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摘要 以一株分离自天津七里海湿地野生苇蘑为研究对象，以其菌丝体生物量为主要测量指标，对其菌丝体液体培养基进行优化，首先采用不同碳源、氮源进行单因素初选，再结合正交设计，最终得到其菌丝体最佳液体培养基配方为蔗糖20 g/L，蛋白胨4 g/L，MgSO4·7H2O 15 g/L，KH2PO4 3 g/L，VB1 0.004 g/L，pH值自然。29 ℃培养20 d，菌丝体生物量达到1.980 g/L。
关键词 野生苇蘑；菌丝体；液体培养基；正交设计；生物量
中图分类号 S646.9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）21-0012-03
Abstract A strain of wild weimo isolated from Tianjin Qilihai wetlands was studied in the experiment.The mycelial biomass was choosed as the main index to optimize liquid culture medium of wild weimo mycelium.Firstly，the single factor primary election was conducted with different carbon sources and nitrogen sources，then，in combination with orthogonal design.The optimum liquid nutrient medium was：20 g/L sucrose，4 g/L peptone，1.5 g/L MgSO·7H2O，3 g/L KH2PO4，0.004 g/L vitamin B1，pH natural.Under the condition of dark at 29 ℃，the biomass of mycelium could reach 1.980 g/L after culturing 20 days.
Key words Wild weimo；Mycelium；Liquid nutrient medium；Orthogonal design；Biomass
食用蕈菌的液體培养称为液体发酵[1]，液体发酵法能大大缩短生长周期，实现菌种快速生长，普遍提前10～20 d，且菌龄一致，生长发育均匀一致，接种简便，液体菌种便于接种工作的机械化，适合食用菌的工厂化、标准化生产[2]。目前研究主要集中在苇蘑的抗氧化活性、种属鉴定，对苇蘑菌丝体液体培养基筛选的有关报道较少。以一株采自天津七里海地区的野生蕈菌为研究对象，通过碳氮源单因素初选，并结合L9（34）正交设计[3]，试图筛选出其菌丝体最适液体培养基，实现天津七里海野生苇蘑的可持续合理有序开发利用，提高生物量，为其发酵生产、细胞学育种等进一步研究开发提供物质基础、理论依据和技术支撑，为拯救和恢复该濒危野生蕈菌种质资源提供有力支持[4]。
1 材料与方法
1.1 供试菌种 供试菌株为一株野生苇蘑，采自天津市宁河县七里海湿地保护区，现存于天津师范大学蕈菌研究所。
1.2 试剂
蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蛋白胨（含氮量14.5%）、酵母粉（含氮量9%）、牛肉膏（含氮量117%）、硫酸铵（含氮量99%）、硝酸铵（含氮量99%）、KH2PO4、MgSO4·7H2O、VB1、琼脂粉（上海蓝季），以上均为分析纯，马铃薯、豆粕（含氮量45.4%）。均为市售。
1.3 仪器
YXQ-LS-70A电热压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；Sartorius BS 224S电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；THZ-D台式恒温振荡器，大仓市实验设备厂；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；DHG-9245A电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。
1.4 综合培养基
PDA培养基：马铃薯（浸提液）200 g/L、琼脂粉20 g/L、葡萄糖20 g/L、KH2PO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、VB1 0.01 g/L。现将马铃薯加水煮沸30 min过滤，滤液加入其他药品完全溶解后，121 ℃灭菌20 min，pH自然。
1.5 试验方法
1.5.1 菌种分离培养及活化。
采用组织分离方法获取菌种，将野生苇蘑色泽正常、未受病虫侵害的部分子实体表面杂物清除，并用手术刀将子实体根部切除，再用75%酒精擦拭2次，在无菌条件下，解剖刀、镊子等紫外线消毒后，在酒精灯外焰进行灼烧，冷却后，把供分离部分子实体纵切一分为二，在菌柄与菌盖交接处的组织上用解剖刀切成见方1 cm2小块，用镊子迅速将组织块放在PDA平板内培养7～8 d[5]。将制备的菌种提前4 d活化。无菌条件下接种于综合培养基平板上，29 ℃培养3～4 d备用[6]。
1.5.2 菌丝体液体培养基制备。
从综合培养基上用手术刀挑取约0.5 cm2大小的菌种块，接种在液体培养基液面上（100 mL三角瓶装50 mL液体培养基），每瓶3块，每个水平重复5次，29 ℃恒温培养20 d。
1.5.3 菌丝体干重测量。
滤纸编号（3次重复分别编号）后用电子天平称重，将培养20 d的苇蘑菌丝体培养物抽滤，蒸馏水冲洗3次后，于60 ℃烘箱中烘干2 h至恒重，再次称量。
1.5.4 碳源培养基初选。
在基础培养基中以蛋白胨4 g/L为氮源，C1、C2、C3、C4、C5碳源分别为葡萄糖20 g/L、蔗糖20 g/L、麦芽糖20 g/L、可溶性淀粉10 g/L、马铃薯（浸提液）200 g/L，其他培养基成分为：KH2PO4 3 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB1 0.004 g/L[6-7]（表1）。 1.5.5 氮源培养基初选。苇蘑培养基配方见表2。
1.6 正交试验设计
根据上述菌丝体干重结果，从中选取2个菌丝体生物量较高的碳源和氮源，以及不同浓度梯度的无机盐和VB1，使用L9（34）四因素、三水平进行正交试验，正交因素与水平如表3所示。
2 结果与分析
2.1 碳源差异性对苇蘑菌丝体生长的影响
碳源是蕈菌生长必不可少的营养物质之一，其作用是供应菌丝体生长所需的能量，参与各种代谢，组成菌体细胞的碳架结构[8]。由表4可知，以蔗糖为供试碳源时生物量最多，以马铃薯浸提液为供试碳源时生物量最少。经生物统计学[9]方差分析（表5）F值为3.490，小于F4，10，0.01=5.994，大于F4，10，0.05=3.478，表明在0.01水平上各个碳源对苇蘑菌丝体生物量影响不显著，在0.05水平上其差异显著。根据Duncan检测法可知，在001水平上蔗糖和马铃薯浸提液差异不显著，但和葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉间差异性显著。为获得最终碳源配方，所以选用蔗糖为碳源进行正交试验。
2.2 氮源差异性对野生蕈菌菌丝体生长的影响
氮源是野生蕈菌生长必需的组分之一，其介入合成生物大分子等[10]。由表6可知，有机氮源和无机氮源均可使其菌丝体生长，以酵母粉为供试氮源菌丝体的生物量最多，而以硝酸铵为供试氮源菌丝体生物量最少。同时，发现有机氮源比无机氮源更适合野生
蕈菌菌丝体生长。经生物统计学方差分析（表7）F值为26.231，大于F5，12，0.01=9.888，表明在氮源不相同的情况下苇蘑菌丝体干重呈现显著性差异。应用Duncan检测法检验表明，在0.01水平上酵母粉和其他5种氮源有极显著性差异，所以选取酵母粉做正交试验。
2.3 液体培养基正交试验及理论最佳组合验证
正交试验结果如表8所示，在4个因子中，相较于其他3个因子无机盐的极差（R）最大，蔗糖的极差最小，而无机盐极差越大，表示该因子的改变越能影响试验结果，即无机盐浓度的变化对野生蕈菌菌丝体干重的影响程度最大，蔗糖影响最小[11-12]。同一因素下，K值越大，说明该处理越有利于蕈菌菌丝体生物量的累积，经比较各因素不同的K值可知，蔗糖和无机盐在第3个水平上，酵母粉与VB1分别在第1个水平上和第2个水平上[14]，使野生蕈菌菌丝体生物量最多，生长最佳，故理论最佳的液体培养基配方Z7（A3B1C3D2），即蔗糖20 g/L，酵母粉3 g/L，MgSO4·7H2O 2.5 g/L，KH2PO4 5 g/L，VB1 0008 g/L。
在正交试验结果的基础上，做验证试验，以菌丝体生物量为指标，用正交试验所获得的菌丝体生物量最高的配方Z7做验证试验（图1），得到苇蘑菌丝体生物量为1.031 g/L，低于C2组合，结果显示理论最佳配方并非菌丝体生物量最高的配方，形成此种结果的原因可能是培养基的成分不同，导致溶液的渗透压和pH不同，从而使苇蘑的菌丝体生物量产生差异[13]。
经过碳源、氮源筛选试验，正交试验及理论最佳组合验证试验共21组（表9，C1～C5表示碳源筛选试验，N1～N6表示氮源筛选试验，Z1～Z9表示正交试验，Y1表示理论最佳组合验证试验），并对21组试验做方差齐性分析（表10）可知，F=6.594，大于F20，42，0.05=1.831，表明各组合对苇蘑菌丝体生物量的影响具有显著性差异。
3 结论与讨论
试验结果表明，苇蘑菌丝体最佳液体培养基配方为C2组合，即：蔗糖20 g/L，蛋白胨4 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO4 3 g/L，VB1 0.004 g/L，pH自然，29 ℃，培养20 d，菌丝体生物量达到1.980 g/L。虽未从正交试验中筛选出最适配方，但从21组试验中优化出最佳配方作为苇蘑菌丝体液体培养基配方[14]，为其发酵生产、细胞学育种等进一步研究开发提供物质基础、理论依据和技术支撑，为拯救和恢复该濒危野生蕈菌种质资源提供有力支持。
參考文献
[1]贾身茂.“蕈菌”之概念[J].食用菌，2015，37（3）：66-68.
[2] 闻毛红，朱将伟.食用菌液体培养技术的发展与应用[J].现代农业科技，2008（19）：125-126.
[3] 张树庭.蕈菌学[J].中国食用菌，1991，10（3）：3.
[4] 王祖伟，刘明舵，李兆江，等.七里海湿地环境生态系统退化与修复[J].水土保持研究，2005，12（5）：244-247.
[5] 刘进杰，王淑芳，卜庆梅，等.四种食用菌子实体不同部位组织分离菌丝长势对比[J].烟台职业学院学报，2006，12（2）：62-65.
[6] 刘西周，郭成金.采用L9（34）正交设计方法筛选血耳菌丝体液体培养基[J].中国食用菌，2009，28（1）：36-38.
[7] 马海燕，郭成金.云芝菌丝体液体培养基的筛选[J].中国食用菌，2007，26（4）：34-36.
[8] 贾素巧.碳氮营养对猴头菌生长发育及胞外酶活性的影响[D].保定：河北农业大学，2006.
[9] NORMAN G R，STREINER D L.生物统计学基础[M].北京：人民卫生出版社，2010.
[10] 刘成荣.碳源、氮源及其比例对香菇液体深层培养的影响[J].德州学院学报，2007，23（6）：58-60.
[11] 杨子美，郭成金.正交设计法筛选槐耳菌丝体液体培养基的研究[J].天津师范大学学报（自然科学版），2009，29（3）：66-68.
[12] 黄亮，王玉，胡炳旭，等.正交设计法筛选紫芝菌丝液体培养基的研究[J].天津农学院学报，2010，17（2）：14-17.
[13] 赵润，郭成金.冬虫夏草菌丝体液体培养基的优化[J].天津师范大学学报（自然科学版），2008，28（1）：8-11.
[14] GANG J，LIU H，LIU Y.Optimization of liquid fermentation conditions and protein nutrition evaluation of mycelium from the caterpillar medicinal mushroom，Cordyceps militaris （Ascomycetes）[J].Int J Med Mushrooms， 2016，18（8）：745-752.
关键词 野生苇蘑；菌丝体；液体培养基；正交设计；生物量
中图分类号 S646.9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）21-0012-03
Abstract A strain of wild weimo isolated from Tianjin Qilihai wetlands was studied in the experiment.The mycelial biomass was choosed as the main index to optimize liquid culture medium of wild weimo mycelium.Firstly，the single factor primary election was conducted with different carbon sources and nitrogen sources，then，in combination with orthogonal design.The optimum liquid nutrient medium was：20 g/L sucrose，4 g/L peptone，1.5 g/L MgSO·7H2O，3 g/L KH2PO4，0.004 g/L vitamin B1，pH natural.Under the condition of dark at 29 ℃，the biomass of mycelium could reach 1.980 g/L after culturing 20 days.
Key words Wild weimo；Mycelium；Liquid nutrient medium；Orthogonal design；Biomass
食用蕈菌的液體培养称为液体发酵[1]，液体发酵法能大大缩短生长周期，实现菌种快速生长，普遍提前10～20 d，且菌龄一致，生长发育均匀一致，接种简便，液体菌种便于接种工作的机械化，适合食用菌的工厂化、标准化生产[2]。目前研究主要集中在苇蘑的抗氧化活性、种属鉴定，对苇蘑菌丝体液体培养基筛选的有关报道较少。以一株采自天津七里海地区的野生蕈菌为研究对象，通过碳氮源单因素初选，并结合L9（34）正交设计[3]，试图筛选出其菌丝体最适液体培养基，实现天津七里海野生苇蘑的可持续合理有序开发利用，提高生物量，为其发酵生产、细胞学育种等进一步研究开发提供物质基础、理论依据和技术支撑，为拯救和恢复该濒危野生蕈菌种质资源提供有力支持[4]。
1 材料与方法
1.1 供试菌种 供试菌株为一株野生苇蘑，采自天津市宁河县七里海湿地保护区，现存于天津师范大学蕈菌研究所。
1.2 试剂
蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蛋白胨（含氮量14.5%）、酵母粉（含氮量9%）、牛肉膏（含氮量117%）、硫酸铵（含氮量99%）、硝酸铵（含氮量99%）、KH2PO4、MgSO4·7H2O、VB1、琼脂粉（上海蓝季），以上均为分析纯，马铃薯、豆粕（含氮量45.4%）。均为市售。
1.3 仪器
YXQ-LS-70A电热压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；Sartorius BS 224S电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；THZ-D台式恒温振荡器，大仓市实验设备厂；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；DHG-9245A电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。
1.4 综合培养基
PDA培养基：马铃薯（浸提液）200 g/L、琼脂粉20 g/L、葡萄糖20 g/L、KH2PO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、VB1 0.01 g/L。现将马铃薯加水煮沸30 min过滤，滤液加入其他药品完全溶解后，121 ℃灭菌20 min，pH自然。
1.5 试验方法
1.5.1 菌种分离培养及活化。
采用组织分离方法获取菌种，将野生苇蘑色泽正常、未受病虫侵害的部分子实体表面杂物清除，并用手术刀将子实体根部切除，再用75%酒精擦拭2次，在无菌条件下，解剖刀、镊子等紫外线消毒后，在酒精灯外焰进行灼烧，冷却后，把供分离部分子实体纵切一分为二，在菌柄与菌盖交接处的组织上用解剖刀切成见方1 cm2小块，用镊子迅速将组织块放在PDA平板内培养7～8 d[5]。将制备的菌种提前4 d活化。无菌条件下接种于综合培养基平板上，29 ℃培养3～4 d备用[6]。
1.5.2 菌丝体液体培养基制备。
从综合培养基上用手术刀挑取约0.5 cm2大小的菌种块，接种在液体培养基液面上（100 mL三角瓶装50 mL液体培养基），每瓶3块，每个水平重复5次，29 ℃恒温培养20 d。
1.5.3 菌丝体干重测量。
滤纸编号（3次重复分别编号）后用电子天平称重，将培养20 d的苇蘑菌丝体培养物抽滤，蒸馏水冲洗3次后，于60 ℃烘箱中烘干2 h至恒重，再次称量。
1.5.4 碳源培养基初选。
在基础培养基中以蛋白胨4 g/L为氮源，C1、C2、C3、C4、C5碳源分别为葡萄糖20 g/L、蔗糖20 g/L、麦芽糖20 g/L、可溶性淀粉10 g/L、马铃薯（浸提液）200 g/L，其他培养基成分为：KH2PO4 3 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB1 0.004 g/L[6-7]（表1）。 1.5.5 氮源培养基初选。苇蘑培养基配方见表2。
1.6 正交试验设计
根据上述菌丝体干重结果，从中选取2个菌丝体生物量较高的碳源和氮源，以及不同浓度梯度的无机盐和VB1，使用L9（34）四因素、三水平进行正交试验，正交因素与水平如表3所示。
2 结果与分析
2.1 碳源差异性对苇蘑菌丝体生长的影响
碳源是蕈菌生长必不可少的营养物质之一，其作用是供应菌丝体生长所需的能量，参与各种代谢，组成菌体细胞的碳架结构[8]。由表4可知，以蔗糖为供试碳源时生物量最多，以马铃薯浸提液为供试碳源时生物量最少。经生物统计学[9]方差分析（表5）F值为3.490，小于F4，10，0.01=5.994，大于F4，10，0.05=3.478，表明在0.01水平上各个碳源对苇蘑菌丝体生物量影响不显著，在0.05水平上其差异显著。根据Duncan检测法可知，在001水平上蔗糖和马铃薯浸提液差异不显著，但和葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉间差异性显著。为获得最终碳源配方，所以选用蔗糖为碳源进行正交试验。
2.2 氮源差异性对野生蕈菌菌丝体生长的影响
氮源是野生蕈菌生长必需的组分之一，其介入合成生物大分子等[10]。由表6可知，有机氮源和无机氮源均可使其菌丝体生长，以酵母粉为供试氮源菌丝体的生物量最多，而以硝酸铵为供试氮源菌丝体生物量最少。同时，发现有机氮源比无机氮源更适合野生
蕈菌菌丝体生长。经生物统计学方差分析（表7）F值为26.231，大于F5，12，0.01=9.888，表明在氮源不相同的情况下苇蘑菌丝体干重呈现显著性差异。应用Duncan检测法检验表明，在0.01水平上酵母粉和其他5种氮源有极显著性差异，所以选取酵母粉做正交试验。
2.3 液体培养基正交试验及理论最佳组合验证
正交试验结果如表8所示，在4个因子中，相较于其他3个因子无机盐的极差（R）最大，蔗糖的极差最小，而无机盐极差越大，表示该因子的改变越能影响试验结果，即无机盐浓度的变化对野生蕈菌菌丝体干重的影响程度最大，蔗糖影响最小[11-12]。同一因素下，K值越大，说明该处理越有利于蕈菌菌丝体生物量的累积，经比较各因素不同的K值可知，蔗糖和无机盐在第3个水平上，酵母粉与VB1分别在第1个水平上和第2个水平上[14]，使野生蕈菌菌丝体生物量最多，生长最佳，故理论最佳的液体培养基配方Z7（A3B1C3D2），即蔗糖20 g/L，酵母粉3 g/L，MgSO4·7H2O 2.5 g/L，KH2PO4 5 g/L，VB1 0008 g/L。
在正交试验结果的基础上，做验证试验，以菌丝体生物量为指标，用正交试验所获得的菌丝体生物量最高的配方Z7做验证试验（图1），得到苇蘑菌丝体生物量为1.031 g/L，低于C2组合，结果显示理论最佳配方并非菌丝体生物量最高的配方，形成此种结果的原因可能是培养基的成分不同，导致溶液的渗透压和pH不同，从而使苇蘑的菌丝体生物量产生差异[13]。
经过碳源、氮源筛选试验，正交试验及理论最佳组合验证试验共21组（表9，C1～C5表示碳源筛选试验，N1～N6表示氮源筛选试验，Z1～Z9表示正交试验，Y1表示理论最佳组合验证试验），并对21组试验做方差齐性分析（表10）可知，F=6.594，大于F20，42，0.05=1.831，表明各组合对苇蘑菌丝体生物量的影响具有显著性差异。
3 结论与讨论
试验结果表明，苇蘑菌丝体最佳液体培养基配方为C2组合，即：蔗糖20 g/L，蛋白胨4 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO4 3 g/L，VB1 0.004 g/L，pH自然，29 ℃，培养20 d，菌丝体生物量达到1.980 g/L。虽未从正交试验中筛选出最适配方，但从21组试验中优化出最佳配方作为苇蘑菌丝体液体培养基配方[14]，为其发酵生产、细胞学育种等进一步研究开发提供物质基础、理论依据和技术支撑，为拯救和恢复该濒危野生蕈菌种质资源提供有力支持。
參考文献
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[7] 马海燕，郭成金.云芝菌丝体液体培养基的筛选[J].中国食用菌，2007，26（4）：34-36.
[8] 贾素巧.碳氮营养对猴头菌生长发育及胞外酶活性的影响[D].保定：河北农业大学，2006.
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[12] 黄亮，王玉，胡炳旭，等.正交设计法筛选紫芝菌丝液体培养基的研究[J].天津农学院学报，2010，17（2）：14-17.
[13] 赵润，郭成金.冬虫夏草菌丝体液体培养基的优化[J].天津师范大学学报（自然科学版），2008，28（1）：8-11.
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