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【中图分类号】R284.2 【文献标识码】A 【文章编号】1550-1868（2015）03
【摘要】目的：研究黄芩中黄酮类药效部位的大孔树脂纯化工艺。方法：以黄酮类药效部位含量为指标，考察大孔树脂静态吸附、解吸试验和动态吸附、解吸试验工艺参数。结果：D101型大孔吸附树脂对黄酮类药效部位的适宜纯化工艺条件为：上柱液浓度为0.5 g·mL-1，吸附流速为3 mL·min-1，洗脱流速为10 mL·min-1，水洗脱体积为3BV，70%乙醇洗脱体积为7BV。结论：该法简单可行，适合工业生产。
【关键词】黄酮类；大孔吸附树脂；纯化
黄芩是唇形科植物Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，主要药效成分黄芩苷具有抑菌、清热、降压、镇静、抗炎等作用[1]，大孔树脂是60年代发展起来的新型吸附剂，是继离子交换树脂之后又一新兴介质。近年来广发应用于天然植物中活性成分，如皂苷、黄酮、内酯、生物碱等大分子化合物的提取分离[2]。
1仪器与试药
UV-2400紫外分光光度计（日本岛津）；玻璃层析柱；RE52A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；大孔吸附树脂D-101、D-201（天津市海光化工有限公司）、HPD-100、HPD-400、HPD-600（沧州宝恩化工有限公司）、X-5、AB-8、NKA-9（天津南开大学化工厂）、黄芩苷（批号 110749-200613）购自中国药品生物制品鉴定所
2方法与结果
2.1上柱液的制备
取黄芩药材粉碎成10目粗粉，以80%乙醇回流提取2次，每次加入8倍量溶媒，各回流2h，滤过，合并滤液，60℃减压浓缩至2.0 g·mL-1，加入8.5倍乙醇充分搅拌，静置12 h，将上清液于60℃减压浓缩至无醇味，减压浓缩至1.5 g·mL-1。
2.2线性关系考察
精密称取黄芩苷对照品4.5 mg于50mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，得到0.09 mg·mL-1的对照品溶液；分别吸取对照品溶液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL于50mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，在278 nm处用紫外分光光度仪测吸光度。以浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标作图。经线性回归分析，得标准曲线回归方程为：Y=101.22X+0.0244r=0.9994n=5。
2.3树脂的预处理
D-101、D-201、HPD-100、X-5、HPD-400、AB-8、HPD-600、NKA-9大孔吸附树脂以95%乙醇浸泡24 h后，装入树脂柱，用95 %乙醇洗脱至流出液与水1：1混合时不产生白色浑浊，再用蒸馏水冲洗至无醇味即可。
2.4树脂的静态吸附与解吸试验
选取8种经预处理的湿态树脂5 g，置100 mL具塞锥形瓶中，取上样液适量加入瓶中，于25℃振荡24 h，吸附平衡后，滤过，定量移取清液，计算吸附率；将抽滤后的湿树脂倒回100 mL的具塞锥形瓶中，加入40 mL体积分数95%乙醇，25℃振荡24 h，滤过，定量移取清液，计算解吸率，结果见表1。
D101对黄芩苷的吸附效果好，结合树脂成本综合考虑，选择D101型大孔吸附树脂。
2.5树脂的动态吸附与解吸试验
2.5.1 上样吸附参数考察
2.5.1.1 树脂吸附容量选择
将0.5 mg·mL-1的上样液装入15g树脂柱中，流速为5mL·min-1 ，测定流出液中黄酮类药效部位浓度，直至树脂吸附饱和为止，绘制吸附曲线，见图1。
图1 黄酮类药效部位吸附曲线
由图2可见，在转折点处流出液体积为490 mL，计算结果大孔树脂吸附容量为16.00mg·g-1。
2.5.1.2上样液浓度
取上柱液30ml共5份，分别稀释至（0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mg·mL-1）分别通过树脂柱，以5 mL·min-1的流速进行动态吸附，水洗至无色，70%乙醇洗脱，收集洗脱液，按以下公式计算比吸附量。
比吸附量=（M上-M残-M水洗）/W
M上、M残、M水洗分别为上柱液、流出液、水洗脱液中黄酮类药效部位的含量；W为树脂量（mL）。
结果黄酮类药效部位比吸附量分别为3.75、4.12、4.79、4.82、4.83 g·mL-1比吸附量随上样液浓度的增加而增加； 浓度大于0.5 g·mL-1后， 比吸附量增加不显著，故选择上样液浓度0.5 g·mL-1。
2.5.2 树脂解吸参数考察
2.5.2.1水洗脱条件的选择
精密量取30mL上樣液6份，分别上预先处理好的大孔树脂柱，控制流速l～2mL·min-1，过柱流出液重吸附一次，吸附1h后，以蒸馏水洗脱，分段收集。以苯酚-硫酸法检测洗脱终点，并以TLC检测各流出液中黄酮类药效部位是否泄漏。结果表明，以3倍柱体积（BV）量水洗脱即可将多糖类成分洗脱完全，同时未造成黄酮类药效部位泄漏。
2.5.2.2乙醇洗脱条件的选择
取水洗脱后大孔树脂柱，分别以（30、50、70、95）%乙醇洗脱，每10mL分收集，测定黄酮类药效部位含量，结果如图2。
图2 乙醇体积分数对洗脱效果的影响
由图4可见，用30%乙醇和50%乙醇洗脱时，曲线有明显拖尾，耗时长，洗脱峰宽而低；用70%乙醇和95%乙醇洗脱时，曲线洗脱峰高而集中；虽然用95%乙醇，洗脱速度更快，但也容易将其它杂质洗脱下来。因此，选择70%乙醇作洗脱剂效果较好。
2.5.2.3洗脱流速的选择
以3mL·min-1的流速吸附后，用70%乙醇洗脱，每10mL分收集，测定黄酮类药效部位含量，考察流速对洗脱效果的影响，结果见图3。
图3 黄酮类药效部位洗脱流速曲线
由图5可见，高流速的洗脱曲线存在非常明显的拖尾现象，洗脱峰不集中，原因是高流速下洗脱剂没有与树脂进行非常充分的物质交换，因此黄酮类药效部位在低流速下洗脱比较好。但是洗脱流速如果太低，会使洗脱溶剂挥发严重且耗时过长。综合考虑，选择10 mL·min-1的洗脱速度为宜。
3验证试验
按上述所选定的吸附和洗脱条件，即选用D101大孔树脂，上柱液浓度为0.5 g·mL-1，所用柱径高为1∶5 ，树脂吸附容量为16.34mg·g-1，洗脱流速为10 mL·min-1，水洗脱体积为3BV，70%乙醇洗脱体积为7BV。平行制备3份，然后测定黄酮类药效部位吸附率、解吸率、及醇洗脱物中黄酮类药效部位含量，结果见表2。
4结果与讨论
综合上述实验研究，黄芩中黄酮类药效部位的大孔树脂纯化工艺归纳为：选用D101大孔树脂，上柱液浓度为0.5 g·mL-1，所用柱径高为1：5 ，树脂吸附容量为16.34mg·g-1，洗脱流速为10 mL·min-1，水洗脱体积为3BV，70%乙醇洗脱体积为7BV。在此条件下，用D101型大孔吸附树脂纯化黄芩中黄酮类药效部位，吸附率平均为83%，解吸率平均为87%，醇洗脱物中黄酮类药效部位含量平均为75%。
黄芩中的主要药效部位为黄酮苷类成分。为研究开发药效明显，剂量小、起效快的中药制剂，有必要对其药效部位进行纯化[3]。本文建立的D101大孔吸附树脂纯化黄芩中黄酮苷类成分的方法，具有操作简便、重现性好、消耗少、树脂再生处理方便、所得药效部位含量高等优点，具有较好的推广应用前景。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中国药典.I部[S].北京：化学工业出版社：2010：211
[2]刘瑞源，钟平.大孔吸附树脂提取中药有效成分的研究进展[J].时珍国医国药，2004，15（6）：2
[3]周德庆，曾骆.黄芩总黄酮的提取工艺研究[J].华西药学院杂志.2002，18（1）：78
【摘要】目的：研究黄芩中黄酮类药效部位的大孔树脂纯化工艺。方法：以黄酮类药效部位含量为指标，考察大孔树脂静态吸附、解吸试验和动态吸附、解吸试验工艺参数。结果：D101型大孔吸附树脂对黄酮类药效部位的适宜纯化工艺条件为：上柱液浓度为0.5 g·mL-1，吸附流速为3 mL·min-1，洗脱流速为10 mL·min-1，水洗脱体积为3BV，70%乙醇洗脱体积为7BV。结论：该法简单可行，适合工业生产。
【关键词】黄酮类；大孔吸附树脂；纯化
黄芩是唇形科植物Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，主要药效成分黄芩苷具有抑菌、清热、降压、镇静、抗炎等作用[1]，大孔树脂是60年代发展起来的新型吸附剂，是继离子交换树脂之后又一新兴介质。近年来广发应用于天然植物中活性成分，如皂苷、黄酮、内酯、生物碱等大分子化合物的提取分离[2]。
1仪器与试药
UV-2400紫外分光光度计（日本岛津）；玻璃层析柱；RE52A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；大孔吸附树脂D-101、D-201（天津市海光化工有限公司）、HPD-100、HPD-400、HPD-600（沧州宝恩化工有限公司）、X-5、AB-8、NKA-9（天津南开大学化工厂）、黄芩苷（批号 110749-200613）购自中国药品生物制品鉴定所
2方法与结果
2.1上柱液的制备
取黄芩药材粉碎成10目粗粉，以80%乙醇回流提取2次，每次加入8倍量溶媒，各回流2h，滤过，合并滤液，60℃减压浓缩至2.0 g·mL-1，加入8.5倍乙醇充分搅拌，静置12 h，将上清液于60℃减压浓缩至无醇味，减压浓缩至1.5 g·mL-1。
2.2线性关系考察
精密称取黄芩苷对照品4.5 mg于50mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，得到0.09 mg·mL-1的对照品溶液；分别吸取对照品溶液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL于50mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，在278 nm处用紫外分光光度仪测吸光度。以浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标作图。经线性回归分析，得标准曲线回归方程为：Y=101.22X+0.0244r=0.9994n=5。
2.3树脂的预处理
D-101、D-201、HPD-100、X-5、HPD-400、AB-8、HPD-600、NKA-9大孔吸附树脂以95%乙醇浸泡24 h后，装入树脂柱，用95 %乙醇洗脱至流出液与水1：1混合时不产生白色浑浊，再用蒸馏水冲洗至无醇味即可。
2.4树脂的静态吸附与解吸试验
选取8种经预处理的湿态树脂5 g，置100 mL具塞锥形瓶中，取上样液适量加入瓶中，于25℃振荡24 h，吸附平衡后，滤过，定量移取清液，计算吸附率；将抽滤后的湿树脂倒回100 mL的具塞锥形瓶中，加入40 mL体积分数95%乙醇，25℃振荡24 h，滤过，定量移取清液，计算解吸率，结果见表1。
D101对黄芩苷的吸附效果好，结合树脂成本综合考虑，选择D101型大孔吸附树脂。
2.5树脂的动态吸附与解吸试验
2.5.1 上样吸附参数考察
2.5.1.1 树脂吸附容量选择
将0.5 mg·mL-1的上样液装入15g树脂柱中，流速为5mL·min-1 ，测定流出液中黄酮类药效部位浓度，直至树脂吸附饱和为止，绘制吸附曲线，见图1。
图1 黄酮类药效部位吸附曲线
由图2可见，在转折点处流出液体积为490 mL，计算结果大孔树脂吸附容量为16.00mg·g-1。
2.5.1.2上样液浓度
取上柱液30ml共5份，分别稀释至（0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mg·mL-1）分别通过树脂柱，以5 mL·min-1的流速进行动态吸附，水洗至无色，70%乙醇洗脱，收集洗脱液，按以下公式计算比吸附量。
比吸附量=（M上-M残-M水洗）/W
M上、M残、M水洗分别为上柱液、流出液、水洗脱液中黄酮类药效部位的含量；W为树脂量（mL）。
结果黄酮类药效部位比吸附量分别为3.75、4.12、4.79、4.82、4.83 g·mL-1比吸附量随上样液浓度的增加而增加； 浓度大于0.5 g·mL-1后， 比吸附量增加不显著，故选择上样液浓度0.5 g·mL-1。
2.5.2 树脂解吸参数考察
2.5.2.1水洗脱条件的选择
精密量取30mL上樣液6份，分别上预先处理好的大孔树脂柱，控制流速l～2mL·min-1，过柱流出液重吸附一次，吸附1h后，以蒸馏水洗脱，分段收集。以苯酚-硫酸法检测洗脱终点，并以TLC检测各流出液中黄酮类药效部位是否泄漏。结果表明，以3倍柱体积（BV）量水洗脱即可将多糖类成分洗脱完全，同时未造成黄酮类药效部位泄漏。
2.5.2.2乙醇洗脱条件的选择
取水洗脱后大孔树脂柱，分别以（30、50、70、95）%乙醇洗脱，每10mL分收集，测定黄酮类药效部位含量，结果如图2。
图2 乙醇体积分数对洗脱效果的影响
由图4可见，用30%乙醇和50%乙醇洗脱时，曲线有明显拖尾，耗时长，洗脱峰宽而低；用70%乙醇和95%乙醇洗脱时，曲线洗脱峰高而集中；虽然用95%乙醇，洗脱速度更快，但也容易将其它杂质洗脱下来。因此，选择70%乙醇作洗脱剂效果较好。
2.5.2.3洗脱流速的选择
以3mL·min-1的流速吸附后，用70%乙醇洗脱，每10mL分收集，测定黄酮类药效部位含量，考察流速对洗脱效果的影响，结果见图3。
图3 黄酮类药效部位洗脱流速曲线
由图5可见，高流速的洗脱曲线存在非常明显的拖尾现象，洗脱峰不集中，原因是高流速下洗脱剂没有与树脂进行非常充分的物质交换，因此黄酮类药效部位在低流速下洗脱比较好。但是洗脱流速如果太低，会使洗脱溶剂挥发严重且耗时过长。综合考虑，选择10 mL·min-1的洗脱速度为宜。
3验证试验
按上述所选定的吸附和洗脱条件，即选用D101大孔树脂，上柱液浓度为0.5 g·mL-1，所用柱径高为1∶5 ，树脂吸附容量为16.34mg·g-1，洗脱流速为10 mL·min-1，水洗脱体积为3BV，70%乙醇洗脱体积为7BV。平行制备3份，然后测定黄酮类药效部位吸附率、解吸率、及醇洗脱物中黄酮类药效部位含量，结果见表2。
4结果与讨论
综合上述实验研究，黄芩中黄酮类药效部位的大孔树脂纯化工艺归纳为：选用D101大孔树脂，上柱液浓度为0.5 g·mL-1，所用柱径高为1：5 ，树脂吸附容量为16.34mg·g-1，洗脱流速为10 mL·min-1，水洗脱体积为3BV，70%乙醇洗脱体积为7BV。在此条件下，用D101型大孔吸附树脂纯化黄芩中黄酮类药效部位，吸附率平均为83%，解吸率平均为87%，醇洗脱物中黄酮类药效部位含量平均为75%。
黄芩中的主要药效部位为黄酮苷类成分。为研究开发药效明显，剂量小、起效快的中药制剂，有必要对其药效部位进行纯化[3]。本文建立的D101大孔吸附树脂纯化黄芩中黄酮苷类成分的方法，具有操作简便、重现性好、消耗少、树脂再生处理方便、所得药效部位含量高等优点，具有较好的推广应用前景。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中国药典.I部[S].北京：化学工业出版社：2010：211
[2]刘瑞源，钟平.大孔吸附树脂提取中药有效成分的研究进展[J].时珍国医国药，2004，15（6）：2
[3]周德庆，曾骆.黄芩总黄酮的提取工艺研究[J].华西药学院杂志.2002，18（1）：78