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【摘 要】 目的：采用高效液相色谱法测定并分析不同提取温度对五倍子中单宁酸、五没食子酰基葡萄糖、没食子酸含量的影响。方法：以醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH40）为提取溶剂（液料比1∶100），分别在65、75、85、95℃中水浴35h，HPLC法测定含量。结果：在85℃温度提取条件下，三者可测得最大含量。结论：本实验初步提示提取五倍子中单宁酸、五没食子酰基葡萄糖、没食子酸的最佳提取温度为85℃，可为五倍子的实验研究和工艺研究提供一定参考。
【关键词】 五倍子；提取温度；单宁酸；五没食子酰基葡萄糖（PGG）；没食子酸；HPLC
【中图分类号】R2841 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）05-0028-02
Different extraction temperatures gallnut main chem ical components of HPLC
HE Sheng-fei ZHOU Guo-li ZHENG Shi-ping WANF Fen FAN Yuan*
Yunnan University of TCM，Kunming 650500，China
Abstract：Objective To measure and analysis the influence of different extract temperature on the content of tannic acid，gallic acid and 1，2，3，4，6-Penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose （PGG） in Chinese gall by using high performance liquid chromatography.Methods With sodium acetate acetic acid buffer soiution （pH4） as the extraction solvent（liquid rate 1∶100），respectively at 65℃，75℃，85℃，95℃ water bath in 35h，using HPLC to measure and analysis the extraction of tannic acid，PGG，gallic acid from Chinese gall.Results The content of three are highest on condition of 85℃.Concludes The experiment preliminary suggest extraction temperature of annic acid，PCC，gallic acid from Chinese gall is 85℃，it can provide some reference for the research of experiment and pross of china gall.
Keywords：Chinese gall；extraction temperature；tannic acid；PGG；gallic acid；HPLC
五倍子是我国的传统中药，已有几千年的历史，广泛用于抗菌、抗病毒、防龋齿、抗氧化、抗癌、抗糖尿病、止泻、消炎和抗凝血酶等[1]。我国五倍子产量约占世界总产量的95%，国际上又把五倍子称为中国五倍子[2]。五倍子中的主要有效成分为鞣质及没食子酸，五倍子中的单宁酸和五没食子酰基葡萄糖（PGG）是水解类鞣质[3]。
五倍子中含量最多的成分是五倍子单宁，单宁又名鞣酸、单宁酸，含量约70%，甚至可高达80%[4]。五倍子单宁具有β-五-O-没食子酸-D-葡萄糖（β-PGG），另外还含8～9个没食子酸[5]，分子式为C76H52O46，结构如图1所示。五没食子酰基葡糖是天然多酚类化合物，是由葡萄糖与5个没食子酸形成的酯[6]，是五倍子鞣质的原型和化学反应的中间途径[7]，分子式为C41H32O26，结构如图2所示。没食子酸（Gallic acid）亦称五倍子酸或棓酸，在五倍子中约含2%～4%[8]，是天然的多酚类化合物，化学名3，4，5-三羟基苯甲酸[9]，分子式C7H6O5，结构如图3所示。
五倍子作为传统中药有广泛应用价值，为更好的利用五倍子的资源，其各有效成分的提取成为研究热点，本文测定并分析提取温度对其活性成分中单宁酸、五没食子酰基葡萄糖、没食子酸的影响。
1 材料与试剂
11 仪器 Agilent1200型高效液相色谱仪（VWD检测器）；电热恒温干燥箱DHG-9071（上海精宏实验设备有限公司）；高速多功能粉碎机XY-500A型（浙江省永康市松青五金厂）；分样筛（浙江上虞市五四建材仪器厂）；分析天平；电子天平；恒温水浴锅。
12 试剂 单宁酸对照品（成都迈斯克医药科技有限公司）；PGG对照品（四川成都普瑞法有限公司）；没食子酸对照品（购自云南省药检所）；甲醇、乙腈均为色谱纯；水为纯净水；其余试剂为分析纯醇。
五倍子（购自昆明道地中药饮片厂）敲碎，除去虫瘿，清洗，烘干，粉碎，过五号筛密封保存备用。
2 方法
21 色谱条件
211 单宁酸色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB- C18柱（46×250mm，5μm）；流动相：纯净水（A）-甲醇（B）（20∶80）；流速：05ml/min；检测波长：275nm；柱温：25℃；进样量：2μl。
212 PGG色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB- C18柱（46×250mm，5um） 流速：10ml/min；流动相：01%磷酸（A）-乙腈（C）（90∶10），进行梯度洗脱，0～15min，10%～25%C、15～1510min，25%C、1510～20min，25%C；检测波长：280nm；柱温：25℃；进样量：20μl。 213 没食子酸色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB- C18柱（46×250mm，5μm） 流动相：02%磷酸（A）-甲醇（B）（95：5） 流速：1ml/min；检测波长：273nm；柱温：25 ℃；进样量：10μl 。
22 对照品溶液制备
221 单宁酸对照品溶液制备 精密称取单宁酸标准品044mg置于10ml容量瓶中，用50%的甲醇溶解定容至刻度，摇匀作为储备液。
222 PGG对照品溶液制备 精密称取PGG标准品045mg，用80%甲醇溶解定容于10ml容量瓶中，摇匀即得。
223 没食子酸对照品溶液制备 精密称取没食子酸标准品25mg置于10ml容量瓶中，再加入7ml乙醇、29ml水和01ml丙酮定容至刻度，摇匀即得。
23 供试品溶液制备 用电子天平精密称取4份02g五倍子粉末于4个250ml具塞锥形瓶中，加入20ml配好的pH40醋酸-醋酸钠缓冲溶液，分别置于65、75、85、95℃恒温水浴锅中水浴加热水解35h，冷却过滤，精密量取滤液1ml于10ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀即得。
24 标准曲线绘制
241 单宁酸标准曲线制备 精密称取单宁酸标准品258μg置于10ml容量瓶中，用乙醇、水、丙酮体积比为699%、298%、03%的溶液溶解并定容至刻度，摇匀。按“211”单宁酸色谱条件分别取2、4、6、8、10μl不同体积进样，以单宁酸的峰面积（Y）对标准品的质量（X）进行线性回归，得方程y=57195x-19248（r=09974），结果表明：单宁酸峰面积值与质量有良好的线性关系，线性范围为0516～258μg。
242 PGG标准曲线制备[10] 精密称取单宁酸标准品8mg置于50ml容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀。从中精密吸取10ml于25ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。按“212”PGG色谱条件分别取2、4、6、8、10、15μl不同体积进样，以PGG标准品质量为横坐标（X），峰面积峰值为纵坐标（Y），得回归方程为：Y=2420237X-18445（r=09998），表明PGG在0139～10428μg范围内线性关系良好。
243 没食子酸标准曲线制备 精密称取没食子酸标准品25mg置于25ml容量瓶中，用50%的甲醇溶解定容至刻度，摇匀。分别精密吸取01、05、1、2、4ml于10ml容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即配制成浓度为1、5、10、20、40μg/ml的标准溶液。按“213”没食子酸色谱条件进样20μl，以没食子酸的峰面积（Y）对其浓度（X）进线性回归，得方程Y=1147X+24554（r=09999），结果表明：没食子酸峰面积值与浓度有良好的线性关系，线性范围为1～10μg/ml。
25 含量测定 分别取“23项”下方法制备的供试品溶液，按“21”色谱条件分别测定单宁酸、五没食子酰基葡萄糖和没食子酸含量，用外标法进行计算。
3 结果
由表1可知，在85℃时单宁酸、五没食子酰基葡萄糖（PGG）和没食子酸可测得最大含量。上述结果显示：85℃为单宁酸、五没食子酰基葡萄糖（PGG）和没食子酸的最适提取温度，并且五没食子酰基葡萄糖和没食子酸含量变化受温度影响较单宁酸大。
4 讨论
中药成分复杂，在提取过程中应该尽可能多的提取出其有效活性成分，而在此过程中液料比、提取溶剂种类、提取温度、pH值等都可能会影响其含量。在五倍子中，单宁酸的提取方法主要有溶剂提取法、超声辅助法、加压提取法、超临界CO2萃取法，没食子酸提取有酸水解法、碱水解法和酶水解法，而五没食子酰基葡萄糖主要为醇解法[11]。
本实验以醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH40）为提取溶剂，用HPLC法测定分析不同提取温度下提取液中单宁酸、五没食子酰基葡萄糖和没食子酸的含量变化，以期获得最佳的提取温度。结果表明在85℃时五倍子中单宁酸、五没食子酰基葡萄糖和没食子酸可测得最大含量，结果提示单宁酸含量变化受温度影响比五没食子酰基葡萄糖和没食子酸小。测定并分析不同温度对五倍子中单宁酸、五没食子酰基葡萄糖和没食子酸的影响可为五倍子的工艺研究及进一步开展实验研究提供参考依据。
参考文献
[1]Xue-Lian Huang，Ming-Dong Liu，Ji-Yao Li，et al.Chemical composition of Galla chinensis extract and the effect of its main component（s） on the prevention of enamel demineralization in vitro[J].International Journal of Oral Scienc，2012，4（3）：146-151.
[2]李志国，杨文云，夏定久.中国五倍子研究现状[J].林业科学研究，2003，16（6）：760-767.
[3]赵勇，王红，王宝恩，等.中药水解类鞣质PGG的研究进展[J].临床和实验医学杂志，2013，12（6）：462-464.
[4]张雅丽，李建科，刘柳，等.五倍子单宁对常见食品腐败菌和致病菌抑制作用研究[J].食品工业科技，2013，34（18）：141-143.
[5]江凯.五倍子单宁提取纯化及生理活性的研究进展[J].农产品加工·学刊，2013，（5）：53-56.
[6]Jinhui Zhang，Li Li，Sung-Hoon Kim，et al. Anti-Cancer， Anti-Diabetic Other Pharmacologic Biological Activities of Penta-Galloyl-Glucose[J].Pharmaceutical Research，2009，26（9）：2066-2080.
[7]Makoto Nishizawa，Takashi Yamagishi.Novel hydrolysable tannins from Nuphar Japonicum DC[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin，1982，30（3）：1094-1097.
[8]乔彩云，李建科.五倍子及五倍子单宁的研究进展[J].食品工业科技，2011，32（7）：458-462.
[9]张雅丽，李建科，刘柳，等.五倍子没食子酸研究进展[J].食品工业科技，2013，34（10）：386-390.
[10]李霄，艾萍.RP-HPLC双波长法测定白芍中芍药苷和五没食子酰葡萄糖含量[J].北京中医药大学学报，2009，32（2）：122-124.
[11]Lili，AhmadAli，Shaik，et al. Preparation of penta-O-galloyl-β-d-glucose from tannic acid and plasmapharmacokinetic analyses by liquid–liquid extraction and reverse-phase HPLC[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，54（2）：545-550.
（收稿日期：20141203）
【关键词】 五倍子；提取温度；单宁酸；五没食子酰基葡萄糖（PGG）；没食子酸；HPLC
【中图分类号】R2841 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）05-0028-02
Different extraction temperatures gallnut main chem ical components of HPLC
HE Sheng-fei ZHOU Guo-li ZHENG Shi-ping WANF Fen FAN Yuan*
Yunnan University of TCM，Kunming 650500，China
Abstract：Objective To measure and analysis the influence of different extract temperature on the content of tannic acid，gallic acid and 1，2，3，4，6-Penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose （PGG） in Chinese gall by using high performance liquid chromatography.Methods With sodium acetate acetic acid buffer soiution （pH4） as the extraction solvent（liquid rate 1∶100），respectively at 65℃，75℃，85℃，95℃ water bath in 35h，using HPLC to measure and analysis the extraction of tannic acid，PGG，gallic acid from Chinese gall.Results The content of three are highest on condition of 85℃.Concludes The experiment preliminary suggest extraction temperature of annic acid，PCC，gallic acid from Chinese gall is 85℃，it can provide some reference for the research of experiment and pross of china gall.
Keywords：Chinese gall；extraction temperature；tannic acid；PGG；gallic acid；HPLC
五倍子是我国的传统中药，已有几千年的历史，广泛用于抗菌、抗病毒、防龋齿、抗氧化、抗癌、抗糖尿病、止泻、消炎和抗凝血酶等[1]。我国五倍子产量约占世界总产量的95%，国际上又把五倍子称为中国五倍子[2]。五倍子中的主要有效成分为鞣质及没食子酸，五倍子中的单宁酸和五没食子酰基葡萄糖（PGG）是水解类鞣质[3]。
五倍子中含量最多的成分是五倍子单宁，单宁又名鞣酸、单宁酸，含量约70%，甚至可高达80%[4]。五倍子单宁具有β-五-O-没食子酸-D-葡萄糖（β-PGG），另外还含8～9个没食子酸[5]，分子式为C76H52O46，结构如图1所示。五没食子酰基葡糖是天然多酚类化合物，是由葡萄糖与5个没食子酸形成的酯[6]，是五倍子鞣质的原型和化学反应的中间途径[7]，分子式为C41H32O26，结构如图2所示。没食子酸（Gallic acid）亦称五倍子酸或棓酸，在五倍子中约含2%～4%[8]，是天然的多酚类化合物，化学名3，4，5-三羟基苯甲酸[9]，分子式C7H6O5，结构如图3所示。
五倍子作为传统中药有广泛应用价值，为更好的利用五倍子的资源，其各有效成分的提取成为研究热点，本文测定并分析提取温度对其活性成分中单宁酸、五没食子酰基葡萄糖、没食子酸的影响。
1 材料与试剂
11 仪器 Agilent1200型高效液相色谱仪（VWD检测器）；电热恒温干燥箱DHG-9071（上海精宏实验设备有限公司）；高速多功能粉碎机XY-500A型（浙江省永康市松青五金厂）；分样筛（浙江上虞市五四建材仪器厂）；分析天平；电子天平；恒温水浴锅。
12 试剂 单宁酸对照品（成都迈斯克医药科技有限公司）；PGG对照品（四川成都普瑞法有限公司）；没食子酸对照品（购自云南省药检所）；甲醇、乙腈均为色谱纯；水为纯净水；其余试剂为分析纯醇。
五倍子（购自昆明道地中药饮片厂）敲碎，除去虫瘿，清洗，烘干，粉碎，过五号筛密封保存备用。
2 方法
21 色谱条件
211 单宁酸色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB- C18柱（46×250mm，5μm）；流动相：纯净水（A）-甲醇（B）（20∶80）；流速：05ml/min；检测波长：275nm；柱温：25℃；进样量：2μl。
212 PGG色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB- C18柱（46×250mm，5um） 流速：10ml/min；流动相：01%磷酸（A）-乙腈（C）（90∶10），进行梯度洗脱，0～15min，10%～25%C、15～1510min，25%C、1510～20min，25%C；检测波长：280nm；柱温：25℃；进样量：20μl。 213 没食子酸色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB- C18柱（46×250mm，5μm） 流动相：02%磷酸（A）-甲醇（B）（95：5） 流速：1ml/min；检测波长：273nm；柱温：25 ℃；进样量：10μl 。
22 对照品溶液制备
221 单宁酸对照品溶液制备 精密称取单宁酸标准品044mg置于10ml容量瓶中，用50%的甲醇溶解定容至刻度，摇匀作为储备液。
222 PGG对照品溶液制备 精密称取PGG标准品045mg，用80%甲醇溶解定容于10ml容量瓶中，摇匀即得。
223 没食子酸对照品溶液制备 精密称取没食子酸标准品25mg置于10ml容量瓶中，再加入7ml乙醇、29ml水和01ml丙酮定容至刻度，摇匀即得。
23 供试品溶液制备 用电子天平精密称取4份02g五倍子粉末于4个250ml具塞锥形瓶中，加入20ml配好的pH40醋酸-醋酸钠缓冲溶液，分别置于65、75、85、95℃恒温水浴锅中水浴加热水解35h，冷却过滤，精密量取滤液1ml于10ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀即得。
24 标准曲线绘制
241 单宁酸标准曲线制备 精密称取单宁酸标准品258μg置于10ml容量瓶中，用乙醇、水、丙酮体积比为699%、298%、03%的溶液溶解并定容至刻度，摇匀。按“211”单宁酸色谱条件分别取2、4、6、8、10μl不同体积进样，以单宁酸的峰面积（Y）对标准品的质量（X）进行线性回归，得方程y=57195x-19248（r=09974），结果表明：单宁酸峰面积值与质量有良好的线性关系，线性范围为0516～258μg。
242 PGG标准曲线制备[10] 精密称取单宁酸标准品8mg置于50ml容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀。从中精密吸取10ml于25ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。按“212”PGG色谱条件分别取2、4、6、8、10、15μl不同体积进样，以PGG标准品质量为横坐标（X），峰面积峰值为纵坐标（Y），得回归方程为：Y=2420237X-18445（r=09998），表明PGG在0139～10428μg范围内线性关系良好。
243 没食子酸标准曲线制备 精密称取没食子酸标准品25mg置于25ml容量瓶中，用50%的甲醇溶解定容至刻度，摇匀。分别精密吸取01、05、1、2、4ml于10ml容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即配制成浓度为1、5、10、20、40μg/ml的标准溶液。按“213”没食子酸色谱条件进样20μl，以没食子酸的峰面积（Y）对其浓度（X）进线性回归，得方程Y=1147X+24554（r=09999），结果表明：没食子酸峰面积值与浓度有良好的线性关系，线性范围为1～10μg/ml。
25 含量测定 分别取“23项”下方法制备的供试品溶液，按“21”色谱条件分别测定单宁酸、五没食子酰基葡萄糖和没食子酸含量，用外标法进行计算。
3 结果
由表1可知，在85℃时单宁酸、五没食子酰基葡萄糖（PGG）和没食子酸可测得最大含量。上述结果显示：85℃为单宁酸、五没食子酰基葡萄糖（PGG）和没食子酸的最适提取温度，并且五没食子酰基葡萄糖和没食子酸含量变化受温度影响较单宁酸大。
4 讨论
中药成分复杂，在提取过程中应该尽可能多的提取出其有效活性成分，而在此过程中液料比、提取溶剂种类、提取温度、pH值等都可能会影响其含量。在五倍子中，单宁酸的提取方法主要有溶剂提取法、超声辅助法、加压提取法、超临界CO2萃取法，没食子酸提取有酸水解法、碱水解法和酶水解法，而五没食子酰基葡萄糖主要为醇解法[11]。
本实验以醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH40）为提取溶剂，用HPLC法测定分析不同提取温度下提取液中单宁酸、五没食子酰基葡萄糖和没食子酸的含量变化，以期获得最佳的提取温度。结果表明在85℃时五倍子中单宁酸、五没食子酰基葡萄糖和没食子酸可测得最大含量，结果提示单宁酸含量变化受温度影响比五没食子酰基葡萄糖和没食子酸小。测定并分析不同温度对五倍子中单宁酸、五没食子酰基葡萄糖和没食子酸的影响可为五倍子的工艺研究及进一步开展实验研究提供参考依据。
参考文献
[1]Xue-Lian Huang，Ming-Dong Liu，Ji-Yao Li，et al.Chemical composition of Galla chinensis extract and the effect of its main component（s） on the prevention of enamel demineralization in vitro[J].International Journal of Oral Scienc，2012，4（3）：146-151.
[2]李志国，杨文云，夏定久.中国五倍子研究现状[J].林业科学研究，2003，16（6）：760-767.
[3]赵勇，王红，王宝恩，等.中药水解类鞣质PGG的研究进展[J].临床和实验医学杂志，2013，12（6）：462-464.
[4]张雅丽，李建科，刘柳，等.五倍子单宁对常见食品腐败菌和致病菌抑制作用研究[J].食品工业科技，2013，34（18）：141-143.
[5]江凯.五倍子单宁提取纯化及生理活性的研究进展[J].农产品加工·学刊，2013，（5）：53-56.
[6]Jinhui Zhang，Li Li，Sung-Hoon Kim，et al. Anti-Cancer， Anti-Diabetic Other Pharmacologic Biological Activities of Penta-Galloyl-Glucose[J].Pharmaceutical Research，2009，26（9）：2066-2080.
[7]Makoto Nishizawa，Takashi Yamagishi.Novel hydrolysable tannins from Nuphar Japonicum DC[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin，1982，30（3）：1094-1097.
[8]乔彩云，李建科.五倍子及五倍子单宁的研究进展[J].食品工业科技，2011，32（7）：458-462.
[9]张雅丽，李建科，刘柳，等.五倍子没食子酸研究进展[J].食品工业科技，2013，34（10）：386-390.
[10]李霄，艾萍.RP-HPLC双波长法测定白芍中芍药苷和五没食子酰葡萄糖含量[J].北京中医药大学学报，2009，32（2）：122-124.
[11]Lili，AhmadAli，Shaik，et al. Preparation of penta-O-galloyl-β-d-glucose from tannic acid and plasmapharmacokinetic analyses by liquid–liquid extraction and reverse-phase HPLC[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，54（2）：545-550.
（收稿日期：20141203）