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摘要[目的]研究苗药吊石苣苔的抑菌活性。[方法]采用体外微生物敏感试验，测定吊石苣苔不同溶剂提取物的体外抑菌活性。[结果]正丁醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌均有抑制效果，其中对大肠杆菌的抑制活性显著，其抑菌圈直径、最低抑菌浓度（MIC）分别为10.39 mm和3.2 mg/ml；乙酸乙酯提取物对受试细菌均具有抑菌效果，特别对金黄色葡萄球菌的抑制活性显著，其抑菌圈直径、最低抑菌浓度（MIC）分别为12.31 mm和0. 8 mg/ml；而石油醚提取物仅对金黄色葡萄球菌有较弱抑制作用；水浸提物除对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌有抑制作用外，对其他菌株也无抑制作用。[结论]吊石苣苔具有较强的抑菌作用，其体外抑菌活性部分主要分布在正丁醇、乙酸乙酯相。
关键词 吊石苣苔；苗药；抑菌活性；抑菌圈；最小抑菌浓度
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）22-064-02
Abstract [Objective] The purpose was to research antibacterial activities of extracts from Miao Ethnomedicine Lysionotus pauciflorus. [Method] Using microbial sensitivity test in vitro， antibacterial activities of extracts from Miao Ethnomedicine Lysionotus pauciflorus were determined. [Result] It was showed that the extracts of Nbutanol from Miao Ethnomedicine Lysionotus pauciflorus has antibacterial activity to Escherichia coli， Staphylococcus aureus and Pasteurella multocida， the best antibacterial activity was Escherichia coli. Inhibition zone diameter and the minimum inhibitory concentration （MIC） were 10.39 mm and 3.2 mg/ml； Yet the extracts of ethyl acetate from Miao Ethnomedicine Lysionotus pauciflorus has antibacterial activity specially to Staphylococcus aureus. Inhibition zone diameter and the minimum inhibitory concentration （MIC） were 12.31 mm and 0.8 mg/ml. But petroleum ether has a weak of antibacterial activity only to Staphylococcus aureus. Except Escherichia coli and Pasteurella multocida， the extracts of water from Miao Ethnomedicine Lysionotus pauciflorus has nothing. [Conclusion] Miao Ethnomedicine Lysionotus pauciflorus has a significant of antibacterial activity mainly in Nbutanol and ethyl acetate.
Key words Lysionotus pauciflorus； Miao Ethnomedicine； Antibacterial activities； Inhibitory circle； MIC
苗藥是苗族人民在漫长的生产、生活实践中预防和治疗疾病经验的高度总结，是人类医学宝库的财富。文献报道认为，苗药不管是单味药还是复方药，其化学成分是具有多种结构类型的化合物库，且临床疗效确切，它的作用可能是多种药理活性相互协调的结果，传统民族药经现代科技手段进行分析发现更多的药理作用[1]。在贵州省凯里少数民族地区进行调研时，笔者发现当地苗医习用杆努尽烟（苗名音译）治疗支气管炎、感冒咳嗽、肺炎、肺结核、无名肿毒等，疗效显著。采集的标本经贵阳中医学院有关专家进行了原植物鉴定，发现杆努尽烟为苦苣苔科吊石苣苔。通过野外调查，发现该药用植物主要分布在鸭塘镇、龙场镇的香炉山、炉山、凯堂、旁海、大风洞、万潮、湾水、三棵树的巴拉河，生长于海拔600～800 m的山谷陡坡石灰岩阴湿处的石壁上或附生于森林的古树上。文献资料也显示贵州全省均有分布且很丰富，系苗族习用药材[2-3]，还广泛分布于我国南方，如云南东部、四川、贵州、广西等省区[3-5]。
经贵阳中医学院相关专家鉴定杆努尽烟为苦苣苔科（Gesneriaceae）吊石苣苔属 （L ysionotus）植物吊石苣苔的全草（Lysionotuspauciflorus）。全株入药，有清肺化痰、凉血止血、祛湿化滞、通络止痛作用，在苗族民间还用于治疗淋巴结核病。临床用于治疗淋巴结核、慢性支气管炎、吐血、跌打损伤、肺热咳嗽、崩带、菌痢、疳积、风湿痹痛，疗效显著，无毒副作用。市场上以苦苣苔科吊石苣苔为主要原料的产品有“复方岩连片”、“马兰感寒胶囊”和“石吊兰制剂”等。目前对吊石苣苔化学成分的研究并不多，报道了部分有机成分，如黄酮类、苯乙醇类、脂肪醇类、β谷甾醇、熊果酸等[6-8]；药理活性方面也仅侧重报道了其中的成分——石吊兰素的抗结核菌作用[9]。因此吊石苣苔的药用价值仍需进一步深入研究和开发利用。该研究选取吊石苣苔为研究对象，利用不同极性的溶剂对杆努尽烟的乙醇提取物进行萃取，获得不同溶剂提取物；以民间用药时针对的病症为蓝本，进行吊石苣苔提取物的抑菌作用研究，并对抑菌活性进行综合评价，为进一步探索其药理作用机制打下基础。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
药材。吊石苣苔的全草采自贵州省凯里市炉山镇五里桥村，经贵阳中医学院相关专家鉴定为吊石苣苔属植物吊石苣苔。
1.1.2
菌种。大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida）。由贵阳医学院基础医学研究中心提供。
1.1.3
培养基。MH培养基、RPMI 1640 液体培养基。
1.1.4
试剂。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，均为国产分析纯。
1.1.5
仪器。RE52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、SHB-III型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）、生物安全柜、紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）、热恒温培养箱、超净工作台。
1.2 方法
1.2.1
供试样品的制备。将干燥的吊石苣苔粉碎，称取2.0 kg，常温下以6.0 L 95%乙醇浸取15 d，固液分离，将滤液旋蒸回收乙醇，得到总浸膏。总浸膏倒入1 L水中振摇后，按照极性从小到大顺序，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，直至上清液近无色，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水溶性部分，各极性部位的萃取液旋蒸，得到各部位浸膏，常温晾干。
取水浸提取的浸膏0.1 g，溶于1 ml无菌水中，制备为100 mg/ml溶液，待用。取石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏、正丁醇浸膏各0.1 g，分别溶于1 ml二甲基甲酰胺，使其充分溶解，均制备为100 mg/ml溶液，待用。
1.2.2
各部分粗提物抑菌活性检测。
1.2.2.1
细菌悬液制备。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、枯草芽孢杆菌采用MH培养基培养。将受试菌种接入相应的液体培养基上，在37 ℃恒温培养箱内培养2 d，将各菌种浓度调至细菌细胞密度（OD600）约为1，待用。
1.2.2.2
含菌培养基制备。用移液枪吸取各种细菌悬液100 μl于MH培养基中，用无菌三角涂布棒涂布均匀，待干后倒置于37 ℃的恒温培养箱中培养，观察培养结果。
1.2.2.3
抑菌效果测定。采用滤纸片扩散法[10]测定抑菌圈，按无菌操作规程[11]将预先灭菌烘干的滤纸片（直径为8 mm）分别放在100 mg/ml的萃取物溶液及空白对照的溶剂中浸泡30 min，适度挥干溶剂，然后放在含菌培养基上，同时用浸有相应溶剂的滤纸片做阴性对照，每处理3次重复。将加有细菌悬液的平板放入37 ℃培养箱内培养24 h，观察抑菌效果，并测定抑菌圈直径。
1.2.2.4
抑菌浓度测定。在96孔板上，第1孔加100 μl原药液；从第2孔开始用RPMI 1640 液体培养基将原药液对半稀释成各种浓度（100.0、50.0、25.0、12.5、6.2、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 mg/ml），加100 μl的菌悬液；第11孔加200 μl的菌悬液；第12孔加200 μl的RPMI 1640培养液。37 ℃温箱中培养24 h后观察，以肉眼观察澄清孔的最小稀释倍数为药物的最小抑菌浓度（MIC）。
2 结果与分析
2.1 吊石苣苔不同溶剂提取物的抑菌效果
利用“1.2”试验方法处理供试样品并进行相关检测，获得吊石苣苔不同溶剂提取物的抑菌圈直径，从表1可看出，吊石苣苔不同溶剂提取物对各种受试菌的抑菌活性是不同的，正丁醇提取物对大肠杆菌抑制作用最强，抑菌圈直径>10 mm，并对金黄色葡萄球菌有抑制作用；乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌抑制作用最强，抑菌圈直径>10 mm，对其他细菌均有抑菌作用；石油醚提取物对金黄色葡萄球菌有抑制作用；水浸提物对金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌有抑制作用。
2.2 吊石苣苔不同溶剂提取物MIC比较
由表2可见，正丁醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌均有抑制效果，最低抑菌浓度（MIC）分别为3.2、6.2、12.5 mg/ml；乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、枯草芽孢杆菌均有抑制效果，其中对金黄色葡萄球菌的抑制效果较好，最低抑菌浓度为0.8 mg/ml；石油醚提取物对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，最低抑菌浓度为50.0 mg/ml，对其他的受试菌无抑制效果；水浸提物对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌有一定的抑制效果，最低抑菌浓度分别为12.5、25.0 mg/ml，对其他受试菌无抑制效果。
3 小结与讨论
该试验采用体外微生物敏感试验，测定和比较了苗药吊石苣苔不同溶剂提取物的体外抑菌作用，结果表明，正丁醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌均有抑制活性，其中对大肠杆菌的抑制效果显著，其抑菌圈直径、最低抑菌浓度（MIC）分别为10.39 mm和3.2 mg/ml；乙酸乙酯提取物对受试的细菌均具有抑菌活性，特别对金黄色葡萄球菌的抑制效果显著，其抑菌圈直徑、MIC分别为12.31 mm和0.8 mg/ml；而石油醚提取物仅对金黄色葡萄球菌有较弱抑制作用；水浸提物除对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌有较弱抑制作用外，对其他菌株无抑制作用。说明吊石苣苔的抑菌活性部分主要分布在正丁醇、乙酸乙酯相。有关吊石苣苔抑菌作用的药理机理及活性化合物的进一步分离和纯化，还有待深入研究。
参考文献
[1]李万奎，沈祥春，潘娅.苗药药理作用研究进展[J].中华中医药杂志（原中国医药学报），2011，26（9）：2039-2041.
[2] 马竣，冉懋雄.贵州苗族医药研究与开发[M].贵阳：贵州科技出版社，1999.
[3] 孙超，张勇民.贵州特有药用植物资源与可持续利用评价[J].中草药，2004，35（11）：1311-1315.
[4] 中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴：第4册[M].北京：科学出版社，2002：119.
[5] 中国植物志编委会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1990：136.
[6] LIU Y，WAGNER H.Nevadensin glycosides from Lysionotus pauciflorus[J].Phytochemistry，1996，42（2）：1203-1205.
[7]杨付梅，杨小生，罗波，等.苗药岩豇豆化学成分的研究[J].天然产物研究与开发，2003，15（6）：508-509.
[8] LIU Y，WANGER H，BAUER R.Phenylpropanoids and flavonoid glycosides from Lysionoms pauciflorus[J].P Avtoehem Jstry，1998，48（2）：339.
[9] 徐垠，胡之璧，冯胜初，等.石吊兰抗结核有效成分的研究I：石吊兰素的分离和鉴定[J].药学学报，1979，14（7）：447-448.
[10] 孙春龙，杜文，李洪庆.苗药冷水花提取物的抑菌作用[J].山地农业生物学报，2009，28（5）：468-470.
[11] 俞树荣.微生物学和微生物学检验[M].北京：人民卫生出版社，1997：452- 457.
关键词 吊石苣苔；苗药；抑菌活性；抑菌圈；最小抑菌浓度
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）22-064-02
Abstract [Objective] The purpose was to research antibacterial activities of extracts from Miao Ethnomedicine Lysionotus pauciflorus. [Method] Using microbial sensitivity test in vitro， antibacterial activities of extracts from Miao Ethnomedicine Lysionotus pauciflorus were determined. [Result] It was showed that the extracts of Nbutanol from Miao Ethnomedicine Lysionotus pauciflorus has antibacterial activity to Escherichia coli， Staphylococcus aureus and Pasteurella multocida， the best antibacterial activity was Escherichia coli. Inhibition zone diameter and the minimum inhibitory concentration （MIC） were 10.39 mm and 3.2 mg/ml； Yet the extracts of ethyl acetate from Miao Ethnomedicine Lysionotus pauciflorus has antibacterial activity specially to Staphylococcus aureus. Inhibition zone diameter and the minimum inhibitory concentration （MIC） were 12.31 mm and 0.8 mg/ml. But petroleum ether has a weak of antibacterial activity only to Staphylococcus aureus. Except Escherichia coli and Pasteurella multocida， the extracts of water from Miao Ethnomedicine Lysionotus pauciflorus has nothing. [Conclusion] Miao Ethnomedicine Lysionotus pauciflorus has a significant of antibacterial activity mainly in Nbutanol and ethyl acetate.
Key words Lysionotus pauciflorus； Miao Ethnomedicine； Antibacterial activities； Inhibitory circle； MIC
苗藥是苗族人民在漫长的生产、生活实践中预防和治疗疾病经验的高度总结，是人类医学宝库的财富。文献报道认为，苗药不管是单味药还是复方药，其化学成分是具有多种结构类型的化合物库，且临床疗效确切，它的作用可能是多种药理活性相互协调的结果，传统民族药经现代科技手段进行分析发现更多的药理作用[1]。在贵州省凯里少数民族地区进行调研时，笔者发现当地苗医习用杆努尽烟（苗名音译）治疗支气管炎、感冒咳嗽、肺炎、肺结核、无名肿毒等，疗效显著。采集的标本经贵阳中医学院有关专家进行了原植物鉴定，发现杆努尽烟为苦苣苔科吊石苣苔。通过野外调查，发现该药用植物主要分布在鸭塘镇、龙场镇的香炉山、炉山、凯堂、旁海、大风洞、万潮、湾水、三棵树的巴拉河，生长于海拔600～800 m的山谷陡坡石灰岩阴湿处的石壁上或附生于森林的古树上。文献资料也显示贵州全省均有分布且很丰富，系苗族习用药材[2-3]，还广泛分布于我国南方，如云南东部、四川、贵州、广西等省区[3-5]。
经贵阳中医学院相关专家鉴定杆努尽烟为苦苣苔科（Gesneriaceae）吊石苣苔属 （L ysionotus）植物吊石苣苔的全草（Lysionotuspauciflorus）。全株入药，有清肺化痰、凉血止血、祛湿化滞、通络止痛作用，在苗族民间还用于治疗淋巴结核病。临床用于治疗淋巴结核、慢性支气管炎、吐血、跌打损伤、肺热咳嗽、崩带、菌痢、疳积、风湿痹痛，疗效显著，无毒副作用。市场上以苦苣苔科吊石苣苔为主要原料的产品有“复方岩连片”、“马兰感寒胶囊”和“石吊兰制剂”等。目前对吊石苣苔化学成分的研究并不多，报道了部分有机成分，如黄酮类、苯乙醇类、脂肪醇类、β谷甾醇、熊果酸等[6-8]；药理活性方面也仅侧重报道了其中的成分——石吊兰素的抗结核菌作用[9]。因此吊石苣苔的药用价值仍需进一步深入研究和开发利用。该研究选取吊石苣苔为研究对象，利用不同极性的溶剂对杆努尽烟的乙醇提取物进行萃取，获得不同溶剂提取物；以民间用药时针对的病症为蓝本，进行吊石苣苔提取物的抑菌作用研究，并对抑菌活性进行综合评价，为进一步探索其药理作用机制打下基础。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
药材。吊石苣苔的全草采自贵州省凯里市炉山镇五里桥村，经贵阳中医学院相关专家鉴定为吊石苣苔属植物吊石苣苔。
1.1.2
菌种。大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida）。由贵阳医学院基础医学研究中心提供。
1.1.3
培养基。MH培养基、RPMI 1640 液体培养基。
1.1.4
试剂。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，均为国产分析纯。
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仪器。RE52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、SHB-III型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）、生物安全柜、紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）、热恒温培养箱、超净工作台。
1.2 方法
1.2.1
供试样品的制备。将干燥的吊石苣苔粉碎，称取2.0 kg，常温下以6.0 L 95%乙醇浸取15 d，固液分离，将滤液旋蒸回收乙醇，得到总浸膏。总浸膏倒入1 L水中振摇后，按照极性从小到大顺序，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，直至上清液近无色，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水溶性部分，各极性部位的萃取液旋蒸，得到各部位浸膏，常温晾干。
取水浸提取的浸膏0.1 g，溶于1 ml无菌水中，制备为100 mg/ml溶液，待用。取石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏、正丁醇浸膏各0.1 g，分别溶于1 ml二甲基甲酰胺，使其充分溶解，均制备为100 mg/ml溶液，待用。
1.2.2
各部分粗提物抑菌活性检测。
1.2.2.1
细菌悬液制备。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、枯草芽孢杆菌采用MH培养基培养。将受试菌种接入相应的液体培养基上，在37 ℃恒温培养箱内培养2 d，将各菌种浓度调至细菌细胞密度（OD600）约为1，待用。
1.2.2.2
含菌培养基制备。用移液枪吸取各种细菌悬液100 μl于MH培养基中，用无菌三角涂布棒涂布均匀，待干后倒置于37 ℃的恒温培养箱中培养，观察培养结果。
1.2.2.3
抑菌效果测定。采用滤纸片扩散法[10]测定抑菌圈，按无菌操作规程[11]将预先灭菌烘干的滤纸片（直径为8 mm）分别放在100 mg/ml的萃取物溶液及空白对照的溶剂中浸泡30 min，适度挥干溶剂，然后放在含菌培养基上，同时用浸有相应溶剂的滤纸片做阴性对照，每处理3次重复。将加有细菌悬液的平板放入37 ℃培养箱内培养24 h，观察抑菌效果，并测定抑菌圈直径。
1.2.2.4
抑菌浓度测定。在96孔板上，第1孔加100 μl原药液；从第2孔开始用RPMI 1640 液体培养基将原药液对半稀释成各种浓度（100.0、50.0、25.0、12.5、6.2、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 mg/ml），加100 μl的菌悬液；第11孔加200 μl的菌悬液；第12孔加200 μl的RPMI 1640培养液。37 ℃温箱中培养24 h后观察，以肉眼观察澄清孔的最小稀释倍数为药物的最小抑菌浓度（MIC）。
2 结果与分析
2.1 吊石苣苔不同溶剂提取物的抑菌效果
利用“1.2”试验方法处理供试样品并进行相关检测，获得吊石苣苔不同溶剂提取物的抑菌圈直径，从表1可看出，吊石苣苔不同溶剂提取物对各种受试菌的抑菌活性是不同的，正丁醇提取物对大肠杆菌抑制作用最强，抑菌圈直径>10 mm，并对金黄色葡萄球菌有抑制作用；乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌抑制作用最强，抑菌圈直径>10 mm，对其他细菌均有抑菌作用；石油醚提取物对金黄色葡萄球菌有抑制作用；水浸提物对金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌有抑制作用。
2.2 吊石苣苔不同溶剂提取物MIC比较
由表2可见，正丁醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌均有抑制效果，最低抑菌浓度（MIC）分别为3.2、6.2、12.5 mg/ml；乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、枯草芽孢杆菌均有抑制效果，其中对金黄色葡萄球菌的抑制效果较好，最低抑菌浓度为0.8 mg/ml；石油醚提取物对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，最低抑菌浓度为50.0 mg/ml，对其他的受试菌无抑制效果；水浸提物对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌有一定的抑制效果，最低抑菌浓度分别为12.5、25.0 mg/ml，对其他受试菌无抑制效果。
3 小结与讨论
该试验采用体外微生物敏感试验，测定和比较了苗药吊石苣苔不同溶剂提取物的体外抑菌作用，结果表明，正丁醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌均有抑制活性，其中对大肠杆菌的抑制效果显著，其抑菌圈直径、最低抑菌浓度（MIC）分别为10.39 mm和3.2 mg/ml；乙酸乙酯提取物对受试的细菌均具有抑菌活性，特别对金黄色葡萄球菌的抑制效果显著，其抑菌圈直徑、MIC分别为12.31 mm和0.8 mg/ml；而石油醚提取物仅对金黄色葡萄球菌有较弱抑制作用；水浸提物除对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌有较弱抑制作用外，对其他菌株无抑制作用。说明吊石苣苔的抑菌活性部分主要分布在正丁醇、乙酸乙酯相。有关吊石苣苔抑菌作用的药理机理及活性化合物的进一步分离和纯化，还有待深入研究。
参考文献
[1]李万奎，沈祥春，潘娅.苗药药理作用研究进展[J].中华中医药杂志（原中国医药学报），2011，26（9）：2039-2041.
[2] 马竣，冉懋雄.贵州苗族医药研究与开发[M].贵阳：贵州科技出版社，1999.
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[8] LIU Y，WANGER H，BAUER R.Phenylpropanoids and flavonoid glycosides from Lysionoms pauciflorus[J].P Avtoehem Jstry，1998，48（2）：339.
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[10] 孙春龙，杜文，李洪庆.苗药冷水花提取物的抑菌作用[J].山地农业生物学报，2009，28（5）：468-470.
[11] 俞树荣.微生物学和微生物学检验[M].北京：人民卫生出版社，1997：452- 457.