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摘要[目的]研究中草药白头翁中总黄酮的提取工艺。[方法]以白头翁为原料提取总黄酮，通过对影响白头翁中总黄酮得率的4种因素（料液比、提取温度、提取时间和乙醇浓度）进行单因素试验，确定白头翁中提取总黄酮的最佳工艺。[结果]白头翁中提取总黄酮的最佳条件为：料液比为1∶20，提取温度为70 ℃，提取时间为3 h，乙醇浓度为70%，此时，总黄酮得率为8.29%。[结论]该研究为建立白头翁黄酮的质量标准、有效地控制白头翁药材的质量奠定基础。
关键词白头翁；总黄酮；单因素试验；提取工艺
中图分类号S567.23文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）22-0088-02
Abstract[Objective] The research aimed to study the technology of extracting total flavonoids from Radix Pulsatillae.[Method]Using Radix Pulsatillae as raw material to extract total flavonoids，the optimum extraction technology of
total flavonoids from Radix Pulsatillae was determined by single factor test of four factors （solidliquid ratio，extraction temperature，extraction time and ethanol concentration） affecting the total flavonoid yield.[Result]The total flavonoid yield was 8.29% when the optimum extraction conditions were as follows：1∶20 solidliquid ratio，extraction temperature of 70 ℃，extraction time of 3 h，ethanol concentration of 70%.[Conclusion]This study laid the foundation for the establishment of quality standards for Radix Pulsatillae flavonoids and effective control of the quality of Radix Pulsatillae.
Key wordsRadix Pulsatillae；Total flavonoids；Single factor test；Extraction technology
白头翁（Radix Pulsatillae）是多年生毛莨科植物白頭翁的干燥根，其味苦，性寒，归胃、大肠经，具有清热解毒、凉血止痢的作用[1]。白头翁的根含有多种化学成分，主要有三萜皂苷类化合物、木质素类、香豆素、有机酸类以及黄酮类化合物，其中对于三萜皂苷类化合物、木质素类、香豆素、有机酸类早已有深入的研究，而对于白头翁中黄酮的化学成分有关文献报道较少[2-3]。黄酮类在白头翁属植物中含量丰富，具有抗氧化、抗过敏、延缓衰老、降血糖、抗肿瘤、降血压以及抗炎镇痛等作用[4]。目前，活性物质提取的方法较多，如物理方法（超声波法）、化学方法（溶剂法）和酶法，乙醇提取黄酮类化合物具有操作简便、成本低、无毒的优点[5]。因此，笔者以白头翁为原料进行黄酮类化合物的提取，对提取方案进行了方法学考察，为进一步开发中草药白头翁药用价值奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
白头翁购自北京同仁堂药店；芦丁对照品（纯度≥98%）购自中国药品生物制品检定所；盐酸、甲醇、无水乙醇、氯化钾、醋酸钠等试剂均为分析纯，购自于天津市天力化学试剂有限公司。
1.2試验仪器
UV-7504紫外可见分光光度计（上海精密仪器仪表有限公司），电子天平（LE204E/02 梅特勒-托利多仪器上海有限公司），
pH计（Sartorius PB-10），TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂制造），超声仪（深圳市洁盟清洗设备有限公司）。
1.3试验方法
1.3.1白头翁总黄酮的提取。
分别准确称取已粉碎的供试品药材白头翁样品10.0 g，置磨口的锥形瓶中，加入一定量不同浓度的乙醇为提取剂。在不同温度、时间、料液比等条件下回流提取，单因素考察白头翁总黄酮的提取工艺。
1.3.2标准曲线的绘制。称取干燥至恒重的芦丁对照品10.51 mg，用浓度70%乙醇定容到50 mL，使芦丁标准液浓度为0.210 2 mg/mL。精密量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的标准液于10 mL比色管中，加入5% NaNO2溶液0.3 mL，振摇均匀，放置6 min后，加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，振摇均匀，放置6 min后，再加入1 mol/L NaOH溶液4 mL，振摇均匀，用体积分数为30%的乙醇定容至刻度，振摇均匀，放置1.5 h后，采用紫外分光光度法，于510 nm测量吸光度。以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，以求得其回归方程和线性范围。黄酮提取率=（标准曲线计算的总黄酮质量/白头翁药材质量）×100%。
2结果与分析
2.1标准曲线根据“1.3.2”中的线性关系考察配制溶液后，采用紫外分光光度法，于510 nm测量吸光度。以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线（图1），求得其线性回归方程为：y=6.774 3x-0.005 9（R2=0.999 1），表明芦丁浓度在0～0.05 mg/mL与吸光度呈良好的线性关系。 2.2料液比对白头翁中总黄酮得率的影响
取样品4等份，每份10 g，以物料比例为变量（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30），控制其他条件相同测定吸光度。从图2可以看出，随着溶剂体积分数的增加，总黄酮得率升高。这主要是因为随着溶剂体积的增加，白头翁植物细胞壁内外溶液压差较大，溶剂对总黄酮的包容能力增加，有利于黄酮类化合物的溶出[6]，随着料液比的增加，总黄酮得率增加，但当料液比超过1∶20，总黄酮得率升高幅度较小，因此，该研究的最佳料液比为1∶20。
2.3提取温度对白头翁中总黄酮得率的影响
取样品4等份，每份10 g，以提取温度为变量（50、60、70、80、90 ℃），控制其他条件相同（料液比1∶20）测定吸光度。从图3可以看出，白头翁黄酮类化合物最佳提取温度为70 ℃，特别是在60～70 ℃，提取率上升幅度较大。这主要是随着提取温度的升高，溶剂分子运动速度加快，而且比较活跃，有利于进入提取原料中，从而将白头翁中的黄酮类化合物置换出来[7]。而当温度超过80 ℃以后，尽管溶剂分子有较高的运动速度，但黄酮类化合物属于活性物质，温度过高容易失活和分解，从而影响其提取率。因此，该研究的最佳提取温度为70 ℃。
2.4提取时间对白头翁中总黄酮得率的影响
取样品4等份，每份10 g，以提取时间为变量（1、2、3、4、5 h），控制其他条件相同（料液比1∶20、提取温度70
℃）测定吸光度。从图4可以看出，白头翁黄酮类化合物随着提取时间的延长，总黄酮得率不断升高，但超过3 h以后，总黄酮得率上升幅度较慢。这主要是由于提取前期，溶剂分子与白头翁中黄酮类化合物分子不断发生碰撞并交换，将白头翁中的黄酮类化合物置换到溶剂中，随着提取时间的延长，白头翁中黄酮类化合物分子较少，分子碰撞机会降低，同时，随着时间的延长，耗能较大。因此，该研究的最佳提取时间为3 h。
2.5乙醇浓度对白头翁中总黄酮得率的影响
取样品4等份，每份10 g，以提取乙醇浓度为变量（50%、60%、70%、80%、90%），控制其他条件相同（料液比1∶20）测定吸光度。从图5可以看出，白头翁黄酮类化合物随着乙醇浓度的提高，总黄酮得率逐渐升高，但当乙醇浓度超过70%以后，总黄酮得率呈下降趋势。这主要是因为选择乙醇作为有机溶剂进行提取，是根据“溶剂相似相溶”的原理进行提取的[8]，随着乙醇浓度的提高，除了有黄酮类化合物的浸出外，还有糖、鞣质、蛋白质等物质的溶出，降低了总黄酮得率。因此，该研究的最佳乙醇浓度为70%。
3结论
通过对料液比、提取温度、提取时间、乙醇浓度4种因素的考察，得到白头翁提取总黄酮的最佳试验方案为：料液比为1∶20，提取温度为70 ℃，提取时间为3 h，乙醇浓度为70%。在此条件下，经方法学考察各项指标良好后，测得白头翁中总黄酮的含量为8.29%。该研究为进一步开发白头翁中总黄酮提供物质基础，也为白头翁总黄酮的药理作用提供理论依据。
参考文献
[1]
王宏军，王术德，马魏，等.白头翁水溶性多糖提取工艺的研究[J].现代畜牧兽医，2014（2）：1-4.
[2] SHI Z X，YAO Y，ZHU Y Y，et al.Nutritional composition and antioxidant activity of twenty mung bean cultivars in China[J].The crop journal，2016，5（4）：398-406.
[3] 朱永杰，李常森，赵明晨，等.单因素试验优选白头翁多糖提取条件研究[J].畜牧与饲料科学，2017，38（3）：17-19.
[4] 李侠，邹基豪，王大为.响应面试验优化超声波-酶法提取绿豆皮黄酮类化合物工艺[J].食品科学，2017，32（8）：206-212.
[5] 曾林晖，邓泽元，余修亮，等.蜂胶黄酮的超声波提取工艺优化及其抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2016，37（12）：295-300.
[6] LUO J Q，CAI W X，WU T，et al.Phytochemical distribution in hull and cotyledon of adzuki bean （Vigna angularis L.） and mung bean （Vigna radiate L.），and their contribution to antioxidant，anti-inflammatory and anti-diabetic activities[J].Food chemistry，2016，201：350-360.
[7] JITENDRA K S，PATEL A K，ADSUL M，et al.Cellulase adsorption on lignin：A roadblock for economic hydrolysis of biomass [J].Renewable energy，2016，98：29-42.
[8] 趙文英，朱慶书，徐艳丽，等.白头翁皂苷提取方法比较及加压提取传质动力学[J].生物加工过程，2017，15（2）：35-40.
关键词白头翁；总黄酮；单因素试验；提取工艺
中图分类号S567.23文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）22-0088-02
Abstract[Objective] The research aimed to study the technology of extracting total flavonoids from Radix Pulsatillae.[Method]Using Radix Pulsatillae as raw material to extract total flavonoids，the optimum extraction technology of
total flavonoids from Radix Pulsatillae was determined by single factor test of four factors （solidliquid ratio，extraction temperature，extraction time and ethanol concentration） affecting the total flavonoid yield.[Result]The total flavonoid yield was 8.29% when the optimum extraction conditions were as follows：1∶20 solidliquid ratio，extraction temperature of 70 ℃，extraction time of 3 h，ethanol concentration of 70%.[Conclusion]This study laid the foundation for the establishment of quality standards for Radix Pulsatillae flavonoids and effective control of the quality of Radix Pulsatillae.
Key wordsRadix Pulsatillae；Total flavonoids；Single factor test；Extraction technology
白头翁（Radix Pulsatillae）是多年生毛莨科植物白頭翁的干燥根，其味苦，性寒，归胃、大肠经，具有清热解毒、凉血止痢的作用[1]。白头翁的根含有多种化学成分，主要有三萜皂苷类化合物、木质素类、香豆素、有机酸类以及黄酮类化合物，其中对于三萜皂苷类化合物、木质素类、香豆素、有机酸类早已有深入的研究，而对于白头翁中黄酮的化学成分有关文献报道较少[2-3]。黄酮类在白头翁属植物中含量丰富，具有抗氧化、抗过敏、延缓衰老、降血糖、抗肿瘤、降血压以及抗炎镇痛等作用[4]。目前，活性物质提取的方法较多，如物理方法（超声波法）、化学方法（溶剂法）和酶法，乙醇提取黄酮类化合物具有操作简便、成本低、无毒的优点[5]。因此，笔者以白头翁为原料进行黄酮类化合物的提取，对提取方案进行了方法学考察，为进一步开发中草药白头翁药用价值奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
白头翁购自北京同仁堂药店；芦丁对照品（纯度≥98%）购自中国药品生物制品检定所；盐酸、甲醇、无水乙醇、氯化钾、醋酸钠等试剂均为分析纯，购自于天津市天力化学试剂有限公司。
1.2試验仪器
UV-7504紫外可见分光光度计（上海精密仪器仪表有限公司），电子天平（LE204E/02 梅特勒-托利多仪器上海有限公司），
pH计（Sartorius PB-10），TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂制造），超声仪（深圳市洁盟清洗设备有限公司）。
1.3试验方法
1.3.1白头翁总黄酮的提取。
分别准确称取已粉碎的供试品药材白头翁样品10.0 g，置磨口的锥形瓶中，加入一定量不同浓度的乙醇为提取剂。在不同温度、时间、料液比等条件下回流提取，单因素考察白头翁总黄酮的提取工艺。
1.3.2标准曲线的绘制。称取干燥至恒重的芦丁对照品10.51 mg，用浓度70%乙醇定容到50 mL，使芦丁标准液浓度为0.210 2 mg/mL。精密量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的标准液于10 mL比色管中，加入5% NaNO2溶液0.3 mL，振摇均匀，放置6 min后，加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，振摇均匀，放置6 min后，再加入1 mol/L NaOH溶液4 mL，振摇均匀，用体积分数为30%的乙醇定容至刻度，振摇均匀，放置1.5 h后，采用紫外分光光度法，于510 nm测量吸光度。以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，以求得其回归方程和线性范围。黄酮提取率=（标准曲线计算的总黄酮质量/白头翁药材质量）×100%。
2结果与分析
2.1标准曲线根据“1.3.2”中的线性关系考察配制溶液后，采用紫外分光光度法，于510 nm测量吸光度。以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线（图1），求得其线性回归方程为：y=6.774 3x-0.005 9（R2=0.999 1），表明芦丁浓度在0～0.05 mg/mL与吸光度呈良好的线性关系。 2.2料液比对白头翁中总黄酮得率的影响
取样品4等份，每份10 g，以物料比例为变量（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30），控制其他条件相同测定吸光度。从图2可以看出，随着溶剂体积分数的增加，总黄酮得率升高。这主要是因为随着溶剂体积的增加，白头翁植物细胞壁内外溶液压差较大，溶剂对总黄酮的包容能力增加，有利于黄酮类化合物的溶出[6]，随着料液比的增加，总黄酮得率增加，但当料液比超过1∶20，总黄酮得率升高幅度较小，因此，该研究的最佳料液比为1∶20。
2.3提取温度对白头翁中总黄酮得率的影响
取样品4等份，每份10 g，以提取温度为变量（50、60、70、80、90 ℃），控制其他条件相同（料液比1∶20）测定吸光度。从图3可以看出，白头翁黄酮类化合物最佳提取温度为70 ℃，特别是在60～70 ℃，提取率上升幅度较大。这主要是随着提取温度的升高，溶剂分子运动速度加快，而且比较活跃，有利于进入提取原料中，从而将白头翁中的黄酮类化合物置换出来[7]。而当温度超过80 ℃以后，尽管溶剂分子有较高的运动速度，但黄酮类化合物属于活性物质，温度过高容易失活和分解，从而影响其提取率。因此，该研究的最佳提取温度为70 ℃。
2.4提取时间对白头翁中总黄酮得率的影响
取样品4等份，每份10 g，以提取时间为变量（1、2、3、4、5 h），控制其他条件相同（料液比1∶20、提取温度70
℃）测定吸光度。从图4可以看出，白头翁黄酮类化合物随着提取时间的延长，总黄酮得率不断升高，但超过3 h以后，总黄酮得率上升幅度较慢。这主要是由于提取前期，溶剂分子与白头翁中黄酮类化合物分子不断发生碰撞并交换，将白头翁中的黄酮类化合物置换到溶剂中，随着提取时间的延长，白头翁中黄酮类化合物分子较少，分子碰撞机会降低，同时，随着时间的延长，耗能较大。因此，该研究的最佳提取时间为3 h。
2.5乙醇浓度对白头翁中总黄酮得率的影响
取样品4等份，每份10 g，以提取乙醇浓度为变量（50%、60%、70%、80%、90%），控制其他条件相同（料液比1∶20）测定吸光度。从图5可以看出，白头翁黄酮类化合物随着乙醇浓度的提高，总黄酮得率逐渐升高，但当乙醇浓度超过70%以后，总黄酮得率呈下降趋势。这主要是因为选择乙醇作为有机溶剂进行提取，是根据“溶剂相似相溶”的原理进行提取的[8]，随着乙醇浓度的提高，除了有黄酮类化合物的浸出外，还有糖、鞣质、蛋白质等物质的溶出，降低了总黄酮得率。因此，该研究的最佳乙醇浓度为70%。
3结论
通过对料液比、提取温度、提取时间、乙醇浓度4种因素的考察，得到白头翁提取总黄酮的最佳试验方案为：料液比为1∶20，提取温度为70 ℃，提取时间为3 h，乙醇浓度为70%。在此条件下，经方法学考察各项指标良好后，测得白头翁中总黄酮的含量为8.29%。该研究为进一步开发白头翁中总黄酮提供物质基础，也为白头翁总黄酮的药理作用提供理论依据。
参考文献
[1]
王宏军，王术德，马魏，等.白头翁水溶性多糖提取工艺的研究[J].现代畜牧兽医，2014（2）：1-4.
[2] SHI Z X，YAO Y，ZHU Y Y，et al.Nutritional composition and antioxidant activity of twenty mung bean cultivars in China[J].The crop journal，2016，5（4）：398-406.
[3] 朱永杰，李常森，赵明晨，等.单因素试验优选白头翁多糖提取条件研究[J].畜牧与饲料科学，2017，38（3）：17-19.
[4] 李侠，邹基豪，王大为.响应面试验优化超声波-酶法提取绿豆皮黄酮类化合物工艺[J].食品科学，2017，32（8）：206-212.
[5] 曾林晖，邓泽元，余修亮，等.蜂胶黄酮的超声波提取工艺优化及其抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2016，37（12）：295-300.
[6] LUO J Q，CAI W X，WU T，et al.Phytochemical distribution in hull and cotyledon of adzuki bean （Vigna angularis L.） and mung bean （Vigna radiate L.），and their contribution to antioxidant，anti-inflammatory and anti-diabetic activities[J].Food chemistry，2016，201：350-360.
[7] JITENDRA K S，PATEL A K，ADSUL M，et al.Cellulase adsorption on lignin：A roadblock for economic hydrolysis of biomass [J].Renewable energy，2016，98：29-42.
[8] 趙文英，朱慶书，徐艳丽，等.白头翁皂苷提取方法比较及加压提取传质动力学[J].生物加工过程，2017，15（2）：35-40.