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摘要 [目的]分析两歧双歧杆菌PRL2010菌体外表面蛋白的功能。[方法]以两歧双歧杆菌PRL2010基因组序列为研究对象，采用Perry等人分析革兰氏阳性菌菌体外表面蛋白（PSE蛋白）的Inmembrane方法，同时采用COG功能数据库对预测的外表面蛋白进行功能注释和聚類分析。[结果]PRL2010外表面蛋白包括28个细胞壁蛋白、12个脂蛋白、182个细胞膜蛋白、38个分泌蛋白。PRL2010外表面蛋白的功能分析结果显示，大多数外表面蛋白与细胞壁、细胞膜的生物合成，无机离子转运与代谢，防御机制，碳水化合物转运与代谢，氨基酸转运与代谢等有关。 [结论]该研究可为探讨该菌与宿主相互作用的分子机制奠定基础。
关键词 两歧双歧杆菌；基因组；外表面蛋白；功能
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）18-0118-02
Abstract [Objective]To analyze the function of the outer surface proteins of Bifidobacterium bifidum PRL2010. [Method]The genome sequence of B. bifidum PRL2010 was used to study the potentially surface exposed proteins （ PSE proteins ） by Inmembrane used by Perry et al， to analyze PSE proteins of Grampositive bacteria. Functional annotation and cluster analysis of predicted surface proteins were performed by using COG （Cluster of Orthologous Groups of proteins） functional database. [Result]The outer surface protein of PRL2010 included 28 cell wall proteins，12 lipoproteins，182 cell membrane proteins，38 secretory proteins. Function analysis of the outer surface proteins showed that most outer surface proteins were involved in amino acid transport and metabolism， carbohydrate transport and metabolism， cell wall or cell membrane formation， defense mechanism， inorganic ion transport and metabolism.[Conclusion]The study provided the basis for studing molecular methanisms of interaction between bacteria and their host.
Key words Bifidobacterium bifidum；Genome；Outer surface protein；Function
兩歧双歧杆菌PRL2010作为一种肠道内的益生菌株，它具有抑制肠道致病菌黏附[1]、降低血清胆固醇[2]、调节宿主免疫[3]、调整肠道菌群等益生作用。双歧杆菌的外表面蛋白在介导菌体与宿主细胞黏附定殖、与外界环境相互作用方面起着非常重要的作用[4-5]。2010年该菌株完成了全基因组测序和功能注释，共1 791个基因，1 706个编码蛋白[6]。
该菌株基因组测序的完成，使得利用基因组学数据进行功能基因组学分析得以实施，如菌体外表面蛋白的分析。目前关于细菌外表面蛋白的基因组分析主要集中在致病菌[7-9]和乳杆菌方面，如Barinov等[10]采用SurfG+的方法对革兰氏阳性菌进行了预测，结果显示该方法是一种非常有效的分析革兰氏阳性菌外表面蛋白的方法。同样，2013年Perry等[11]提出更为容易和方便的分析方法：Inmembrane。目前关于双歧杆菌外表面蛋白的基因组预测和功能分析，国内外鲜见报道。以两歧双歧杆菌PRL2010全基因组编码蛋白序列为研究对象，采用Inmembrane方法分析该菌株外表面蛋白和功能，以期为探讨该菌与宿主相互作用的分子机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
美国国立生物技术信息中心（NCBI）GenBank公布的两歧双歧杆菌PRL2010全基因组序列，GenBank 的登录号是NC_014638.1。
1.2 方法
采用Perry等[11]分析革兰氏阳性菌外表面蛋白的Inmembrane方法，即采用SignalP4.0、LipoP、HMM search 2.0等一系列生物信息学分析软件预测革兰氏阳性菌外表面的蛋白，预测并统计各类外表面蛋白（脂蛋白、细胞壁蛋白、细胞膜蛋白、分泌蛋白），利用COG功能数据库对各类蛋白进行注释，同时进行COG功能聚类分析。
2 结果与分析
2.1 两歧双歧杆菌PRL2010菌体外表面蛋白的种类分析
两歧双歧杆菌PRL2010菌体外表面蛋白的种类分析结果见表1。分析结果显示，两歧双歧杆菌PRL2010基因组编码的1 706个蛋白中，暴露于菌体外表面蛋白共计260个，占基因组蛋白比例为15.2%。在这些蛋白中，定位于细胞膜的蛋白数目最多，达182个，占基因组蛋白比例为10.7%，这些跨膜螺旋数的膜蛋白分布见图1。 外表面蛋白的膜蛋白中，具有1个跨膜螺旋数的蛋白最多（87个），其次是具有2个和3个跨膜螺旋数的蛋白，分别为23个和16个。
2.2 两歧双歧杆菌PRL2010菌体外表面蛋白的功能分析
两歧双歧杆菌PRL2010基因组预测的外表面蛋白功能分析结果见图2。两歧双歧杆菌PRL2010菌体外表面蛋白数目为260个。从图2可以看出，在这些蛋白中，含有较大比例的蛋白没有功能注释（128个），132个蛋白具有COG功能注释。在有具体功能注释的蛋白中，所占比例较大的是与细胞壁、细胞膜生物合成有关（17个）；与无机离子转运与代谢有关（12个）、与防御机制有关（12个）、与碳水化合物转运与代谢有关（11个）、与氨基酸转运与代谢有关（8个）等。功能聚类分析结果表明菌体外表面蛋白与这些功能有关。
3 讨论与结论
细菌外表面的数量和种类与微生物的特性和生长环境有着密切的联系，特别
是与宿主之间的相互作用，如根癌土壤杆菌，它是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性菌，植物根的表面依靠由根组织渗透出来的营养物质进行生存[12]；再如马铃薯晚疫病菌是引起马铃薯和西红柿晚疫病的病原菌，其生存环境主要是植物体内，分析发现潜在的分泌到细胞外蛋白为671个，占基因组蛋白总数的3%。由于越来越多菌株全基因组测序的完成，采用基因组编码蛋白序列預测细菌外表面蛋白成为可能。最早预测革兰氏阳性菌外表面蛋白的方法是SurfG+，但该方法里面的一些程序网上不一定能随时获得，另外它主要用于预测革兰氏阳性菌。Perry等[11]于2013年提出了Inmembrane的分析方法，该方法对SurfG+方法进行了完善和补充，程序很容易网上在线获取，并且可以对革兰氏阴性菌进行预测分析。
该研究预测分析得到的两歧双歧杆菌PRL2010 260个外表面蛋白中，132个蛋白没有功能注释，这部分蛋白还需要进行进一步的功能研究和注释。在有功能注释的蛋白中，所占比例较大的是与细胞壁、细胞膜生物合成有关；与无机离子转运与代谢有关；与防御机制有关；与碳水化合物转运与代谢有关、与氨基酸转运与代谢有关。功能分析結果表明菌体外表面蛋白在营养物质交换、环境适应、细胞稳定性方面发挥重要作用。该研究获得的结果将对今后研究两歧双歧杆菌PRL2010与宿主作用的分子机制提供标靶，同时，也为益生菌领域的研究发展及应用分析提供数据基础。
参考文献
[1] SERAFINI F，STRATI F，RUASMADIEDO P，et al.Evaluation of adhesion properties and antibacterial activities of the infant gut commensal Bifidobacterium bifidum PRL2010 [J].Anaerobe，2013，21：9-17.
[2] ZANOTTI I，TURRONI F，PIEMONTESE A，et al.Evidence for cholesterollowering activity by Bifidobacterium bifidum PRL2010 through gut microbiota modulation[J].Appl Microbiol Biotechnol，2015，99（16）：6813- 6829.
[3] TURRONI F，TAVERNITI V，RUASMADIEDO P，et al.Bifidobacterium bifidum PRL2010 modulates the host innate immune response[J].Applied and environmental microbiology，2014，80（2）：730-740.
[4] LIU C，ZHANG Z Y，DONG K，et al.Adhesion and immunomodulatory effects of Bifidobacterium lactis HN019 on intestinal epithelial cells INT407[J].World journal of gastroenterology，2010，16（18）：2283-2290.
[5] GILAD O，SVENSSON B，VIBORG A H，et al.The extracellular proteome of Bifidobacterium animalis subsp.lactis BB-12 reveals proteins with putative roles in probiotic effects[J].Proteomics，2011，11（12）：2503-2514.
[6] TURRONI F，BOTTACINI F，FORONI E，et al.Genome analysis of Bifidobacterium bifidum PRL2010 reveals metabolic pathways for hostderived glycan foraging[J].Proceedings of the national academy of sciences of the united states of america，2010，107（45）：19514-19519.
[7] 赵文杰，曾嘉，柳建设，等.嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因组分泌蛋白的初步分析[J].现代生物医学进展，2008，8（1）：22-26.
[8] 周晓罡，侯思名，陈铎文，等.马铃薯晚疫病菌全基因组分泌蛋白的初步分析[J].遗传，2011，33（7）：785-793.
[9] 周晓罡，李成云，赵之伟，等.粗糙脉孢菌基因组分泌蛋白的初步分析[J].遗传，2006，28（2）：200-207.
[10] BARINOV A，LOUX V，HAMMANI A，et al.Prediction of surface exposed proteins in Streptococcus pyogenes，with a potential application to other Grampositive bacteria[J].Proteomics，2009，9（1）：61-73.
[11] PERRY A J，HO B K.Inmembrane，a bioinformatic workflow for annotation of bacterial cellsurface proteomes[J].Source code for biology and medicine，2013，8（1）：9.
[12] 范成明，李成云，赵明富，等.根癌土壤杆菌C58 Cereon中分泌蛋白信号肽分析[J].微生物学报，2005，45（4）：561-566.
关键词 两歧双歧杆菌；基因组；外表面蛋白；功能
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）18-0118-02
Abstract [Objective]To analyze the function of the outer surface proteins of Bifidobacterium bifidum PRL2010. [Method]The genome sequence of B. bifidum PRL2010 was used to study the potentially surface exposed proteins （ PSE proteins ） by Inmembrane used by Perry et al， to analyze PSE proteins of Grampositive bacteria. Functional annotation and cluster analysis of predicted surface proteins were performed by using COG （Cluster of Orthologous Groups of proteins） functional database. [Result]The outer surface protein of PRL2010 included 28 cell wall proteins，12 lipoproteins，182 cell membrane proteins，38 secretory proteins. Function analysis of the outer surface proteins showed that most outer surface proteins were involved in amino acid transport and metabolism， carbohydrate transport and metabolism， cell wall or cell membrane formation， defense mechanism， inorganic ion transport and metabolism.[Conclusion]The study provided the basis for studing molecular methanisms of interaction between bacteria and their host.
Key words Bifidobacterium bifidum；Genome；Outer surface protein；Function
兩歧双歧杆菌PRL2010作为一种肠道内的益生菌株，它具有抑制肠道致病菌黏附[1]、降低血清胆固醇[2]、调节宿主免疫[3]、调整肠道菌群等益生作用。双歧杆菌的外表面蛋白在介导菌体与宿主细胞黏附定殖、与外界环境相互作用方面起着非常重要的作用[4-5]。2010年该菌株完成了全基因组测序和功能注释，共1 791个基因，1 706个编码蛋白[6]。
该菌株基因组测序的完成，使得利用基因组学数据进行功能基因组学分析得以实施，如菌体外表面蛋白的分析。目前关于细菌外表面蛋白的基因组分析主要集中在致病菌[7-9]和乳杆菌方面，如Barinov等[10]采用SurfG+的方法对革兰氏阳性菌进行了预测，结果显示该方法是一种非常有效的分析革兰氏阳性菌外表面蛋白的方法。同样，2013年Perry等[11]提出更为容易和方便的分析方法：Inmembrane。目前关于双歧杆菌外表面蛋白的基因组预测和功能分析，国内外鲜见报道。以两歧双歧杆菌PRL2010全基因组编码蛋白序列为研究对象，采用Inmembrane方法分析该菌株外表面蛋白和功能，以期为探讨该菌与宿主相互作用的分子机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
美国国立生物技术信息中心（NCBI）GenBank公布的两歧双歧杆菌PRL2010全基因组序列，GenBank 的登录号是NC_014638.1。
1.2 方法
采用Perry等[11]分析革兰氏阳性菌外表面蛋白的Inmembrane方法，即采用SignalP4.0、LipoP、HMM search 2.0等一系列生物信息学分析软件预测革兰氏阳性菌外表面的蛋白，预测并统计各类外表面蛋白（脂蛋白、细胞壁蛋白、细胞膜蛋白、分泌蛋白），利用COG功能数据库对各类蛋白进行注释，同时进行COG功能聚类分析。
2 结果与分析
2.1 两歧双歧杆菌PRL2010菌体外表面蛋白的种类分析
两歧双歧杆菌PRL2010菌体外表面蛋白的种类分析结果见表1。分析结果显示，两歧双歧杆菌PRL2010基因组编码的1 706个蛋白中，暴露于菌体外表面蛋白共计260个，占基因组蛋白比例为15.2%。在这些蛋白中，定位于细胞膜的蛋白数目最多，达182个，占基因组蛋白比例为10.7%，这些跨膜螺旋数的膜蛋白分布见图1。 外表面蛋白的膜蛋白中，具有1个跨膜螺旋数的蛋白最多（87个），其次是具有2个和3个跨膜螺旋数的蛋白，分别为23个和16个。
2.2 两歧双歧杆菌PRL2010菌体外表面蛋白的功能分析
两歧双歧杆菌PRL2010基因组预测的外表面蛋白功能分析结果见图2。两歧双歧杆菌PRL2010菌体外表面蛋白数目为260个。从图2可以看出，在这些蛋白中，含有较大比例的蛋白没有功能注释（128个），132个蛋白具有COG功能注释。在有具体功能注释的蛋白中，所占比例较大的是与细胞壁、细胞膜生物合成有关（17个）；与无机离子转运与代谢有关（12个）、与防御机制有关（12个）、与碳水化合物转运与代谢有关（11个）、与氨基酸转运与代谢有关（8个）等。功能聚类分析结果表明菌体外表面蛋白与这些功能有关。
3 讨论与结论
细菌外表面的数量和种类与微生物的特性和生长环境有着密切的联系，特别
是与宿主之间的相互作用，如根癌土壤杆菌，它是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性菌，植物根的表面依靠由根组织渗透出来的营养物质进行生存[12]；再如马铃薯晚疫病菌是引起马铃薯和西红柿晚疫病的病原菌，其生存环境主要是植物体内，分析发现潜在的分泌到细胞外蛋白为671个，占基因组蛋白总数的3%。由于越来越多菌株全基因组测序的完成，采用基因组编码蛋白序列預测细菌外表面蛋白成为可能。最早预测革兰氏阳性菌外表面蛋白的方法是SurfG+，但该方法里面的一些程序网上不一定能随时获得，另外它主要用于预测革兰氏阳性菌。Perry等[11]于2013年提出了Inmembrane的分析方法，该方法对SurfG+方法进行了完善和补充，程序很容易网上在线获取，并且可以对革兰氏阴性菌进行预测分析。
该研究预测分析得到的两歧双歧杆菌PRL2010 260个外表面蛋白中，132个蛋白没有功能注释，这部分蛋白还需要进行进一步的功能研究和注释。在有功能注释的蛋白中，所占比例较大的是与细胞壁、细胞膜生物合成有关；与无机离子转运与代谢有关；与防御机制有关；与碳水化合物转运与代谢有关、与氨基酸转运与代谢有关。功能分析結果表明菌体外表面蛋白在营养物质交换、环境适应、细胞稳定性方面发挥重要作用。该研究获得的结果将对今后研究两歧双歧杆菌PRL2010与宿主作用的分子机制提供标靶，同时，也为益生菌领域的研究发展及应用分析提供数据基础。
参考文献
[1] SERAFINI F，STRATI F，RUASMADIEDO P，et al.Evaluation of adhesion properties and antibacterial activities of the infant gut commensal Bifidobacterium bifidum PRL2010 [J].Anaerobe，2013，21：9-17.
[2] ZANOTTI I，TURRONI F，PIEMONTESE A，et al.Evidence for cholesterollowering activity by Bifidobacterium bifidum PRL2010 through gut microbiota modulation[J].Appl Microbiol Biotechnol，2015，99（16）：6813- 6829.
[3] TURRONI F，TAVERNITI V，RUASMADIEDO P，et al.Bifidobacterium bifidum PRL2010 modulates the host innate immune response[J].Applied and environmental microbiology，2014，80（2）：730-740.
[4] LIU C，ZHANG Z Y，DONG K，et al.Adhesion and immunomodulatory effects of Bifidobacterium lactis HN019 on intestinal epithelial cells INT407[J].World journal of gastroenterology，2010，16（18）：2283-2290.
[5] GILAD O，SVENSSON B，VIBORG A H，et al.The extracellular proteome of Bifidobacterium animalis subsp.lactis BB-12 reveals proteins with putative roles in probiotic effects[J].Proteomics，2011，11（12）：2503-2514.
[6] TURRONI F，BOTTACINI F，FORONI E，et al.Genome analysis of Bifidobacterium bifidum PRL2010 reveals metabolic pathways for hostderived glycan foraging[J].Proceedings of the national academy of sciences of the united states of america，2010，107（45）：19514-19519.
[7] 赵文杰，曾嘉，柳建设，等.嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因组分泌蛋白的初步分析[J].现代生物医学进展，2008，8（1）：22-26.
[8] 周晓罡，侯思名，陈铎文，等.马铃薯晚疫病菌全基因组分泌蛋白的初步分析[J].遗传，2011，33（7）：785-793.
[9] 周晓罡，李成云，赵之伟，等.粗糙脉孢菌基因组分泌蛋白的初步分析[J].遗传，2006，28（2）：200-207.
[10] BARINOV A，LOUX V，HAMMANI A，et al.Prediction of surface exposed proteins in Streptococcus pyogenes，with a potential application to other Grampositive bacteria[J].Proteomics，2009，9（1）：61-73.
[11] PERRY A J，HO B K.Inmembrane，a bioinformatic workflow for annotation of bacterial cellsurface proteomes[J].Source code for biology and medicine，2013，8（1）：9.
[12] 范成明，李成云，赵明富，等.根癌土壤杆菌C58 Cereon中分泌蛋白信号肽分析[J].微生物学报，2005，45（4）：561-566.