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摘 要：目的：探讨伊柔抗皱美白精华素延缓老鼠皮肤衰老的作用机制。方法：采用D-半乳糖对裸鼠颈背部皮下连续注射，并结合长波长和短波长紫外线照射裸鼠皮肤，建造裸鼠皮肤亚急性衰老及光老化动物模型，测定皮肤组织中与皱纹产生的几种生化指标：超氧化物歧化酶（SOD）的活性、丙二醛（MDA）以及羟脯氨酸（HYP）含量。结果：正常组、对照组和实验组与模型组裸鼠皮肤比较，皮肤组织中的超氧化物歧化酶（SOD）活力、HYP的含量明显高于模型组，而丙二醛（MDA）的含量明显低于模型组。结论：伊柔抗皱美白精华素具有延缓裸皮肤衰老的作用。
关键词： 伊柔抗皱美白精华素；皮肤衰老；SOD；MDA；HYP
衰老最直观的变化即为皮肤晦暗、出现皱纹、色素沉着等，不仅有损美容，而且同许多皮肤病如脂溢性角化、日光性角化、基底细胞癌等的发生有着病因学的关系。因此，预防和延缓皮肤衰老已成为生命科学研究的热点之一。本实验应用D-半乳糖注射和光照联用，建立亚急性皮肤衰老和光老化模型，对裸鼠皮肤组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性、羟脯氨酸(HYP)含量、丙二醛(MDA)含量进行检测，探讨伊柔抗皱美白精华素延缓皮肤衰老的作用机制，为其抗衰老作用提供实验依据[1~2]。
1 实验材料
1.1 试药
D-半乳糖（上海聚源生物试厂提供 批号：090902）； SOD试剂盒(南京建成生物研究所 批号：091117 )；MDA试剂盒（南京建成生物研究所 批号;091117）；HYP试剂盒（南京建成生物研究所 批号：091121）；羽西凝无痕精华素（9F197）；伊柔抗皱美白精华素（第三军医大学大坪医院提供 批号：091103）；生理盐水（四川科伦药业股份有限公司号;091012）其他试剂均为国产分析纯。
1.2 动物
健康1月龄雄性裸鼠40只，体重14±2g（中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，许可证号：SCXK-(军)2007-004）。
1.3 仪器
超声粉碎仪（VCX750型美国SONICS）；低温离心机（C5-15R型 美国BECKMAN）；低温冰箱(NU-6352E型 日本NUAIR)；紫外分光光度计（DU-800型 美国BECKMAN）；电子天平（BP110型 德国Sartorius）；高温试验箱（WG-01型 重庆万达仪器有限公司）；电热恒温水温箱（BHW-2型 北京医疗设备厂）；紫外线强度计（KUV254型 武汉康威达卫生保健有限公司）；长波长和短波长紫外灯各2支。
2 实验方法
2.1 动物分组、给药及制造模型[3]
每组10只，随机分为4组：①正常组：正常条件饲养，不做注射和光照处理。②模型组：每日颈背部皮下注射D-半乳糖（1000mg/kg），并结合长波长（365nm）和短波长（254nm）紫外线照射背部皮肤，长波长紫外线累积照射强度为259.5J/㎝2,短波长累积照射强度6.482J/㎝2。③对照组：注射和光照同模型组，在注射和光照的基础上再向其背部涂抹羽西凝无痕精华素，每日2次，0.2g/次。④实验组：注射和光照同模型组，在注射和光照的基础上再向其背部涂抹伊柔皱抗皱美白精华素，每日2次，0.2g/次。
连续注射和光照6周，待模型组行动迟缓，背部皱纹明显，呈现明显的衰老体征，停药2天后处死取皮进行各项生化指标的测定，并对四组裸鼠体重及脏器质量进行比较。
2.2 裸鼠皮肤组织匀浆（10%）的制备[4]-【6】
取裸鼠背部皮肤组织块1g左右，经预冷生理盐水漂洗，出去皮下脂肪和其他结缔组织，滤纸拭干，称重，量筒量取该组织9倍重量的生理盐水，去2/3倒入装有组织块的烧研钵中，眼科小剪剪碎后，研磨15分钟后将粗匀浆倒入到小烧杯内，用剩余1/3的生理盐水冲洗研钵，用超声粉碎仪（强度25%）冰浴中连续粉碎3分钟，然后反复冻融3次，使细胞内容物完全游离于液相中。将组织匀浆在离心机中3500r/min离心15分钟，取上清液进行测定。
2.3 皮肤组织匀浆中生化指标的测定
2.3.1 皮肤组织匀浆中SOD活力、（HYP）含量、MDA含量的测定
参照南京建成生物工程公司SOD、HYP和MDA试剂盒说明书方法测定，单位分别为U.mL-1、g.mL-1 和 nmol.mL-1。
2.3.2统计学方法
spss13.0统计软件分析数据，正态性检验，采用方差分析计算资料以X±s表示，以P﹤0.05,P﹤0.01表示有统计学意义。
3结果
裸鼠皮肤组织中生化指标的测定结果表1。
表 1裸鼠皮肤组织中生化指标的测定结果
（ n=10X±s ）
从表1中SOD数据显示，正常组和模型组相比，模型组裸鼠皮肤组织中SOD活力明显降低，具有显著性差异（P﹤0.01），提示皮肤自由基防护功能下降，对照组和实验组与正常组相比无显著性差异（P﹥0.01）；HYP检测数据显示，模型组比正常组裸鼠皮肤组织中的羟脯氨酸含量显著减少（P﹤0.05），而对照组和实验组与模型组相比，裸鼠皮肤组织中羟脯氨酸含量显著增加（P﹤0.01）；MDA检测数据显示，模型组与正常组比较有极显著性差异（P﹤0.01）、对照组、实验组与正常组比较无显著性差异(P﹥0.05)，说明皮肤脂质过氧化产物堆积增加。
4讨论
随着年龄增长，皮肤衰老是人体老化的外在表现，体内抗氧化酶类逐渐减少，皮肤防护功能减退或发生障碍，自由基累积性增加，造成皮肤内各种大分子损伤，导致皮肤的衰老和病变。HYP是真皮内含量丰富而且比较稳定的氨基酸，是胶原蛋白特有的氨基酸之一，其含量可以间接反映出真皮内胶原蛋白量的变化，而胶原含量的变化可以提示皮肤的衰老程度。故可作为判定皮肤衰老程度的一个特殊而敏感的指标 ；SOD是一种生物活性蛋白质,在抗衰老防御物质中,可阻断各种色斑、粉刺、皱纹的发生与发展，是最有效的抗氧化剂和自由基清除剂；MDA是脂质过氧，其含量可以间接反映自由基的产生情况和机体组织细胞的过氧化程度。紫外线照射会造成小鼠皮肤组织SOD活性显著下降，HYP含量下降及MDA含量增加，可以造成裸鼠皮肤光老化。
结果显示：D-半乳糖注射和光照联用所致的裸鼠皮肤亚急性衰老与光老化模型建造可靠，实验组与对照组涂抹供试品后能提高裸鼠皮肤组织中SOD活性和HYP含量，并能降低MDA含量。本实验提示：抗皱美白精华素有延缓皮肤衰老化作用，分析其作用机制主要是通过提高SOD活性和羟脯氨酸的含量，减少自由基代谢产物的堆积等方面的而发挥协同作用。
参考文献：
[1] 朱文元，陈力.皱纹产生的影响因素及发生机制[J].美容皮肤医学新进展，2009：33-34
[2] 王红丽，吴铁，吴志华等.小鼠亚急性皮肤衰老模型的建立[J].中国药学杂志，2003，38（10）：763-765.
[3] 石丽君，吴铁，吴志华. D-半乳糖诱导大鼠皮肤衰老的形态学和生化指标观察[J].中华皮肤科杂志，2005，38（3）：165-167.
[4]于向荣，王小丽.悦容丹康皮肤光老化的机理研究[J].宜春学院学报，2008，30（2）：12-13
[5] 徐叔云，卞如濂，陈修，药理学实验方法[M].第二版，北京：人民卫生出版社：1485-1486
[6] 周文丽，周婷婷，张建鹏等. 贻贝多糖对老龄SDT大鼠抗衰老作用[J].第二军医大学学报，2009，30（7）：386-389
关键词： 伊柔抗皱美白精华素；皮肤衰老；SOD；MDA；HYP
衰老最直观的变化即为皮肤晦暗、出现皱纹、色素沉着等，不仅有损美容，而且同许多皮肤病如脂溢性角化、日光性角化、基底细胞癌等的发生有着病因学的关系。因此，预防和延缓皮肤衰老已成为生命科学研究的热点之一。本实验应用D-半乳糖注射和光照联用，建立亚急性皮肤衰老和光老化模型，对裸鼠皮肤组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性、羟脯氨酸(HYP)含量、丙二醛(MDA)含量进行检测，探讨伊柔抗皱美白精华素延缓皮肤衰老的作用机制，为其抗衰老作用提供实验依据[1~2]。
1 实验材料
1.1 试药
D-半乳糖（上海聚源生物试厂提供 批号：090902）； SOD试剂盒(南京建成生物研究所 批号：091117 )；MDA试剂盒（南京建成生物研究所 批号;091117）；HYP试剂盒（南京建成生物研究所 批号：091121）；羽西凝无痕精华素（9F197）；伊柔抗皱美白精华素（第三军医大学大坪医院提供 批号：091103）；生理盐水（四川科伦药业股份有限公司号;091012）其他试剂均为国产分析纯。
1.2 动物
健康1月龄雄性裸鼠40只，体重14±2g（中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，许可证号：SCXK-(军)2007-004）。
1.3 仪器
超声粉碎仪（VCX750型美国SONICS）；低温离心机（C5-15R型 美国BECKMAN）；低温冰箱(NU-6352E型 日本NUAIR)；紫外分光光度计（DU-800型 美国BECKMAN）；电子天平（BP110型 德国Sartorius）；高温试验箱（WG-01型 重庆万达仪器有限公司）；电热恒温水温箱（BHW-2型 北京医疗设备厂）；紫外线强度计（KUV254型 武汉康威达卫生保健有限公司）；长波长和短波长紫外灯各2支。
2 实验方法
2.1 动物分组、给药及制造模型[3]
每组10只，随机分为4组：①正常组：正常条件饲养，不做注射和光照处理。②模型组：每日颈背部皮下注射D-半乳糖（1000mg/kg），并结合长波长（365nm）和短波长（254nm）紫外线照射背部皮肤，长波长紫外线累积照射强度为259.5J/㎝2,短波长累积照射强度6.482J/㎝2。③对照组：注射和光照同模型组，在注射和光照的基础上再向其背部涂抹羽西凝无痕精华素，每日2次，0.2g/次。④实验组：注射和光照同模型组，在注射和光照的基础上再向其背部涂抹伊柔皱抗皱美白精华素，每日2次，0.2g/次。
连续注射和光照6周，待模型组行动迟缓，背部皱纹明显，呈现明显的衰老体征，停药2天后处死取皮进行各项生化指标的测定，并对四组裸鼠体重及脏器质量进行比较。
2.2 裸鼠皮肤组织匀浆（10%）的制备[4]-【6】
取裸鼠背部皮肤组织块1g左右，经预冷生理盐水漂洗，出去皮下脂肪和其他结缔组织，滤纸拭干，称重，量筒量取该组织9倍重量的生理盐水，去2/3倒入装有组织块的烧研钵中，眼科小剪剪碎后，研磨15分钟后将粗匀浆倒入到小烧杯内，用剩余1/3的生理盐水冲洗研钵，用超声粉碎仪（强度25%）冰浴中连续粉碎3分钟，然后反复冻融3次，使细胞内容物完全游离于液相中。将组织匀浆在离心机中3500r/min离心15分钟，取上清液进行测定。
2.3 皮肤组织匀浆中生化指标的测定
2.3.1 皮肤组织匀浆中SOD活力、（HYP）含量、MDA含量的测定
参照南京建成生物工程公司SOD、HYP和MDA试剂盒说明书方法测定，单位分别为U.mL-1、g.mL-1 和 nmol.mL-1。
2.3.2统计学方法
spss13.0统计软件分析数据，正态性检验，采用方差分析计算资料以X±s表示，以P﹤0.05,P﹤0.01表示有统计学意义。
3结果
裸鼠皮肤组织中生化指标的测定结果表1。
表 1裸鼠皮肤组织中生化指标的测定结果
（ n=10X±s ）
从表1中SOD数据显示，正常组和模型组相比，模型组裸鼠皮肤组织中SOD活力明显降低，具有显著性差异（P﹤0.01），提示皮肤自由基防护功能下降，对照组和实验组与正常组相比无显著性差异（P﹥0.01）；HYP检测数据显示，模型组比正常组裸鼠皮肤组织中的羟脯氨酸含量显著减少（P﹤0.05），而对照组和实验组与模型组相比，裸鼠皮肤组织中羟脯氨酸含量显著增加（P﹤0.01）；MDA检测数据显示，模型组与正常组比较有极显著性差异（P﹤0.01）、对照组、实验组与正常组比较无显著性差异(P﹥0.05)，说明皮肤脂质过氧化产物堆积增加。
4讨论
随着年龄增长，皮肤衰老是人体老化的外在表现，体内抗氧化酶类逐渐减少，皮肤防护功能减退或发生障碍，自由基累积性增加，造成皮肤内各种大分子损伤，导致皮肤的衰老和病变。HYP是真皮内含量丰富而且比较稳定的氨基酸，是胶原蛋白特有的氨基酸之一，其含量可以间接反映出真皮内胶原蛋白量的变化，而胶原含量的变化可以提示皮肤的衰老程度。故可作为判定皮肤衰老程度的一个特殊而敏感的指标 ；SOD是一种生物活性蛋白质,在抗衰老防御物质中,可阻断各种色斑、粉刺、皱纹的发生与发展，是最有效的抗氧化剂和自由基清除剂；MDA是脂质过氧，其含量可以间接反映自由基的产生情况和机体组织细胞的过氧化程度。紫外线照射会造成小鼠皮肤组织SOD活性显著下降，HYP含量下降及MDA含量增加，可以造成裸鼠皮肤光老化。
结果显示：D-半乳糖注射和光照联用所致的裸鼠皮肤亚急性衰老与光老化模型建造可靠，实验组与对照组涂抹供试品后能提高裸鼠皮肤组织中SOD活性和HYP含量，并能降低MDA含量。本实验提示：抗皱美白精华素有延缓皮肤衰老化作用，分析其作用机制主要是通过提高SOD活性和羟脯氨酸的含量，减少自由基代谢产物的堆积等方面的而发挥协同作用。
参考文献：
[1] 朱文元，陈力.皱纹产生的影响因素及发生机制[J].美容皮肤医学新进展，2009：33-34
[2] 王红丽，吴铁，吴志华等.小鼠亚急性皮肤衰老模型的建立[J].中国药学杂志，2003，38（10）：763-765.
[3] 石丽君，吴铁，吴志华. D-半乳糖诱导大鼠皮肤衰老的形态学和生化指标观察[J].中华皮肤科杂志，2005，38（3）：165-167.
[4]于向荣，王小丽.悦容丹康皮肤光老化的机理研究[J].宜春学院学报，2008，30（2）：12-13
[5] 徐叔云，卞如濂，陈修，药理学实验方法[M].第二版，北京：人民卫生出版社：1485-1486
[6] 周文丽，周婷婷，张建鹏等. 贻贝多糖对老龄SDT大鼠抗衰老作用[J].第二军医大学学报，2009，30（7）：386-389