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摘 要：本文对不同炮制工艺对何首乌中成分含量的影响进行研究。固定相为：依利特hypersil BDS C18 色谱柱（4.6*250*5u），乙腈-甲醇-水（10：2：88）为流动相，检测波长为322nm；2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在5～95μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。本法简便、重现性好、回收率高，可用于不同何首乌炮制品中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量测定。
关键词：何首乌；炮制；测定
何首乌为蓼科多年生缠绕藤本植物，又名野苗、桃柳藤、赤葛、九真藤、马肝石、九真藤芮草、蛇草、陈知白、疮帚等。生首乌能解毒，消痈，润肠通便。制首乌功能补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨。《滇南本草》记载：“涩精，坚肾气，止赤白便浊，缩小便，入血分，消痰毒。治赤白癜风，疮疥顽癣，皮肤瘙庠。截疟，治痰疟。”何首乌经炮制可减毒，炮制方法、时间对何首乌成分及肝毒性均有影响[1-5]。本文对不同炮制工艺对何首乌中成分含量的影响进行研究。
1 仪器與试药
1.1 仪器：PURIST超纯水系统（上海瑞枫生物科技有限公司）；TGF-9075A电热恒温鼓风干燥箱（上海喆图科学仪器有限公司）；HX-06超声波清洗器（武汉恒信世纪科技有限公司）；德国美诺PG8583CD实验室清洗消毒机（科德恩（北京）科技发展有限公司）；LC2000液相色谱（天美（中国）科学仪器有限公司）；普利赛斯 EP125SM 电子天平（上海天美天平仪器有限公司）；PURELAB flex 系列纯水机（威立雅水处理技术（上海）有限公司）。
1.2 试药：乙腈（北京迈瑞达科技有限公司）、磷酸（天津谱祥科技有限公司）、三乙胺（淄博市临淄冰清精细化工厂）、甲醇（天津谱祥科技有限公司）、磷酸氢二铵（北京迈瑞达科技有限公司）、冰乙酸（北京迈瑞达科技有限公司）。
2 含量测定
2.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[1-6]。色谱柱为依利特hypersil BDS C18 色谱柱（4.6*250*5u）；乙腈-甲醇-水（10：2：88）为流动相；检测波长为322nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不得低于2000。
2.2 炮制品的制备
2.2.1 黑豆黄酒制。取何首乌倒入盆内，用黑豆汁与黄酒拌匀，置罐内或适宜容器内，密闭，坐水锅中，隔水炖至汁液吸尽，取出，晒干即得。黑豆汁的制法 取黑豆10kg，加水煮约4小时，熬汁约15kg，豆渣冉加水煮约3小时，熬汁约10kg，两次共熬汁约25kg。
2.2.2 蒸制。取何首乌，洗净，煮沸4-6小时，至中心至粘性，晒半干，切去茎基及尾梢，反复晒至发硬，再浸4小时后，加水盖过药面，煮沸8小时，焖1夜，晒半干，再蒸8小时，焖15小时。再如前法操作1次，趁热切9-12mm方块，晒干。
2.2.3 酒制。取何首乌片或块，用黄酒拌匀，润4-6小时，放笼屉内蒸6小时，取出稍晾，再加入锅内汁水，候汁吸尽，捞起再蒸，以蒸黑为度，取出晒干或烘干。
2.2.4 黑豆制。取何首乌片或块，用黑豆汁拌匀，置非铁质的适宜容器内，密闭，隔水加热或用蒸汽加热炖至汁液吸尽或取何首乌片或块。黑豆汁制法：取黑豆10kg，加水适量，约煮4小时，熬汁约15kg，豆渣再加水煮约3小时，敖汁约10kg，合并得黑豆汁约25kg。
2.3 供试品溶液的制备
取何首乌适量，粉碎成粗粉，精密称定至容量瓶内，加适量流动相超声20分钟，放凉，用流动相定容，过0.45μm的滤膜，即得。
2.4 对照品溶液的制备
精密称取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品约10mg，置50毫升棕色容量瓶中，用流动相超声波振荡溶解并用水稀释至刻度，摇匀，精密吸取10毫升，置100毫升棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL溶液中含2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷20μg）。
2.5 标准曲线的制备
制备浓度为5μg·mL-1、15μg·mL-1、25μg·mL-1、35μg·mL-1、45μg·mL-1、55μg·mL-1、65μg·mL-1、75μg·mL-1、85μg·mL-1、95μg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取10μL注入HPLC，记录色谱图。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品在5～95μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
精密吸取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD为0.55%。结果表明，本实验精密度良好。
2.7 重现性试验
分别称取同批何首乌样品6份，分别制备成供试品，按色谱条件测定含量，并计算样品的RSD值为0.53%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.8 稳定性试验
取供试品溶液，分别在0，1，2，3，4h精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰面积积分值的RSD为0.52%。结果表明2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷至少在4h内稳定。
2.9 样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定何首乌三批样品中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量，结果2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量生片>黑豆制>黑豆黄酒制>蒸制>酒制。
3 讨论
分别考察乙腈-甲醇-水（10：2：88），乙腈-甲醇-水（20：2：78），乙腈-0.033mol/L磷酸二氢钾（含0.5%三乙胺，用磷酸调节pH至3.0）（30：70），乙腈-甲醇-水（15：15∶70），0.05mol.L-1磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH到3.0）-乙腈（20∶80），乙腈-甲醇-1%醋酸钠-冰醋酸（18：12：70∶0.1）不同比例的流动相，结果以乙腈-甲醇-水（10：2：88）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈-甲醇-水（10：2：88）为流动相。2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量生片>黑豆制>黑豆黄酒制>蒸制>酒制。
参考文献
[1]李晓菲，李娜，涂灿，李春雨，庞晶瑶，贾歌刘畅，赵艳玲，牛明，马致洁，王伽伯，孙洪胜，肖小河.基于内毒素特异质模型的生首乌与制首乌肝毒性比较研究[J].中草药，2015（10）.
[2]贾歌刘畅，庞晶瑶，柏兆方，牛明，赵艳玲，朱云，张雅铭，马致洁，赵奎君，王伽伯，肖小河.何首乌及其成分对人正常肝细胞凋亡的影响[J].中国中医药信息杂志，2015（11）.
[3]涂灿，蒋冰倩，赵艳玲，李春雨，李娜，李晓菲，贾歌刘畅，庞晶瑶，马致洁，王伽伯，肖小河.何首乌炮制前后对大鼠肝脏的损伤比较及敏感指标筛选[J].中国中药杂志，2015（04）.
[4]庞晶瑶，柏兆方，牛明，涂灿，马致洁，赵艳玲，赵奎君，游云，王伽伯，肖小河.基于“有故无殒”的何首乌对正常和肝损伤大鼠的毒性与保护作用对比研究[J].药学学报，2015（08）.
[5]吕旸，王伽伯，嵇扬，赵艳玲，马致洁，李奇，邹正升，梁庆生，滕光菊，鄢丹，张萍，肖小河，喻长远.提取溶剂对何首乌肝细胞毒性的影响[J].中国实验方剂学杂志，2013（20）.
关键词：何首乌；炮制；测定
何首乌为蓼科多年生缠绕藤本植物，又名野苗、桃柳藤、赤葛、九真藤、马肝石、九真藤芮草、蛇草、陈知白、疮帚等。生首乌能解毒，消痈，润肠通便。制首乌功能补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨。《滇南本草》记载：“涩精，坚肾气，止赤白便浊，缩小便，入血分，消痰毒。治赤白癜风，疮疥顽癣，皮肤瘙庠。截疟，治痰疟。”何首乌经炮制可减毒，炮制方法、时间对何首乌成分及肝毒性均有影响[1-5]。本文对不同炮制工艺对何首乌中成分含量的影响进行研究。
1 仪器與试药
1.1 仪器：PURIST超纯水系统（上海瑞枫生物科技有限公司）；TGF-9075A电热恒温鼓风干燥箱（上海喆图科学仪器有限公司）；HX-06超声波清洗器（武汉恒信世纪科技有限公司）；德国美诺PG8583CD实验室清洗消毒机（科德恩（北京）科技发展有限公司）；LC2000液相色谱（天美（中国）科学仪器有限公司）；普利赛斯 EP125SM 电子天平（上海天美天平仪器有限公司）；PURELAB flex 系列纯水机（威立雅水处理技术（上海）有限公司）。
1.2 试药：乙腈（北京迈瑞达科技有限公司）、磷酸（天津谱祥科技有限公司）、三乙胺（淄博市临淄冰清精细化工厂）、甲醇（天津谱祥科技有限公司）、磷酸氢二铵（北京迈瑞达科技有限公司）、冰乙酸（北京迈瑞达科技有限公司）。
2 含量测定
2.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[1-6]。色谱柱为依利特hypersil BDS C18 色谱柱（4.6*250*5u）；乙腈-甲醇-水（10：2：88）为流动相；检测波长为322nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不得低于2000。
2.2 炮制品的制备
2.2.1 黑豆黄酒制。取何首乌倒入盆内，用黑豆汁与黄酒拌匀，置罐内或适宜容器内，密闭，坐水锅中，隔水炖至汁液吸尽，取出，晒干即得。黑豆汁的制法 取黑豆10kg，加水煮约4小时，熬汁约15kg，豆渣冉加水煮约3小时，熬汁约10kg，两次共熬汁约25kg。
2.2.2 蒸制。取何首乌，洗净，煮沸4-6小时，至中心至粘性，晒半干，切去茎基及尾梢，反复晒至发硬，再浸4小时后，加水盖过药面，煮沸8小时，焖1夜，晒半干，再蒸8小时，焖15小时。再如前法操作1次，趁热切9-12mm方块，晒干。
2.2.3 酒制。取何首乌片或块，用黄酒拌匀，润4-6小时，放笼屉内蒸6小时，取出稍晾，再加入锅内汁水，候汁吸尽，捞起再蒸，以蒸黑为度，取出晒干或烘干。
2.2.4 黑豆制。取何首乌片或块，用黑豆汁拌匀，置非铁质的适宜容器内，密闭，隔水加热或用蒸汽加热炖至汁液吸尽或取何首乌片或块。黑豆汁制法：取黑豆10kg，加水适量，约煮4小时，熬汁约15kg，豆渣再加水煮约3小时，敖汁约10kg，合并得黑豆汁约25kg。
2.3 供试品溶液的制备
取何首乌适量，粉碎成粗粉，精密称定至容量瓶内，加适量流动相超声20分钟，放凉，用流动相定容，过0.45μm的滤膜，即得。
2.4 对照品溶液的制备
精密称取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品约10mg，置50毫升棕色容量瓶中，用流动相超声波振荡溶解并用水稀释至刻度，摇匀，精密吸取10毫升，置100毫升棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL溶液中含2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷20μg）。
2.5 标准曲线的制备
制备浓度为5μg·mL-1、15μg·mL-1、25μg·mL-1、35μg·mL-1、45μg·mL-1、55μg·mL-1、65μg·mL-1、75μg·mL-1、85μg·mL-1、95μg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取10μL注入HPLC，记录色谱图。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品在5～95μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
精密吸取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD为0.55%。结果表明，本实验精密度良好。
2.7 重现性试验
分别称取同批何首乌样品6份，分别制备成供试品，按色谱条件测定含量，并计算样品的RSD值为0.53%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.8 稳定性试验
取供试品溶液，分别在0，1，2，3，4h精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰面积积分值的RSD为0.52%。结果表明2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷至少在4h内稳定。
2.9 样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定何首乌三批样品中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量，结果2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量生片>黑豆制>黑豆黄酒制>蒸制>酒制。
3 讨论
分别考察乙腈-甲醇-水（10：2：88），乙腈-甲醇-水（20：2：78），乙腈-0.033mol/L磷酸二氢钾（含0.5%三乙胺，用磷酸调节pH至3.0）（30：70），乙腈-甲醇-水（15：15∶70），0.05mol.L-1磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH到3.0）-乙腈（20∶80），乙腈-甲醇-1%醋酸钠-冰醋酸（18：12：70∶0.1）不同比例的流动相，结果以乙腈-甲醇-水（10：2：88）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈-甲醇-水（10：2：88）为流动相。2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量生片>黑豆制>黑豆黄酒制>蒸制>酒制。
参考文献
[1]李晓菲，李娜，涂灿，李春雨，庞晶瑶，贾歌刘畅，赵艳玲，牛明，马致洁，王伽伯，孙洪胜，肖小河.基于内毒素特异质模型的生首乌与制首乌肝毒性比较研究[J].中草药，2015（10）.
[2]贾歌刘畅，庞晶瑶，柏兆方，牛明，赵艳玲，朱云，张雅铭，马致洁，赵奎君，王伽伯，肖小河.何首乌及其成分对人正常肝细胞凋亡的影响[J].中国中医药信息杂志，2015（11）.
[3]涂灿，蒋冰倩，赵艳玲，李春雨，李娜，李晓菲，贾歌刘畅，庞晶瑶，马致洁，王伽伯，肖小河.何首乌炮制前后对大鼠肝脏的损伤比较及敏感指标筛选[J].中国中药杂志，2015（04）.
[4]庞晶瑶，柏兆方，牛明，涂灿，马致洁，赵艳玲，赵奎君，游云，王伽伯，肖小河.基于“有故无殒”的何首乌对正常和肝损伤大鼠的毒性与保护作用对比研究[J].药学学报，2015（08）.
[5]吕旸，王伽伯，嵇扬，赵艳玲，马致洁，李奇，邹正升，梁庆生，滕光菊，鄢丹，张萍，肖小河，喻长远.提取溶剂对何首乌肝细胞毒性的影响[J].中国实验方剂学杂志，2013（20）.