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摘要
[目的]通过对优选菌种长势较好的7株子实体组织分离后再培养，研究子实体生长情况，为北虫草菌种的复壮技术提供一定的理论依据。[方法]从子实体性状、产量及虫草多糖含量测定等方面进行比较研究。[结果]子实体颜色均为金黄色，可以保持母种的颜色性状；除C1-柄分离后，子实体的长相纤细，与母种长相粗壮有差异外，其他菌株头柄分离后子实体长相均可以保持母种的长相性状；除C3-柄、C5-柄、C6-柄外，其他分离菌株子实体的最大长度均高于母种；除C3-柄、C5-柄、C6-柄外，其他菌株分离子实体的产量均高于母种；各菌株不同分离部位组织分离后再培养子实体多糖含量与母种的多糖含量无明显差异。[结论]组织分离可作为获得北虫草优质菌种的有效方法之一。
关键词 北虫草； 组织分离；子实体
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）15-003-02
Study on Growth Status of Cordyceps militaris Tissue Isolation Fruiting Body
LI Qingmiao， GUO Junxia*， WANG Xiaoyu et al
（Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences， Chengdu， Sichuan 610041）
Abstract [Objective] To study status of Cordyceps militaris tissue isolation fruiting body growth， provide certain theory basis for the rejuvenation technology of Cordyceps militaris. [Method] The fruiting body traits， yield， Cordyceps polysaccharide content and other aspects were comparatively studied. [Result] Fruiting bodies are golden yellow color， can keep mother character； fruiting body appearance， can keep mother species character except C1 handle， the longest length of strain was isolated from the fruiting body， except the C3handle， C5handle， C6handle， the maximum length of the other strains were higher than the mother species； the yield of fruiting body were higher than the mother species except C3， C5， C6handle； No significant difference of polysaccharide content between the fruiting body and the mother species. [Conclusion] Tissue isolation method can be used as an effective method to obtain high quality strains of Cordyceps militaris.
Key words Cordyceps militaris； Tissue isolation； Fruiting body
北冬蟲夏草（Cordyceps militaris（L.ex Fr.）link）简称北虫草，又名蛹虫草，属子囊菌亚门核菌纲球壳菌目麦角菌科虫草属真菌，是虫草属的模式种，是同冬虫夏草极为相近的一个种，属药食两用真菌类[1]。经研究证实，其化学成分与冬虫夏草相近，含有虫草素、虫草酸、氧化物歧化酶（SOD）等生物活性物质及蛋白质、氨基酸、维生素及钙、锰、锌、硒等微量元素，与天然冬虫夏草有相似的医疗保健功效[1]，是冬虫夏草的理想替代品。虫草中的各种活性成分具有不同的功效。虫草氨基酸是虫草补益强壮作用和增强免疫功能的物质基础之一[2]；多糖及核苷酸类的有效成分能够抗肿瘤、保护肝脏、延缓衰老[3]；虫草酸可以预防血栓的形成， 对各种类型的肺部疾病和支气管哮喘也有很好的疗效；虫草素作为细胞毒性物质具有增强免疫力、抗肿瘤等药理作用。
目前，北虫草的人工培育及其产业化研究成为国内外研究的热点，而优良菌种是提高蛹虫草子实体生产效率和产品质量的前提条件。组织分离是通过食用菌子实体的部分组织来获得纯菌种的技术[4]。研究证实，采取组织分离法所获得的纯培养遗传性状稳定、变异小，是获得优良菌种的一种有效、简便的方法。通过对优选菌种长势较好的子实体组织分离再培养后，从子实体性状、产量及虫草多糖含量测定等方面，对组织分离子实体遗传性状的稳定性进行分析，同时从培养后的子实体中优选优质菌株，对母种进行复壮，为北虫草的工厂化生产提供优质菌种。
1 材料与方法
1.1 材料
前期试验优选菌种长势较好的子实体有C1～C7菌株。主要试剂均为国产分析纯，市售。
1.2 方法
1.2.1
栽培培养基。组成为：大米40 g，2%葡萄糖，0.2% KH2PO4，0.1%MgSO4，1.5%蛋白胨，0.5%酵母粉，0.05%复合微生素B。
1.2.2 接种方法。
将组织分离菌丝发菌培养后，转接于大米栽培培养基中，每罐头瓶接种量为2 cm2，各菌株转接10瓶。在菌丝培养阶段，温度20 ℃，湿度65%，暗培养；待菌丝长满基后即转入室内，自然光照，在温度19 ℃、湿度65%条件下转色；在温度22 ℃、湿度80%条件下催蕾，子实体生长；待子实体产生尖端膨大，有细粉状孢子形成时采收。
1.2.3
子实体多糖含量的测定。采用硫酸-苯酚法[5]，测定子实体多糖含量。
1.2.3.1
葡萄糖标准曲线。
精确称取105 ℃干燥恒重的葡萄糖100 mg，置于100 ml容量瓶中，定容，摇匀。取1 ml 溶液定容于25 ml 容量瓶中，摇匀，备用。
分别吸取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 ml，用蒸馏水补充至2 ml，加入浓度5%苯酚溶液1 ml，静置10 min，摇匀，室温下放置20 min，在490 nm处测定吸光度值（以2.0 ml蒸馏水为空白），得到回归方程为：A=6.476 3C-0.044 7（R=0.999 2）。
式中，A为吸光度；C为葡萄糖含量。
1.2.3.2
样品处理方法。将
子实体干燥样品打粉，精确称样0.5 g，索氏抽提4 h，向抽提液中加活性碳脱色，过滤，80 ℃水浴浓缩至一定体积，加无水乙醇配制成浓度80%乙醇液，冰箱静置12 h， 过滤，用浓度80%乙醇50 ml 洗涤。将沉淀溶解于80 ml热水中，冷却，采取Sevag法反复5次去蛋白，于水浴上挥去有机相。最后，移入50 ml容量瓶中，冷却，定容，备用。
1.2.3.3
测定。
精密吸取样品处理液2.0 ml，置于10 ml比色管中。空白吸取2.0 ml蒸馏水，置于10 ml比色管中。向样品管和空白管中加入浓度5%苯酚溶液1.0 ml，摇匀，迅速加浓硫酸5.0 ml，摇匀，放置5 min，然后置于沸水浴中加热1
2 结果与分析
2.1 各菌株不同分离部位组织分离后子实体生长情况
由表1、表2可知，在不同菌株头柄组织分离后，其子实体颜色均为金黄色，都可以保持母种的颜色性状；除C1-柄分离后，子实体的长相纤细，与母种长相粗壮有差异外，其他菌株头柄分离后子实体长相均可以保持母种的长相性状；与母种菌株长度相比，各分离菌株最大长度C1-头、柄分别增长1.2、0.8 cm，C2-头、柄分别增长0.8、1.0 cm，C3-头、柄分别增长0.1、-0.2、C4-头、柄分别增长0.7、1.3 cm，C5-头、柄分别增长0.8、-0.4 cm、C6-头、柄分别增长-0.6、-2.0 cm，C7-头、柄分别增长2.7、1.1 cm。除C3-柄、C5-柄、C6-头、柄外，其他分离菌株子实体的长度均高于母种。由此可知，北虫草菌株经组织分离后再培养子实体可保持母种颜色、长相性状，分离后所有子实体中的最大长度比母种子实体的长度长2.7 cm。所以，从北虫草组织分离后代
2.2 各菌株不同分离部位组织分离后子实体每瓶平均产量
由图1可知，各菌株子实体不同部位组织分离后再培养子实体的每瓶平均产量不同。与母种子实体产量相比，除C3-柄、C4-柄、C6-头、柄外，其他分离菌株子实体的每瓶产
量均高于母种。
2.3 各菌株不同分离部位组织分离后子实体多糖含量
经测定，母种、C1-头、C1-柄、C2-头、C2-柄、C3-头、C3-柄、C4-头、C4-柄、C5-头、C5-柄、C6-头、C6-柄、C7-头、C7-柄多糖含量分别为2.7%、2.4%、2.4%、28%、28%、2.4%、2.4%、2.5%、2.5%、2.6%、2.6%、2.3%、23%、2.8%、2.8%。可见，
各菌株不同分离部位组织分离后再培养子实体多糖含量与母种的多糖含量无明显差异。北虫草子实体组织分离后仍可保持母种的原有质量。
3 讨论
通过对原菌种菌株子实体组织分离后再培养，发现子实体颜色均为金黄色，都可以保持母种的颜色性状；除C1-柄分离后，子实体的长相纤细，与母种长相粗壮有差异外，其他菌株头柄分离后子实体长相均可以保持母种的长相性状；除C3-柄、C5-柄、C6-柄外，其他分离菌株子实体的长度均高于母种；除C3-柄、C5-柄、C6-柄外，其他菌株分离子实体的产量均高于母种；各菌株不同分离部位组织分离后再培养子实体多糖含量与母种的多糖含量无明显差异。北虫草子实体组织分离后仍可保持母种的原有质量。
由此可知，北虫草子实体组织分离后再培养可保持母种的优良性状和质量的稳定性，且产量有所增加。组织分离可以作为获得北虫草优质种质的有效方法之一。
参考文献
[1]
高平.蛹虫草优质高产栽培技术[J].吕梁高等专科学校学报，2007，23（1）：15-16.
[2] 石继红，党化宇，万一，等.冬虫夏草菌丝体与天然冬虫夏草蛋白成分的分析比较[J].药物生物技术，2003，10（5）：304-307.
[3] 刘东颖.冬虫夏草诱导乳癌细胞MCF7凋亡的实验研究[J].河北中医，2007，29（1）：66.
[4] 黄年来.中国食用菌百科[M].北京： 中国农业出版社，1997：176- 177.
[5] 鲁晓岩.硫酸―苯酚法测定北冬虫夏草多糖含量[J].食品工业科技，2002，23（4）：69-70.
[目的]通过对优选菌种长势较好的7株子实体组织分离后再培养，研究子实体生长情况，为北虫草菌种的复壮技术提供一定的理论依据。[方法]从子实体性状、产量及虫草多糖含量测定等方面进行比较研究。[结果]子实体颜色均为金黄色，可以保持母种的颜色性状；除C1-柄分离后，子实体的长相纤细，与母种长相粗壮有差异外，其他菌株头柄分离后子实体长相均可以保持母种的长相性状；除C3-柄、C5-柄、C6-柄外，其他分离菌株子实体的最大长度均高于母种；除C3-柄、C5-柄、C6-柄外，其他菌株分离子实体的产量均高于母种；各菌株不同分离部位组织分离后再培养子实体多糖含量与母种的多糖含量无明显差异。[结论]组织分离可作为获得北虫草优质菌种的有效方法之一。
关键词 北虫草； 组织分离；子实体
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）15-003-02
Study on Growth Status of Cordyceps militaris Tissue Isolation Fruiting Body
LI Qingmiao， GUO Junxia*， WANG Xiaoyu et al
（Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences， Chengdu， Sichuan 610041）
Abstract [Objective] To study status of Cordyceps militaris tissue isolation fruiting body growth， provide certain theory basis for the rejuvenation technology of Cordyceps militaris. [Method] The fruiting body traits， yield， Cordyceps polysaccharide content and other aspects were comparatively studied. [Result] Fruiting bodies are golden yellow color， can keep mother character； fruiting body appearance， can keep mother species character except C1 handle， the longest length of strain was isolated from the fruiting body， except the C3handle， C5handle， C6handle， the maximum length of the other strains were higher than the mother species； the yield of fruiting body were higher than the mother species except C3， C5， C6handle； No significant difference of polysaccharide content between the fruiting body and the mother species. [Conclusion] Tissue isolation method can be used as an effective method to obtain high quality strains of Cordyceps militaris.
Key words Cordyceps militaris； Tissue isolation； Fruiting body
北冬蟲夏草（Cordyceps militaris（L.ex Fr.）link）简称北虫草，又名蛹虫草，属子囊菌亚门核菌纲球壳菌目麦角菌科虫草属真菌，是虫草属的模式种，是同冬虫夏草极为相近的一个种，属药食两用真菌类[1]。经研究证实，其化学成分与冬虫夏草相近，含有虫草素、虫草酸、氧化物歧化酶（SOD）等生物活性物质及蛋白质、氨基酸、维生素及钙、锰、锌、硒等微量元素，与天然冬虫夏草有相似的医疗保健功效[1]，是冬虫夏草的理想替代品。虫草中的各种活性成分具有不同的功效。虫草氨基酸是虫草补益强壮作用和增强免疫功能的物质基础之一[2]；多糖及核苷酸类的有效成分能够抗肿瘤、保护肝脏、延缓衰老[3]；虫草酸可以预防血栓的形成， 对各种类型的肺部疾病和支气管哮喘也有很好的疗效；虫草素作为细胞毒性物质具有增强免疫力、抗肿瘤等药理作用。
目前，北虫草的人工培育及其产业化研究成为国内外研究的热点，而优良菌种是提高蛹虫草子实体生产效率和产品质量的前提条件。组织分离是通过食用菌子实体的部分组织来获得纯菌种的技术[4]。研究证实，采取组织分离法所获得的纯培养遗传性状稳定、变异小，是获得优良菌种的一种有效、简便的方法。通过对优选菌种长势较好的子实体组织分离再培养后，从子实体性状、产量及虫草多糖含量测定等方面，对组织分离子实体遗传性状的稳定性进行分析，同时从培养后的子实体中优选优质菌株，对母种进行复壮，为北虫草的工厂化生产提供优质菌种。
1 材料与方法
1.1 材料
前期试验优选菌种长势较好的子实体有C1～C7菌株。主要试剂均为国产分析纯，市售。
1.2 方法
1.2.1
栽培培养基。组成为：大米40 g，2%葡萄糖，0.2% KH2PO4，0.1%MgSO4，1.5%蛋白胨，0.5%酵母粉，0.05%复合微生素B。
1.2.2 接种方法。
将组织分离菌丝发菌培养后，转接于大米栽培培养基中，每罐头瓶接种量为2 cm2，各菌株转接10瓶。在菌丝培养阶段，温度20 ℃，湿度65%，暗培养；待菌丝长满基后即转入室内，自然光照，在温度19 ℃、湿度65%条件下转色；在温度22 ℃、湿度80%条件下催蕾，子实体生长；待子实体产生尖端膨大，有细粉状孢子形成时采收。
1.2.3
子实体多糖含量的测定。采用硫酸-苯酚法[5]，测定子实体多糖含量。
1.2.3.1
葡萄糖标准曲线。
精确称取105 ℃干燥恒重的葡萄糖100 mg，置于100 ml容量瓶中，定容，摇匀。取1 ml 溶液定容于25 ml 容量瓶中，摇匀，备用。
分别吸取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 ml，用蒸馏水补充至2 ml，加入浓度5%苯酚溶液1 ml，静置10 min，摇匀，室温下放置20 min，在490 nm处测定吸光度值（以2.0 ml蒸馏水为空白），得到回归方程为：A=6.476 3C-0.044 7（R=0.999 2）。
式中，A为吸光度；C为葡萄糖含量。
1.2.3.2
样品处理方法。将
子实体干燥样品打粉，精确称样0.5 g，索氏抽提4 h，向抽提液中加活性碳脱色，过滤，80 ℃水浴浓缩至一定体积，加无水乙醇配制成浓度80%乙醇液，冰箱静置12 h， 过滤，用浓度80%乙醇50 ml 洗涤。将沉淀溶解于80 ml热水中，冷却，采取Sevag法反复5次去蛋白，于水浴上挥去有机相。最后，移入50 ml容量瓶中，冷却，定容，备用。
1.2.3.3
测定。
精密吸取样品处理液2.0 ml，置于10 ml比色管中。空白吸取2.0 ml蒸馏水，置于10 ml比色管中。向样品管和空白管中加入浓度5%苯酚溶液1.0 ml，摇匀，迅速加浓硫酸5.0 ml，摇匀，放置5 min，然后置于沸水浴中加热1
2 结果与分析
2.1 各菌株不同分离部位组织分离后子实体生长情况
由表1、表2可知，在不同菌株头柄组织分离后，其子实体颜色均为金黄色，都可以保持母种的颜色性状；除C1-柄分离后，子实体的长相纤细，与母种长相粗壮有差异外，其他菌株头柄分离后子实体长相均可以保持母种的长相性状；与母种菌株长度相比，各分离菌株最大长度C1-头、柄分别增长1.2、0.8 cm，C2-头、柄分别增长0.8、1.0 cm，C3-头、柄分别增长0.1、-0.2、C4-头、柄分别增长0.7、1.3 cm，C5-头、柄分别增长0.8、-0.4 cm、C6-头、柄分别增长-0.6、-2.0 cm，C7-头、柄分别增长2.7、1.1 cm。除C3-柄、C5-柄、C6-头、柄外，其他分离菌株子实体的长度均高于母种。由此可知，北虫草菌株经组织分离后再培养子实体可保持母种颜色、长相性状，分离后所有子实体中的最大长度比母种子实体的长度长2.7 cm。所以，从北虫草组织分离后代
2.2 各菌株不同分离部位组织分离后子实体每瓶平均产量
由图1可知，各菌株子实体不同部位组织分离后再培养子实体的每瓶平均产量不同。与母种子实体产量相比，除C3-柄、C4-柄、C6-头、柄外，其他分离菌株子实体的每瓶产
量均高于母种。
2.3 各菌株不同分离部位组织分离后子实体多糖含量
经测定，母种、C1-头、C1-柄、C2-头、C2-柄、C3-头、C3-柄、C4-头、C4-柄、C5-头、C5-柄、C6-头、C6-柄、C7-头、C7-柄多糖含量分别为2.7%、2.4%、2.4%、28%、28%、2.4%、2.4%、2.5%、2.5%、2.6%、2.6%、2.3%、23%、2.8%、2.8%。可见，
各菌株不同分离部位组织分离后再培养子实体多糖含量与母种的多糖含量无明显差异。北虫草子实体组织分离后仍可保持母种的原有质量。
3 讨论
通过对原菌种菌株子实体组织分离后再培养，发现子实体颜色均为金黄色，都可以保持母种的颜色性状；除C1-柄分离后，子实体的长相纤细，与母种长相粗壮有差异外，其他菌株头柄分离后子实体长相均可以保持母种的长相性状；除C3-柄、C5-柄、C6-柄外，其他分离菌株子实体的长度均高于母种；除C3-柄、C5-柄、C6-柄外，其他菌株分离子实体的产量均高于母种；各菌株不同分离部位组织分离后再培养子实体多糖含量与母种的多糖含量无明显差异。北虫草子实体组织分离后仍可保持母种的原有质量。
由此可知，北虫草子实体组织分离后再培养可保持母种的优良性状和质量的稳定性，且产量有所增加。组织分离可以作为获得北虫草优质种质的有效方法之一。
参考文献
[1]
高平.蛹虫草优质高产栽培技术[J].吕梁高等专科学校学报，2007，23（1）：15-16.
[2] 石继红，党化宇，万一，等.冬虫夏草菌丝体与天然冬虫夏草蛋白成分的分析比较[J].药物生物技术，2003，10（5）：304-307.
[3] 刘东颖.冬虫夏草诱导乳癌细胞MCF7凋亡的实验研究[J].河北中医，2007，29（1）：66.
[4] 黄年来.中国食用菌百科[M].北京： 中国农业出版社，1997：176- 177.
[5] 鲁晓岩.硫酸―苯酚法测定北冬虫夏草多糖含量[J].食品工业科技，2002，23（4）：69-70.