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[摘要]目的：探讨SKI基因257C＞G多态与中国华东地区部分人群非综合征性唇腭裂(NSCL/P)发生的关系。方法：采用病例对照设计，应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）,进行SKI基因257C＞G多态性检测,并进行遗传统计分析。结果：对于SKI基因257C＞G,8个杂合子父母及患儿的核心家庭TDT 检验(χ2=3.56,P＞0.05)；50例NSCL/P 患儿和50例正常儿童基因型及等位基因频数病例对照研究(χ2= 2.08,P＞0.05)。 结论：SKI基因257C＞G位点多态与中国华东地区部分人群NSCL/P 的发生无相关性，可能不是NSCL/P的主要易感基因。
[关键词]非综合征性唇腭裂；基因多态性；SKI基因
[中图分类号]R782.2[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）03-03
Relationship between nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate and genetic polymorphisms of SKI
GAO Xia, LIU Jia-yin,CUI Yu-gui,ZHOU Xiao-ping, WAN Wei-dong
(Department of Plastic Surgery,Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University, Nanjing 210009,Jiangsu,China)
Abstract:ObjectiveTo explore the relationship between nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P) and genetic polymorphism of SKI in Chinese population. MethodsCase-control study design was employed. SKI genotypes were determined by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism t echniques ( PCR－RFLP).ResultsAs to SKI 257C>G, 8 heterozygous parents with an affected child were analyzed through case-parental control study using TDT (χ2= 3.56, P>0.05) . The genotype frequency and allele frequency of 50 NSCL/P cases and 50 controls were analyzed through case-control study (χ2= 2.08, P>0. 05).ConclusionThe genetic polymorphism of SKI 257C＞G is not associated with the development of NSCL/P, and the genetic polymorphism of SKI is not a risk factor for NSCL/P in the Chinese population.
Key words: nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate;genetic polymorphism;SKI
非综合征性唇腭裂(nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate,NSCL/P) 是指不伴发其他系统器官畸形的不在综合征之内的唇裂、唇裂合并腭裂或单纯腭裂的总称。NSCL/P 发病原因仍不明确。目前研究认为是一种多基因易感性疾病,环境及遗传因素共同作用引起发病[1-2]。文献报道与NSCL/P 相关的基因达20余个。SKI基因是其中之一。但SKI基因与NSCL/P 畸形发生的相关研究国内外报道极少。为探讨中国人群SKI基因多态性与NSCL/P 发生的关系,我们应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）对50例NSCL/P患者SKI基因257C＞G多态位点进行了遗传研究分析。
1资料和方法
1.1 临床资料：选自50个核心家庭,共50 例患儿,均为东南大学附属中大医院整形外科住院手术的唇腭裂畸形患者,其中唇裂15例,唇裂合并腭裂35例,并排除了其他系统畸形或综合征之内的唇腭裂病例。对照组50例儿童均为南京市儿童医院“上感”就诊患者，排除了综合征或非综合征性唇腭裂畸形。两组儿童均来自中国江苏和安徽地区,均为汉族，年龄，性别分布也无差异。
1.2基因多态性检测
1.2.1 样本采集：抽取患儿及父母，对照儿童外周静脉血2ml,EDTA 抗凝。
1.2.2 DNA 提取：按PUREGENE DNA 纯化试剂盒的说明书 （美国GENTRA公司）抽提外周血白细胞基因组DNA。
1.2.3 PCR 扩增：扩增引物由上海英骏生物公司合成,引物序列为 F5′-AGA AGA CGC TGG AGC AGT TC-3′R 5′-GGT CGG ACG GCA TGA AGA AG-3′。SKI基因257C＞G反应体系：总反应体系50μl,其中上下游引物各2μl(10 pmolPμl),2×Pfu PCR Master Mix 25μl ,ddH2O 13μl ,模板DNA 2μl(100μgPμl),DMSO 6μl.PCR 反应条件：94℃变性3min,PCR循环条件为94℃30 min、58℃30min、72℃2min,共30个循环,最后72 ℃延伸5min。1.5%琼脂糖凝胶电泳,EB 染色检测PCR 扩增结果(图1) 。
1.2.4 扩增产物PCR-RFLP分析：限制性内切酶Ehe I酶切消化SKI基因257C＞G PCR扩增产物,共30μl,其中PCR 扩增产物20μl,10×Buffer Tango 2μl,nuclease free Water 7μl,Ehe Ⅰ酶1μl,37 ℃酶解5h。4%琼脂糖凝胶电泳。分析记录基因型（图2）。
1.3 统计分析：配对资料的McNemer 检验,计算传递失衡指数(transmitted disequillibrium test,TDT)；NSCL/P患儿与正常儿童基因型构成及等位基因频数的比较。
2结果
2.1 SKI基因扩增结果和基因型分析：SKI基因257C＞G扩增目的片段为234bp,EheⅠ酶切后,257C＞G野生型产生2个片段,长度为101,133bp；C →G 后失去一个酶切位点,因此,纯和突变型257C＞G 产生1 个片段,长度为234bp，杂合突变型257C＞G 产生3个片段,长度为234，101，133bp。
2.2 计算传递失衡指数(TDT)：以患儿染色体等位基因为病例,以父母未传递给患儿的一对等位基因为对照,进行1∶1 配对的病例对照研究。TDT(χ2)=3.56，P＞0.05.
2.3 NSCL/P 患儿与正常儿童基因型及等位基因频数的比较分别记录患儿和正常对照儿童的SKI基因257C＞G基因型,进一步计算等位基因频数,各组间比较,SKI基因257C＞G的 χ2=2.08,P>0.05。差异无统计学意义（表2）。
3讨论
非综合征性唇腭裂是一种常见的先天性颜面部缺陷，其发病率因国家、地区、种族的不同而有所不同,从1/500到1/2500[3]不等，其中亚洲和美洲人群发病率最高,欧洲人群居中,非洲人群最低。在中国，NSCL/P是一种常见的先天畸形，在头面部先天畸形中位居首位。该畸形的出现影响患儿正常的生理、心理发育，给患儿的父母带来沉重的心理和经济负担。目前，该病的发病原因尚处于研究阶段。现在认为,非综合征性唇腭裂是一种多基因易感性疾病。而SKI基因正是众多易感基因中的一种。
1986年，Stavnezer E等[4]从感染了禽白血病转化缺陷病毒Bratislava 77的鸡胚胎细胞分离出来的一组逆转录病毒－SKV病毒。通过溶解和点杂交发现众多的SKV病毒中包含了一段共同序列，既是v-SKI。SKI基因位于人类1q22-1q24，是一种原癌基因，属于myc家族。SKI基因编码核内DNA结合蛋白，可通过调节或诱导其它与面部结构形成有关的因子的转录作用，间接控制面部畸形的产生。Colmenares C.等[5]认为SKI通过调节两组因子的转录来控制唇腭裂的发生。第一组是Rara/Rarg（视黄素受体家族基因）和TGF（转化生长因子）。第二组是MSX2 和BMP4。这两组基因都已被证明和唇腭裂的发生有一定的相关性。SKI基因虽然在颅颌面结构的形成起重要作用，但该基因的缺失或突变，是否导致NSCL/P畸形发生的相关研究国内外报道极少。
我们对中国江苏和安徽地区50例NSCL/P 核心家庭计算传递失衡指数(TDT) ,结果显示SKI 基因257C＞G 在50例NSCL/P 核心家庭中不存在遗传失衡现象。对50 例患儿与50例正常儿童SKI 基因257C＞G的基因型及等位基因频数进行比较表明, SKI 基因257C＞G两个等位基因频率在两组人群中分布也无明显差异。上述结果提示，SKI基因257C＞G位点多态可能与中国华东地区部分人群NSCL/P无明显相关性。2005年，Wei Lu等[6]对394位非综合征型唇腭裂病例进行SKI基因257C＞G多态性分析，结果显示SKI基因257C＞G可以降低NSCL/P的发生风险。这些结果充分说明NSCL/P 的发生原因是非常复杂的。许多研究都已表明，NSCL/P具有多基因遗传的特点，而且与环境因素以及遗传与环境的相互作用有很大的关系[7]。就本次研究而言，SKI基因257C＞G位点多态与中国华东地区部分人群NSCL/P 的发生无相关性，可能不是NSCL/P的主要易感基因。
[参考文献]
[1]Prescott NJ,Winter RM,Malcolm S.Nonsyndromic cleft lip and palate: complex genetics and environmental effects[J].Ann Hum Genet,2001,65:505-515.
[2]Vieira AR,Orioli IM.Candidate genes for nonsyndromic cleft lip and palate[J].ASDCJ Dent Child,2001,68:272-279,229.
[3]Wyszynski DF, Diehl SR. Infant C677T mutation in MTHFR,maternal periconceptional vitamin use, and risk of nonsyndromic cleft lip[J].Am J Med Genet,2000,92:79-80.
[4]Li Y, Turck CM,Stavnezer E.Unique sequence, SKI, in Sloan-Kettering avian retroviruses with properties of a new cell-derived oncogene[J]. J Virol,1986,57(3):1065-1072.
[5]Colmenares C, Heilstedt HA,ShaVer LG, et al. Loss of the SKI proto-oncogene inindividuals affected with 1p36 deletion syndrome is predicted by strain-dependent defects in SKI－/－mice[J]. Nat Genet,2002,30:106-109.
[6]Wei Lu,Kelly Volcik.Genetic variation in the proto-oncogene SKI and risk for orofacial clefting[J].Molecular Genetics and Metabolism,2005，86:412-416.
[7]Christensen K,Olsen J,Norgaard-Pedersen B,et al.Oralcleft,transforming growth factor alpha gene variants, and maternal smoking:a population-based case-control study in Denmark,1991-1994[J].Am J Epidemiol,1999,149:248-255.
[收稿日期]2007-11-29[修回日期]2008-02-28
编辑/张惠娟
[关键词]非综合征性唇腭裂；基因多态性；SKI基因
[中图分类号]R782.2[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）03-03
Relationship between nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate and genetic polymorphisms of SKI
GAO Xia, LIU Jia-yin,CUI Yu-gui,ZHOU Xiao-ping, WAN Wei-dong
(Department of Plastic Surgery,Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University, Nanjing 210009,Jiangsu,China)
Abstract:ObjectiveTo explore the relationship between nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P) and genetic polymorphism of SKI in Chinese population. MethodsCase-control study design was employed. SKI genotypes were determined by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism t echniques ( PCR－RFLP).ResultsAs to SKI 257C>G, 8 heterozygous parents with an affected child were analyzed through case-parental control study using TDT (χ2= 3.56, P>0.05) . The genotype frequency and allele frequency of 50 NSCL/P cases and 50 controls were analyzed through case-control study (χ2= 2.08, P>0. 05).ConclusionThe genetic polymorphism of SKI 257C＞G is not associated with the development of NSCL/P, and the genetic polymorphism of SKI is not a risk factor for NSCL/P in the Chinese population.
Key words: nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate;genetic polymorphism;SKI
非综合征性唇腭裂(nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate,NSCL/P) 是指不伴发其他系统器官畸形的不在综合征之内的唇裂、唇裂合并腭裂或单纯腭裂的总称。NSCL/P 发病原因仍不明确。目前研究认为是一种多基因易感性疾病,环境及遗传因素共同作用引起发病[1-2]。文献报道与NSCL/P 相关的基因达20余个。SKI基因是其中之一。但SKI基因与NSCL/P 畸形发生的相关研究国内外报道极少。为探讨中国人群SKI基因多态性与NSCL/P 发生的关系,我们应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）对50例NSCL/P患者SKI基因257C＞G多态位点进行了遗传研究分析。
1资料和方法
1.1 临床资料：选自50个核心家庭,共50 例患儿,均为东南大学附属中大医院整形外科住院手术的唇腭裂畸形患者,其中唇裂15例,唇裂合并腭裂35例,并排除了其他系统畸形或综合征之内的唇腭裂病例。对照组50例儿童均为南京市儿童医院“上感”就诊患者，排除了综合征或非综合征性唇腭裂畸形。两组儿童均来自中国江苏和安徽地区,均为汉族，年龄，性别分布也无差异。
1.2基因多态性检测
1.2.1 样本采集：抽取患儿及父母，对照儿童外周静脉血2ml,EDTA 抗凝。
1.2.2 DNA 提取：按PUREGENE DNA 纯化试剂盒的说明书 （美国GENTRA公司）抽提外周血白细胞基因组DNA。
1.2.3 PCR 扩增：扩增引物由上海英骏生物公司合成,引物序列为 F5′-AGA AGA CGC TGG AGC AGT TC-3′R 5′-GGT CGG ACG GCA TGA AGA AG-3′。SKI基因257C＞G反应体系：总反应体系50μl,其中上下游引物各2μl(10 pmolPμl),2×Pfu PCR Master Mix 25μl ,ddH2O 13μl ,模板DNA 2μl(100μgPμl),DMSO 6μl.PCR 反应条件：94℃变性3min,PCR循环条件为94℃30 min、58℃30min、72℃2min,共30个循环,最后72 ℃延伸5min。1.5%琼脂糖凝胶电泳,EB 染色检测PCR 扩增结果(图1) 。
1.2.4 扩增产物PCR-RFLP分析：限制性内切酶Ehe I酶切消化SKI基因257C＞G PCR扩增产物,共30μl,其中PCR 扩增产物20μl,10×Buffer Tango 2μl,nuclease free Water 7μl,Ehe Ⅰ酶1μl,37 ℃酶解5h。4%琼脂糖凝胶电泳。分析记录基因型（图2）。
1.3 统计分析：配对资料的McNemer 检验,计算传递失衡指数(transmitted disequillibrium test,TDT)；NSCL/P患儿与正常儿童基因型构成及等位基因频数的比较。
2结果
2.1 SKI基因扩增结果和基因型分析：SKI基因257C＞G扩增目的片段为234bp,EheⅠ酶切后,257C＞G野生型产生2个片段,长度为101,133bp；C →G 后失去一个酶切位点,因此,纯和突变型257C＞G 产生1 个片段,长度为234bp，杂合突变型257C＞G 产生3个片段,长度为234，101，133bp。
2.2 计算传递失衡指数(TDT)：以患儿染色体等位基因为病例,以父母未传递给患儿的一对等位基因为对照,进行1∶1 配对的病例对照研究。TDT(χ2)=3.56，P＞0.05.
2.3 NSCL/P 患儿与正常儿童基因型及等位基因频数的比较分别记录患儿和正常对照儿童的SKI基因257C＞G基因型,进一步计算等位基因频数,各组间比较,SKI基因257C＞G的 χ2=2.08,P>0.05。差异无统计学意义（表2）。
3讨论
非综合征性唇腭裂是一种常见的先天性颜面部缺陷，其发病率因国家、地区、种族的不同而有所不同,从1/500到1/2500[3]不等，其中亚洲和美洲人群发病率最高,欧洲人群居中,非洲人群最低。在中国，NSCL/P是一种常见的先天畸形，在头面部先天畸形中位居首位。该畸形的出现影响患儿正常的生理、心理发育，给患儿的父母带来沉重的心理和经济负担。目前，该病的发病原因尚处于研究阶段。现在认为,非综合征性唇腭裂是一种多基因易感性疾病。而SKI基因正是众多易感基因中的一种。
1986年，Stavnezer E等[4]从感染了禽白血病转化缺陷病毒Bratislava 77的鸡胚胎细胞分离出来的一组逆转录病毒－SKV病毒。通过溶解和点杂交发现众多的SKV病毒中包含了一段共同序列，既是v-SKI。SKI基因位于人类1q22-1q24，是一种原癌基因，属于myc家族。SKI基因编码核内DNA结合蛋白，可通过调节或诱导其它与面部结构形成有关的因子的转录作用，间接控制面部畸形的产生。Colmenares C.等[5]认为SKI通过调节两组因子的转录来控制唇腭裂的发生。第一组是Rara/Rarg（视黄素受体家族基因）和TGF（转化生长因子）。第二组是MSX2 和BMP4。这两组基因都已被证明和唇腭裂的发生有一定的相关性。SKI基因虽然在颅颌面结构的形成起重要作用，但该基因的缺失或突变，是否导致NSCL/P畸形发生的相关研究国内外报道极少。
我们对中国江苏和安徽地区50例NSCL/P 核心家庭计算传递失衡指数(TDT) ,结果显示SKI 基因257C＞G 在50例NSCL/P 核心家庭中不存在遗传失衡现象。对50 例患儿与50例正常儿童SKI 基因257C＞G的基因型及等位基因频数进行比较表明, SKI 基因257C＞G两个等位基因频率在两组人群中分布也无明显差异。上述结果提示，SKI基因257C＞G位点多态可能与中国华东地区部分人群NSCL/P无明显相关性。2005年，Wei Lu等[6]对394位非综合征型唇腭裂病例进行SKI基因257C＞G多态性分析，结果显示SKI基因257C＞G可以降低NSCL/P的发生风险。这些结果充分说明NSCL/P 的发生原因是非常复杂的。许多研究都已表明，NSCL/P具有多基因遗传的特点，而且与环境因素以及遗传与环境的相互作用有很大的关系[7]。就本次研究而言，SKI基因257C＞G位点多态与中国华东地区部分人群NSCL/P 的发生无相关性，可能不是NSCL/P的主要易感基因。
[参考文献]
[1]Prescott NJ,Winter RM,Malcolm S.Nonsyndromic cleft lip and palate: complex genetics and environmental effects[J].Ann Hum Genet,2001,65:505-515.
[2]Vieira AR,Orioli IM.Candidate genes for nonsyndromic cleft lip and palate[J].ASDCJ Dent Child,2001,68:272-279,229.
[3]Wyszynski DF, Diehl SR. Infant C677T mutation in MTHFR,maternal periconceptional vitamin use, and risk of nonsyndromic cleft lip[J].Am J Med Genet,2000,92:79-80.
[4]Li Y, Turck CM,Stavnezer E.Unique sequence, SKI, in Sloan-Kettering avian retroviruses with properties of a new cell-derived oncogene[J]. J Virol,1986,57(3):1065-1072.
[5]Colmenares C, Heilstedt HA,ShaVer LG, et al. Loss of the SKI proto-oncogene inindividuals affected with 1p36 deletion syndrome is predicted by strain-dependent defects in SKI－/－mice[J]. Nat Genet,2002,30:106-109.
[6]Wei Lu,Kelly Volcik.Genetic variation in the proto-oncogene SKI and risk for orofacial clefting[J].Molecular Genetics and Metabolism,2005，86:412-416.
[7]Christensen K,Olsen J,Norgaard-Pedersen B,et al.Oralcleft,transforming growth factor alpha gene variants, and maternal smoking:a population-based case-control study in Denmark,1991-1994[J].Am J Epidemiol,1999,149:248-255.
[收稿日期]2007-11-29[修回日期]2008-02-28
编辑/张惠娟