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摘 要:目的:建立了鹿茸口服液质量标准的研究方法。方法:TLC法定性鉴别鹿茸,HPLC法测定10-羟基-2-癸烯酸含量,凯氏定氮法测定样品中氨基酸含量(以含氮量计)。结果:TLC法斑点清晰,分離度好。10-羟基-2-癸烯酸在15.41μg·mL-1~308.20μg·mL-1浓度范围内具有良好线性关系,R=0.99996;平均回收率为99.15%,RSD(%)=0.46%。氨基酸含量测定方法重复性、回收率良好。结论:该质量标准的方法准确可靠,可用于鹿茸口服液的质量控制。
关键词:鹿茸口服液;鹿茸;10-羟基-2-癸烯酸;氮;TLC;HPLC
鹿茸口服液功能是温肾,生精养血,补髓健骨。临床用于畏寒无力,血虚眩晕,腰膝痿软。主要成分为鹿茸、蜂蜜,辅料成分为枸橼酸钠和香精。其中鹿茸和蜂蜜均含有丰富的氨基酸(以含氮量计),是药效的主要成分。蜂蜜中含有10-羟基二癸烯酸成分,具有抗菌、强壮机体、增强免疫力的作用,为更好的控制产品质量,建立了其质量标准,并对质量标准进行了准确、科学的验证实验考察。
1 仪器、试药和材料
Thermo高效液相色谱仪;凯氏定氮蒸馏装置;10-羟基-2-癸烯酸(中国药品生物制品检定所,批号:110812-200506,含量:97.6%),氯化铵标准物质(中国标准物质中心,纯度:98.7%);甲醇为色谱纯,磷酸二氢钾、磷酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、氢氧化钠、三氯醋酸、硫酸均为分析纯;鹿茸口服液(市售样品,规格:10ml/支)。硅胶G板(100mm×200mm,青岛海洋化工厂)。
2 方法
2.1 TLC定性鉴别
鹿茸。取鹿茸对照药材0.4g,加70%乙醇5ml,超声处理15分钟,滤过,取滤液对照药材溶液。取本品10ml,置水浴上挥醇,再加水10ml溶解,加20ml正丁醇萃取,振摇,离心10min(3000r/min),取正丁醇层,挥干,残渣加70%乙醇溶解,作为供试品溶液。照薄层色谱法试验,吸取供试品溶液和对照药材溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇一冰醋酸一水(3:l:1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以2%茚三酮丙酮溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的主斑点。
2.2 HPLC法定量测定
(1)10-羟基-2-癸烯酸。
2.2.1色谱条件:Diamond C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-0.05mol/L磷酸二钾溶液(用磷酸调节pH值至3.0)(75:25);检测波长为210nm;流速:1.0ml/min;柱温:35℃。进样量:20μl。
2.2.2 对照品溶液的制备:取10-羟基-2-癸烯酸对照品适量,精密称定,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。(每1ml约含10-羟基-2-癸烯酸0.15mg)
2.2.3 供试品溶液的制备:精密量取本品10ml,置50ml量瓶中,加甲醇适量,超声处理15分钟,用甲醇定容至刻度,摇匀,离心5min(3000r/min),取上清液1ml,至10ml量瓶中,甲醇稀释至刻度,摇匀,过0.45μm滤膜滤过,取续滤液,即得。
2.2.4 线性关系考察:精密称取对照品适量,加甲醇制成每1ml约含1.5mg 10-羟基-2-癸烯酸的储备液。精密量取储备液,用甲醇稀释成一系列浓度的对照品溶液。分别进样20μl,记录峰面积,以浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归。回归方程为Y=5.1437X-13.452(r=0.99996),10-羟基-2-癸烯酸在15.41μg·mL-1~308.20μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。
2.2.5 重复性试验:取同一批次样品,按供试品溶液制备方法,平行处理6份样品,精密吸取20μl注入液相色谱仪,测得6份样品各自含量,结果重复性试验含量RSD为0.74%,该方法重复性良好。
2.2.6 回收率试验:精密量取已知含量的本品5ml,共9份,分别加入已知量80%、100%、120%水平的对照品溶液各3份,按供试品溶液的制备方法,进行测定,计算回收率结果见表1。
结果表明,10-羟基-2-癸烯酸各浓度下的回收率均在98~102%之间,RSD小于2.0%,该方法准确可靠。
2.3 氮定量分析
2.3.1 供试品溶液制备:精密量取本品20ml,置500mL定氮瓶中,加硫酸钾8g、硫酸铜0.3g和硫酸20ml,将瓶以45°角斜置,开始用较低温度缓缓加热,使溶液温度保持在沸点以下,等泡沸停止后,逐步加大电力,待消化溶液沸腾,待溶液呈澄明的绿色后,继续加热30min,冷却后,转移至100ml量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀备用。同时做试剂空白试验。
2.3.2 蒸馏:取20g/L硼酸溶液10ml,置100ml锥形瓶中,加混合指示液(0.1%甲基红乙醇溶液2份,加0.2%溴甲酚绿乙醇溶液3份,混匀)3滴,将冷凝管尖端插入液面下,精密量取供试品溶液10ml,再加入400g/L氢氧化钠溶液10ml,用少量水洗漏斗数次,夹紧螺旋夹,进行水蒸汽蒸馏,从硼酸溶液开始由酒红色变为蓝绿色时起,蒸馏10分钟后,将冷凝管尖端提出液面,使蒸汽继续冲洗1分钟,用少量水冲洗尖端后,停止蒸馏。
2.3.3 滴定计算:将吸收液用馏出液用0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至由蓝绿色变为灰紫色为终点。每1ml盐酸标准滴定液(0.01mol/L)相当于0.1401mg的N。
2.3.4 重复性试验:取同一批次样品,平行测定6次,计算含量,重复性试验RSD为1.22%,该方法的重复性良好。
2.3.5 回收率试验:精密量取已知含量的本品10ml,共9份,分别置500mL定氮瓶中,精密加入氯化铵纯度标准物质(约相当于上述已有含氮量的80%、100%、120%水平各3份),按供试品溶液的制备、蒸馏、滴定,计算回收率,结果见表2。
结果表明,氮定量测定方法下各浓度的平均回收率均在98~102%之间,回收率RSD为0.91%,该方法准确,符合规定。
3 讨论
3.1 TLC鉴别:由于萃取过程中,不易分层,所以必须采取离心的方法,离心后分层效果明显。供试品点样量超过5μl,已饱和有水印,确定点样量为5μl。展开剂中正丁醇粘度比较大,展开速度慢。
3.2 氮定量分析:样品放入定氮瓶内时,不要粘附颈上,万一沾附可用少量水冲下,以免被检样消化不完全,结果偏低。如硫酸缺少,过多的硫酸钾会引起氨的损失,会形成硫酸氢钾,而不与氨作用。以硼酸为氨的吸收液,可省去标定碱液的操作,且硼酸的体积要求并不严格,可免去用移液管,操作比较简便。
参考文献
[1]姜汉硕,高岩,岩曲宁.高效液相色谱法测定王浆鹿茸口服液中10-羟基-2-癸烯酸的含量[J].中国卫生检验杂志,2008,18(5):840.
[2]郑达敏,杜憬生.鹿茸饮片总氮、氨基酸的含量测定[J].中医中药,2008,5(5):286~287.
[3]中华人民共和国药典(一部)[M].化学工业出版社,2015:323.
关键词:鹿茸口服液;鹿茸;10-羟基-2-癸烯酸;氮;TLC;HPLC
鹿茸口服液功能是温肾,生精养血,补髓健骨。临床用于畏寒无力,血虚眩晕,腰膝痿软。主要成分为鹿茸、蜂蜜,辅料成分为枸橼酸钠和香精。其中鹿茸和蜂蜜均含有丰富的氨基酸(以含氮量计),是药效的主要成分。蜂蜜中含有10-羟基二癸烯酸成分,具有抗菌、强壮机体、增强免疫力的作用,为更好的控制产品质量,建立了其质量标准,并对质量标准进行了准确、科学的验证实验考察。
1 仪器、试药和材料
Thermo高效液相色谱仪;凯氏定氮蒸馏装置;10-羟基-2-癸烯酸(中国药品生物制品检定所,批号:110812-200506,含量:97.6%),氯化铵标准物质(中国标准物质中心,纯度:98.7%);甲醇为色谱纯,磷酸二氢钾、磷酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、氢氧化钠、三氯醋酸、硫酸均为分析纯;鹿茸口服液(市售样品,规格:10ml/支)。硅胶G板(100mm×200mm,青岛海洋化工厂)。
2 方法
2.1 TLC定性鉴别
鹿茸。取鹿茸对照药材0.4g,加70%乙醇5ml,超声处理15分钟,滤过,取滤液对照药材溶液。取本品10ml,置水浴上挥醇,再加水10ml溶解,加20ml正丁醇萃取,振摇,离心10min(3000r/min),取正丁醇层,挥干,残渣加70%乙醇溶解,作为供试品溶液。照薄层色谱法试验,吸取供试品溶液和对照药材溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇一冰醋酸一水(3:l:1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以2%茚三酮丙酮溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的主斑点。
2.2 HPLC法定量测定
(1)10-羟基-2-癸烯酸。
2.2.1色谱条件:Diamond C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-0.05mol/L磷酸二钾溶液(用磷酸调节pH值至3.0)(75:25);检测波长为210nm;流速:1.0ml/min;柱温:35℃。进样量:20μl。
2.2.2 对照品溶液的制备:取10-羟基-2-癸烯酸对照品适量,精密称定,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。(每1ml约含10-羟基-2-癸烯酸0.15mg)
2.2.3 供试品溶液的制备:精密量取本品10ml,置50ml量瓶中,加甲醇适量,超声处理15分钟,用甲醇定容至刻度,摇匀,离心5min(3000r/min),取上清液1ml,至10ml量瓶中,甲醇稀释至刻度,摇匀,过0.45μm滤膜滤过,取续滤液,即得。
2.2.4 线性关系考察:精密称取对照品适量,加甲醇制成每1ml约含1.5mg 10-羟基-2-癸烯酸的储备液。精密量取储备液,用甲醇稀释成一系列浓度的对照品溶液。分别进样20μl,记录峰面积,以浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归。回归方程为Y=5.1437X-13.452(r=0.99996),10-羟基-2-癸烯酸在15.41μg·mL-1~308.20μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。
2.2.5 重复性试验:取同一批次样品,按供试品溶液制备方法,平行处理6份样品,精密吸取20μl注入液相色谱仪,测得6份样品各自含量,结果重复性试验含量RSD为0.74%,该方法重复性良好。
2.2.6 回收率试验:精密量取已知含量的本品5ml,共9份,分别加入已知量80%、100%、120%水平的对照品溶液各3份,按供试品溶液的制备方法,进行测定,计算回收率结果见表1。
结果表明,10-羟基-2-癸烯酸各浓度下的回收率均在98~102%之间,RSD小于2.0%,该方法准确可靠。
2.3 氮定量分析
2.3.1 供试品溶液制备:精密量取本品20ml,置500mL定氮瓶中,加硫酸钾8g、硫酸铜0.3g和硫酸20ml,将瓶以45°角斜置,开始用较低温度缓缓加热,使溶液温度保持在沸点以下,等泡沸停止后,逐步加大电力,待消化溶液沸腾,待溶液呈澄明的绿色后,继续加热30min,冷却后,转移至100ml量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀备用。同时做试剂空白试验。
2.3.2 蒸馏:取20g/L硼酸溶液10ml,置100ml锥形瓶中,加混合指示液(0.1%甲基红乙醇溶液2份,加0.2%溴甲酚绿乙醇溶液3份,混匀)3滴,将冷凝管尖端插入液面下,精密量取供试品溶液10ml,再加入400g/L氢氧化钠溶液10ml,用少量水洗漏斗数次,夹紧螺旋夹,进行水蒸汽蒸馏,从硼酸溶液开始由酒红色变为蓝绿色时起,蒸馏10分钟后,将冷凝管尖端提出液面,使蒸汽继续冲洗1分钟,用少量水冲洗尖端后,停止蒸馏。
2.3.3 滴定计算:将吸收液用馏出液用0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至由蓝绿色变为灰紫色为终点。每1ml盐酸标准滴定液(0.01mol/L)相当于0.1401mg的N。
2.3.4 重复性试验:取同一批次样品,平行测定6次,计算含量,重复性试验RSD为1.22%,该方法的重复性良好。
2.3.5 回收率试验:精密量取已知含量的本品10ml,共9份,分别置500mL定氮瓶中,精密加入氯化铵纯度标准物质(约相当于上述已有含氮量的80%、100%、120%水平各3份),按供试品溶液的制备、蒸馏、滴定,计算回收率,结果见表2。
结果表明,氮定量测定方法下各浓度的平均回收率均在98~102%之间,回收率RSD为0.91%,该方法准确,符合规定。
3 讨论
3.1 TLC鉴别:由于萃取过程中,不易分层,所以必须采取离心的方法,离心后分层效果明显。供试品点样量超过5μl,已饱和有水印,确定点样量为5μl。展开剂中正丁醇粘度比较大,展开速度慢。
3.2 氮定量分析:样品放入定氮瓶内时,不要粘附颈上,万一沾附可用少量水冲下,以免被检样消化不完全,结果偏低。如硫酸缺少,过多的硫酸钾会引起氨的损失,会形成硫酸氢钾,而不与氨作用。以硼酸为氨的吸收液,可省去标定碱液的操作,且硼酸的体积要求并不严格,可免去用移液管,操作比较简便。
参考文献
[1]姜汉硕,高岩,岩曲宁.高效液相色谱法测定王浆鹿茸口服液中10-羟基-2-癸烯酸的含量[J].中国卫生检验杂志,2008,18(5):840.
[2]郑达敏,杜憬生.鹿茸饮片总氮、氨基酸的含量测定[J].中医中药,2008,5(5):286~287.
[3]中华人民共和国药典(一部)[M].化学工业出版社,2015:323.