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摘要：目的：为了简化微生物法测定奶粉中强化叶酸的操作步骤，使该方法便于操作，同时又不影响方法的准确度和稳定性。方法：利用干酪乳杆菌对食品中叶酸的特异性，测定奶粉中强化叶酸含量。通过改进后的方法与国标方法的比较，考察改进后方法的稳定性和可操作性。结果：改进后的方法操作较为简单，普通的微生物检测人员均可胜任，同时准确度和稳定性与国标方法没有差异。结论：可以通过方法改进对标准中过于繁琐的步骤进行简化，使方法更加方便操作，易于推广。
关键词：奶粉 强化叶酸 测定方法 方法改进
中图分类号：R155.5 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）04-0035-03
维生素是维持人体生命活动必须的一类有机物质，大多数的维生素，机体不能合成或合成量不足，不能满足机体的需要，必须通过食物获得。水溶性维生素，在体内不能储存，所以每日需要从食物中获得一定的补充。维生素的缺乏会引起一些疾病，但维生素的摄取也不是越多越好，有研究表明，过多摄入维生素也会引起一些中毒[1]。因此，控制维生素每日摄入量尤为重要，特别是控制婴幼儿维生素的每日摄入量。目前国内对婴幼儿奶粉的需求非常高，婴幼儿奶粉中的维生素主要通过人为添加，所以准确的检测奶粉中维生素含量是保持维生素合理摄入的技术支撑。
目前维生素的测定方法包括：比色测定法、荧光测定法、薄层色谱法、高效液相色谱法、滴定分析法、蛋白质藕合法、毛细管电泳法、EILSA法、微生物法等[2-3]。在诸多方法中微生物法独特的优点，是其他方法无法替代的，包括测定被测组分的特异性、活性成分、灵敏度和结果准确性等。目前为止，美国公职分析化学家协会（AOAC）以及食品安全国家标准（GB5413—2010）都将微生物法作为叶酸、维生素B12、生物素等检测的首选方法和仲裁方法[4]。但微生物方法存在步骤繁琐、操作耗时、检测周期长、易受外部因素干扰等诸多问题[5]，需要对人员、设备、实验材料、实验方法、环境设施等各个环节进行有效控制[6]。本文通过对国家标准GB5413.16—2010[7]婴幼儿食品和乳制品中强化叶酸含量的测定方法进行改进，主要用于食品中强化叶酸的测定，改进后的方法与国标法相比，具有检测操作步骤简化，准确度与重现性与国标法相似。改进后的方法从维生素提取、试剂与标准物质配制、菌株接种等多方面进行改进，从而使得方法操作简便，一般实验员均可操作。
1 实验材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 样品
来自市场上销售的婴幼儿配方乳粉。
1.1.2 菌种
试验菌株为干酪乳杆菌（Lactobacillus leichmanniii ）ATCC 7469，购置于广东省微生物研究所。
1.1.3 材料和试剂
抗坏血酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾（天津化学试剂一厂），叶酸标准品（Accustandard公司），叶酸测定培养基和乳酸杆菌肉汤（BD公司），MRS（北京陆桥技术有限责任公司），无菌滤膜（上海津腾），无菌容量瓶，一次性注射器等。
1.1.4 仪器
AC2-4S1生物安全柜（新加坡ESCO公司），日本TOMY全自动灭菌锅，TU-1800SPC分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），RT-6000酶标仪（德国IFP），安泰超净工作台，SPX-800恒温培养箱，MVS-1型漩涡混合器，百得移液枪等。
1.2 实验方法
菌种制备以及国标法具体操作参见标准GB5413.16—2010，以下只将改进后的方法列出。
1.2.1 试剂配制
（1）无菌磷酸盐缓冲液：5.85 g磷酸二氢钾，1.22g磷酸氢二钾，用1000mL水溶解。临用前加入5g抗坏血酸钠溶解，然后用0.2μm无菌滤膜过滤至无菌容器。
（2）无菌培养基制备，准确称取9.4g干粉培养基于200mL烧杯，加入50mg抗坏血酸，加入100mL蒸馏水溶解后，煮沸1min～2min，迅速冷却后用0.2μm无菌滤膜过滤至无菌容器中。
（3）无菌叶酸标准曲线制备：称取55mg～56mg（精确至0.1 mg）叶酸标准品，用50mL蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，加入2mL的10.8%氨水，按纯度稀释至10ng/mL，用0.2μm无菌滤膜过滤至无菌容器，采用无菌操作准确移取10mL于100mL无菌容量瓶中，用无菌磷酸盐缓冲定容，此溶液叶酸含量为1ng/mL。采用无菌操作按表1进行制备，一式三份，S1为空白对照（直接移取5mL无菌蒸馏水和5mL无菌培养基），S2为参比空白，S2到S10中的培养基为每100mL无菌培养基中加入制备好的光密度为60%～80%菌液1mL的培养基。
1.2.2 乳粉样品处理
精确称取2.0g样品（精确至0.1 mg）于三角瓶中，加入40 mL磷酸盐缓冲液，混匀，100 ℃水浴5min，期间振荡至少3次，迅速冷却至室温，用磷酸盐缓冲液定容至100 mL，然后利用0.2μm无菌滤膜过滤至10 mL无菌离心管中，以下步骤采用无菌操作。用无菌磷酸盐缓冲液按产品标示值稀释至1ng/mL，按表2进行操作，一式三份，叶酸测定用培养基（1.2.1.2）为已接种好的培养基。
1.2.3 培养测定
将上述的所有试管放入培养箱中，36℃±1℃培养16h～24h后，进行光密度测定。
2 结果与分析
2.1 国标法和改进后方法标准曲线测定结果
从表3和表4可以看出，国标法和改进后方法标准曲线OD值均落在0～1之间，且OD值平均数差异不大，从表5可以看出改进后的方法与国标法标准曲线的吸光度基本重合，没有明显差异。综合图表，改进后的方法与国标法标准曲线没有明显差异，可以用于结果计算。 2.2 结果与分析（表6）
利用国标法和改进后方法对两个不同样品进行检测，任意两次测定结果符合国标法两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值10%的要求。样品1两种方法测定的两个平均值采用t检验，t=0.206，自由度n=3-1=2， 查表，t0.05=4.303，故t 3 讨论
国标法标准曲线绘制中存在的问题。国标法中对标准曲线的绘制，没有说明使用什么样公式来绘制曲线。微生物的生长遵循生长曲线是S形，实验结果表明，采用不同多项式绘制标准曲线的拟合程度不同，采用四阶方程拟合程度好于采用二阶方程，建议统一采用四阶方程绘制标准曲线[8]。
通过实验结果，我们可以发现，改进后的方法对实验结果没有影响。改进后的方法只是对方法本身操作进行改进，并没有改变方法的基本原理，通过与国标方法比较发现，无论是标准曲线、样品测定还是加标回收都能达到国标法要求，改进后的方法操作起来更加方便、省时，主要体现在以下几点：
（1）减少分解，缩短除菌时间。维生素不稳定，容易受光和热的影响。样品处理过程中和培养基，通过过滤除菌，不但减少高压灭菌对维生素的破坏，也减少灭菌过程所消耗的时间。采用高压灭菌从升温到冷却，整个过程需要1个多小时，过滤除菌只需要十几分钟。
（2）减少移液管的调节次数，简化操作。国标法标准曲线和样品配制最后都只稀释成一个浓度，测定时标液和样品加入量都必须靠调整体积来实现，会造成移液管体积不停的变化。该方法完成一条标准曲线和一个样品的配制就需要使用超过42支试管，每支试管要加入标液或样液、蒸馏水和培养基三种，移液次数相当多，稍不留意就可能移错体积。改用先对标准曲线和样液进行系列稀释的办法，可以有效的减少移液管的调节次数，操作方式从每个步骤按标准调节移液体积，变成稀释后机械化移取相同体积，大大提高工作效率，减少人为因素带来的影响。
（3）减少菌种加入次数。采用将培养基预留部分做空白后，其余培养基统一接种的方法，可以有效消除单管接种接种量不同。统一接种和每支试管单一接种相比，可以大大减少接种时间，使整个过程更加流畅快捷。
虽然对方法进行了简化，但还是存在一些繁琐的地方，可以在今后工作中不断改进。如：分光光度计测定，一个样品几十个数据完成测定要2h左右。假如每次十几个样品，甚至更多，那将花费大量人力物力，可以考虑参照试剂盒的方法[9]，将培养好的培养液混匀后移取相同体积于96孔板，采用酶标仪读数，可以大大简化读数过程。此外，微生物法还可以从优化菌种、减少培养体系的体积等方面来对方法进行改进和优化，使方法进一步简化，可操作性更强。
参考文献
[1]周士胜，臧益民.B族维生素过量与心血管病风险[J].心脏杂志，2012，24（1）：110-113.
[2]张太昌，孟萌等.食物中维生素分析方法的研究进展[J].生物技术进展，2012，2（2）：116-123.
[3]刁立兰，李秀珍等.生物素测定方法的分析[J].食品与发酵工业，2007，33（6）：104-107.
[4]鲁盛静，田野.婴幼儿食品和乳制品中维生素B12测定的探讨[J].中国乳品工业，2013，41（2）：50-55.
[5]雷涛，张辉等.婴幼儿配方奶粉中水溶性维生素的检测方法研究[J].乳业科学与技术，2007，2：81-83.
[6]张艳，王甲威等.微生物法测定维生素的质量控制[J].中国乳品工业，2014，42（8）：54-57.
[7]GB 5413.16—2010.食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定[S].中华人民共和国卫生部，2010.
[8]唐靓，李跃中等.国标《食品中叶酸的测定》的标准曲线绘制与计算[J].中国卫生检验杂志，2009，19（7）：1681-1683.
[9]徐琼，王志伟等.国标法和试剂盒法对婴幼儿食品中生物素质量分数的测定[J].中国乳品工业，2014，42（7）：56-59.
关键词：奶粉 强化叶酸 测定方法 方法改进
中图分类号：R155.5 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）04-0035-03
维生素是维持人体生命活动必须的一类有机物质，大多数的维生素，机体不能合成或合成量不足，不能满足机体的需要，必须通过食物获得。水溶性维生素，在体内不能储存，所以每日需要从食物中获得一定的补充。维生素的缺乏会引起一些疾病，但维生素的摄取也不是越多越好，有研究表明，过多摄入维生素也会引起一些中毒[1]。因此，控制维生素每日摄入量尤为重要，特别是控制婴幼儿维生素的每日摄入量。目前国内对婴幼儿奶粉的需求非常高，婴幼儿奶粉中的维生素主要通过人为添加，所以准确的检测奶粉中维生素含量是保持维生素合理摄入的技术支撑。
目前维生素的测定方法包括：比色测定法、荧光测定法、薄层色谱法、高效液相色谱法、滴定分析法、蛋白质藕合法、毛细管电泳法、EILSA法、微生物法等[2-3]。在诸多方法中微生物法独特的优点，是其他方法无法替代的，包括测定被测组分的特异性、活性成分、灵敏度和结果准确性等。目前为止，美国公职分析化学家协会（AOAC）以及食品安全国家标准（GB5413—2010）都将微生物法作为叶酸、维生素B12、生物素等检测的首选方法和仲裁方法[4]。但微生物方法存在步骤繁琐、操作耗时、检测周期长、易受外部因素干扰等诸多问题[5]，需要对人员、设备、实验材料、实验方法、环境设施等各个环节进行有效控制[6]。本文通过对国家标准GB5413.16—2010[7]婴幼儿食品和乳制品中强化叶酸含量的测定方法进行改进，主要用于食品中强化叶酸的测定，改进后的方法与国标法相比，具有检测操作步骤简化，准确度与重现性与国标法相似。改进后的方法从维生素提取、试剂与标准物质配制、菌株接种等多方面进行改进，从而使得方法操作简便，一般实验员均可操作。
1 实验材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 样品
来自市场上销售的婴幼儿配方乳粉。
1.1.2 菌种
试验菌株为干酪乳杆菌（Lactobacillus leichmanniii ）ATCC 7469，购置于广东省微生物研究所。
1.1.3 材料和试剂
抗坏血酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾（天津化学试剂一厂），叶酸标准品（Accustandard公司），叶酸测定培养基和乳酸杆菌肉汤（BD公司），MRS（北京陆桥技术有限责任公司），无菌滤膜（上海津腾），无菌容量瓶，一次性注射器等。
1.1.4 仪器
AC2-4S1生物安全柜（新加坡ESCO公司），日本TOMY全自动灭菌锅，TU-1800SPC分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），RT-6000酶标仪（德国IFP），安泰超净工作台，SPX-800恒温培养箱，MVS-1型漩涡混合器，百得移液枪等。
1.2 实验方法
菌种制备以及国标法具体操作参见标准GB5413.16—2010，以下只将改进后的方法列出。
1.2.1 试剂配制
（1）无菌磷酸盐缓冲液：5.85 g磷酸二氢钾，1.22g磷酸氢二钾，用1000mL水溶解。临用前加入5g抗坏血酸钠溶解，然后用0.2μm无菌滤膜过滤至无菌容器。
（2）无菌培养基制备，准确称取9.4g干粉培养基于200mL烧杯，加入50mg抗坏血酸，加入100mL蒸馏水溶解后，煮沸1min～2min，迅速冷却后用0.2μm无菌滤膜过滤至无菌容器中。
（3）无菌叶酸标准曲线制备：称取55mg～56mg（精确至0.1 mg）叶酸标准品，用50mL蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，加入2mL的10.8%氨水，按纯度稀释至10ng/mL，用0.2μm无菌滤膜过滤至无菌容器，采用无菌操作准确移取10mL于100mL无菌容量瓶中，用无菌磷酸盐缓冲定容，此溶液叶酸含量为1ng/mL。采用无菌操作按表1进行制备，一式三份，S1为空白对照（直接移取5mL无菌蒸馏水和5mL无菌培养基），S2为参比空白，S2到S10中的培养基为每100mL无菌培养基中加入制备好的光密度为60%～80%菌液1mL的培养基。
1.2.2 乳粉样品处理
精确称取2.0g样品（精确至0.1 mg）于三角瓶中，加入40 mL磷酸盐缓冲液，混匀，100 ℃水浴5min，期间振荡至少3次，迅速冷却至室温，用磷酸盐缓冲液定容至100 mL，然后利用0.2μm无菌滤膜过滤至10 mL无菌离心管中，以下步骤采用无菌操作。用无菌磷酸盐缓冲液按产品标示值稀释至1ng/mL，按表2进行操作，一式三份，叶酸测定用培养基（1.2.1.2）为已接种好的培养基。
1.2.3 培养测定
将上述的所有试管放入培养箱中，36℃±1℃培养16h～24h后，进行光密度测定。
2 结果与分析
2.1 国标法和改进后方法标准曲线测定结果
从表3和表4可以看出，国标法和改进后方法标准曲线OD值均落在0～1之间，且OD值平均数差异不大，从表5可以看出改进后的方法与国标法标准曲线的吸光度基本重合，没有明显差异。综合图表，改进后的方法与国标法标准曲线没有明显差异，可以用于结果计算。 2.2 结果与分析（表6）
利用国标法和改进后方法对两个不同样品进行检测，任意两次测定结果符合国标法两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值10%的要求。样品1两种方法测定的两个平均值采用t检验，t=0.206，自由度n=3-1=2， 查表，t0.05=4.303，故t
国标法标准曲线绘制中存在的问题。国标法中对标准曲线的绘制，没有说明使用什么样公式来绘制曲线。微生物的生长遵循生长曲线是S形，实验结果表明，采用不同多项式绘制标准曲线的拟合程度不同，采用四阶方程拟合程度好于采用二阶方程，建议统一采用四阶方程绘制标准曲线[8]。
通过实验结果，我们可以发现，改进后的方法对实验结果没有影响。改进后的方法只是对方法本身操作进行改进，并没有改变方法的基本原理，通过与国标方法比较发现，无论是标准曲线、样品测定还是加标回收都能达到国标法要求，改进后的方法操作起来更加方便、省时，主要体现在以下几点：
（1）减少分解，缩短除菌时间。维生素不稳定，容易受光和热的影响。样品处理过程中和培养基，通过过滤除菌，不但减少高压灭菌对维生素的破坏，也减少灭菌过程所消耗的时间。采用高压灭菌从升温到冷却，整个过程需要1个多小时，过滤除菌只需要十几分钟。
（2）减少移液管的调节次数，简化操作。国标法标准曲线和样品配制最后都只稀释成一个浓度，测定时标液和样品加入量都必须靠调整体积来实现，会造成移液管体积不停的变化。该方法完成一条标准曲线和一个样品的配制就需要使用超过42支试管，每支试管要加入标液或样液、蒸馏水和培养基三种，移液次数相当多，稍不留意就可能移错体积。改用先对标准曲线和样液进行系列稀释的办法，可以有效的减少移液管的调节次数，操作方式从每个步骤按标准调节移液体积，变成稀释后机械化移取相同体积，大大提高工作效率，减少人为因素带来的影响。
（3）减少菌种加入次数。采用将培养基预留部分做空白后，其余培养基统一接种的方法，可以有效消除单管接种接种量不同。统一接种和每支试管单一接种相比，可以大大减少接种时间，使整个过程更加流畅快捷。
虽然对方法进行了简化，但还是存在一些繁琐的地方，可以在今后工作中不断改进。如：分光光度计测定，一个样品几十个数据完成测定要2h左右。假如每次十几个样品，甚至更多，那将花费大量人力物力，可以考虑参照试剂盒的方法[9]，将培养好的培养液混匀后移取相同体积于96孔板，采用酶标仪读数，可以大大简化读数过程。此外，微生物法还可以从优化菌种、减少培养体系的体积等方面来对方法进行改进和优化，使方法进一步简化，可操作性更强。
参考文献
[1]周士胜，臧益民.B族维生素过量与心血管病风险[J].心脏杂志，2012，24（1）：110-113.
[2]张太昌，孟萌等.食物中维生素分析方法的研究进展[J].生物技术进展，2012，2（2）：116-123.
[3]刁立兰，李秀珍等.生物素测定方法的分析[J].食品与发酵工业，2007，33（6）：104-107.
[4]鲁盛静，田野.婴幼儿食品和乳制品中维生素B12测定的探讨[J].中国乳品工业，2013，41（2）：50-55.
[5]雷涛，张辉等.婴幼儿配方奶粉中水溶性维生素的检测方法研究[J].乳业科学与技术，2007，2：81-83.
[6]张艳，王甲威等.微生物法测定维生素的质量控制[J].中国乳品工业，2014，42（8）：54-57.
[7]GB 5413.16—2010.食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定[S].中华人民共和国卫生部，2010.
[8]唐靓，李跃中等.国标《食品中叶酸的测定》的标准曲线绘制与计算[J].中国卫生检验杂志，2009，19（7）：1681-1683.
[9]徐琼，王志伟等.国标法和试剂盒法对婴幼儿食品中生物素质量分数的测定[J].中国乳品工业，2014，42（7）：56-59.