] 周钟瑞.植物细胞、组织培养在药材生产中的应用[J].中国民族民间医药杂志，1994（11）：29-31.
[7] 张淑红.植物组织培养及其发展方向[J].垦殖与稻作，2003（6）：43-45.
[8] 范玉清，任国华.国内植物组织培养进展概况[J].晋东南师范专科学校学报，2004，19（2）：23-24.
[9] 王利民，周毅，陈友龙，等.植物组织培养中消毒剂的运用[J].贵州师范大学学报：自然科学版，2002，20（1）：15-17.
[10] 王腾越，周再知，裘珍飞，等.土沉香组织培养外植体消毒方法的研究[J].中南林业科技大学学报，2012，32（3）：44-48.
[11] 李键，李建鹃，吴承祯.等.雷公藤组织培养外植体消毒和选择[J].中南林业科技大学学报，2010，30（8）：18-21.
[12] 林妃，李敬阳，常胜合，等.花梨木组织培养外植体消毒方法初步探讨[J].基因组学与应用生物学，2013，32（4）：522-525.