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摘要[目的] 用大肠杆菌表达出CIAV的衣壳蛋白（VP1）作为免疫抗原，以建立鸡传染性贫血病毒（CIAV）的血清学诊断方法。[方法] 根据已发表的CIAV的衣壳蛋白（VP1）序列，结合Protean软件预测出抗原富集区域，设计并合成1对引物，利用PCR扩增该区域基因，将扩增成功的VP1基因片段经T4连接酶连接至PGEX6P1表达载体。连接成功的重组质粒转化不同的大肠杆菌表达菌株，通过IPTG诱导进行原核表达，筛选出表达量最高的菌株及最佳诱导时间和IPTG诱导浓度。以感染CIAV的鸡阳性血清为一抗，对重组蛋白GSTVP1进行Westernblot分析。[结果] 成功获得了重组质粒PGEXVP1，诱导表达后经SDSPAGE和Westernblot分析，分子量约71 kD的融合蛋白GSTVP1在大肠杆菌Rosseta中以包涵体形式大量表达，并能与鸡传染性贫血病毒阳性血清发生反应。[结论] 该研究可为抗CIAV单克隆抗体的制备及血清学诊断方法的建立等研究奠定基础。
关键词鸡传染性贫血病毒；VP1蛋白；原核表达
中图分类号S858.31文献标识码
A文章编号0517-6611（2015）28-118-04
Prokaryotic Expression and Identification of Capsid Protein of Chicken Infectious Anemia Virus
YU Shupei1，2， XIA Wenlong1，2， HU CHeng1，2， CHENG Darong1，2* et al （1.College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225009；2.Jiangsu Coinnovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Yangzhou， Jiangsu 225009）
Abstract [Objective] The research aimed to use capsid protein （VP1） of chicken infectious anemia virus （CIAV） expressed by Escherichia coli as immunizing antigen and establish the serological diagnosis method of CIAV. [Method] According to the published VP1 sequence of CIAV， the antigenenriched regions were predicted by using Protean software. A pair of primers were designed and synthesized for the amplification of targeted VP1 genes by PCR. The amplified fragment of VP1 genes was connected to PGEX6P1 expression vector by T4 DNA ligase. The recombinant plasmid after correct connection was used to transform different strains of Escherichia coli for prokaryotic expression by IPTG inducement. The strain with the highest expression amount was screened out， and the best inducement time and the best inducement concentration of IPTG were confirmed. The positive serum o chicken infected with CIAV was used as primary antibody to conduct Westernblotting on recombinant protein GSTVP1. [Result] The recombinant plasmid PGEXVP1 was successfully obtained and verified by SDSPAGE and Western blot. The fusion protein GSTVP1 with the molecular weight of about 71 kD was abundantly expressed in Rosseta of E. coli in the form of inclusion body. And the recombinant protein could react with positive serum of chicken infectious anemia virus. [Conclusion]The research could lay the foundation for preparing antiCIAV monoclonal antibody and establishing the serological diagnosis method of CIAV.
Key words Chicken infectious anemia virus； VP1 protein； Prokaryotic expression 鸡贫血病毒（Chicken infectious anemia virus，CIAV）是鸡传染性贫血病（Chicken infectious anemia，CIA）的病原，该病毒能够造成鸡的造血器官和淋巴组织受损，出现再生障碍性贫血、全身淋巴组织萎缩和免疫抑制，是鸡的主要免疫抑制性疾病病原之一。1979年由日本学者Yuasa等[1]首次报道该病毒，我国于1992年由崔现兰[2]等首次分离到，在印度、韩国等国家也陆续发现该病[3]。由于该病毒宿主范围窄，只感染鸡和火鸡[4]，并且对成年鸡一般不引起明显的临床症状，因此并未引起广大养殖户和临床兽医的重视。但是，CIAV感染雏鸡后往往引发严重的免疫抑制，导致各种继发性感染和生产能力下降，因此有必要建立特异性的分子生物学检测方法，在鸡群早期进行CIAV的监测。
CIAV基因组为单股环状DNA，全长2.3 kb左右，共含有3个开放读码框，分别编码 VP1、VP2和 VP3蛋白。VP1蛋白是CIAV 的衣壳蛋白，在刺激机体产生抗体方面起着重要作用，是主要的免疫原蛋白[5]；VP2 作为辅助蛋白，能帮助 VP1 形成正确的构象。Koch等[6]研究发现VP1只有与VP2共同表达时，才可以刺激机体产生中和抗体，二者相互协调才能诱导机体产生免疫保护作用，VP3蛋白主要作用是诱导细胞凋亡。其中，VP1蛋白是刺激机体产生抗体的主要靶位点，因此选择制备VP1的重组蛋白来作为免疫抗原。VP1蛋白由449个氨基酸构成，大小约为51.6 kD，因为分子量不大。国外学者Pallister[7]将完整的VP1以谷胱甘肽转移酶（GST）融合蛋白的形式在大肠杆菌进行了表达，然而经SDSPAGE电泳分析表达量极低，无法满足高低度抗体的制备。因此，笔者利用Protean软件对VP1全长进行分析，选择抗原表位较为丰富的区域进行表达。
笔者以实验室分离到的CIAV基因组为模板，经PCR扩增出VP1基因中抗原表位较集中的片段，长度为1 164 kb，克隆至pMD18T载体并测序正确后，酶切回收小片段并经T4连接酶连至PGEX6P1表达载体中，连接成功的PGEXVP1质粒转化不同的大肠杆菌表达菌株，利用IPTG诱导进行原核表达，筛选出表达量最高的菌株以及最佳诱导时间和IPTG诱导浓度。最后，以感染CIAV的鸡阳性血清为一抗，对重组蛋白GSTVP1进行Westernblot分析，以期为CIAV单克隆抗体的制备以及血清学诊断方法的建立提供候选抗原。
1材料与方法
1.1试验材料
CIAV毒株由扬州大学兽医学院实验室分离保存；表达载体PGEX6P1、感受态细胞DH5α、大肠杆菌BL21、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS和BL21（DE3）Rosseta菌株由扬州大学兽医学院实验室保存；Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL2000、DL5000，购自宝生物工程（大连）有限公司；EcoRI、SalI限制性内切酶、T4 DNA Ligase均为Thermo公司产品；预染蛋白Marker购自上海生工生物工程有限公司；HRP标记的兔抗鸡IgG购自Sigma公司。其他均为国产分析纯试剂。
1.2试验方法
1.2.1引物的设计合成与VP1片段的扩增。
根据GenBank中发表的CIAV标准毒株Cux1序列，针对VP1基因的抗原富集区域设计扩增引物，引物序列见表1，并在上下游引物的5’端分别引入EcoRI和SalI酶切位点（下划线部分）。引物交由上海生工生物工程有限公司合成。
按照常规方法提取CIAV的基因组DNA作为模板，进行PCR反应，PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保温。PCR产物用0.1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2克隆载体pMDVP1的构建和鉴定。
扩增后的VP1基因片段切胶回收后，与pMD18T载体连接，连接产物转化DH5α感受态细胞。然后，挑取单菌落摇菌提质粒，使用EcoRI、SalI双酶切鉴定，同时将阳性克隆送至上海生工生物工程有限公司进行测序。
1.2.3重组质粒PGEXVP1的构建及酶切鉴定。
重组质粒pMD18VP1用EcoRI和SalI双酶切后回收小片段，表达载体PGEX6P1经相同酶双酶切后回收，在T4 DNA连接酶的作用下过夜连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取阳性重组菌落命名为PGEXVP1，并利用EcoRI和SalI对重组质粒进行双酶切鉴定。
1.2.4重组蛋白表达菌株的筛选。
将PGEXVP1质粒分别转化BL21、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS和BL21（DE3）Rosseta菌株中，挑取单菌落后接种于5 ml含氨苄抗生素的LB培养液中，37 ℃振荡培养至对数期生长（OD600=0.7），加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，37 ℃诱导培养6 h，将菌液离心收集后用PBS缓冲液重悬，超声波裂解菌体，进行SDSPAGE电泳分析。
1.2.5重组蛋白GSTVP1表达条件的优化及可溶性检测。
筛选出最合适的表达菌株后，将诱导表达的蛋白进行超声波裂解，收集裂解上清和沉淀，观察目的蛋白是可溶性表达还是以包涵体形式表达；随后取OD值为0.7的重组菌在不同诱导时间、不同IPTG浓度下进行表达，摸索最佳表达条件。
1.2.6融合蛋白GSTVP1的Western blot分析。
将重组蛋白样品经SDSPAGE电泳后转移到硝酸纤维素膜（NC）上，在37 ℃条件下用5%（w/v）脱脂奶粉封闭1 h，然后转入经封闭液1∶1 000稀释的鸡抗CIAV的阳性血清中，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤后再转入经PBS缓冲液1∶5 000稀释的HRP标记的兔抗鸡IgG中，37 ℃孵育1 h，最后用 ECL法进行显色。 2结果与分析
2.1VP1基因片段的扩增
以制备的CIAV基因组为模板，进行PCR扩增，获得了预期大小（1 164 bp）的特异性目的条带（图1）。
2.5融合蛋白表达条件的优化
为了获得重组蛋白的最佳诱导条件，将诱导时间和诱导剂IPTG浓度设置了梯度进行最佳条件的摸索。经过SDSPAGE分析，当诱导时间过夜（图6）、IPTG浓度1.0 mmol/L（图7）时，即可得到最佳表达量。
3讨论
鸡传染性贫血在国内发生较晚，CIAV由崔现兰等[2]于1992年首次分离到，并且由于临床病变不明显、致死率较低，并未引起养殖户及临床兽医的重视。然而，CIAV除了引发造血功能障碍，作为一种免疫抑制性病毒，同传染性法氏囊病毒（IBDV）、白血病病毒（ALV）等一样，能够造成免疫功能减弱，降低鸡群对多种传染病的抵抗力，引发较大的经济损失。因此，有必要建立分子生物学的检测方法，在鸡群早期进行CIAV的监测。CIAV是一种无囊膜病毒，其抗原特异性取决于颗粒表面的衣克蛋白，衣壳蛋白（VP1蛋白）作为CIAV的主要结构蛋白，在刺激机体产生免疫反应以及CIAV的抗原、抗体检测方面有着重要作用[8]，因此可以利用该蛋白作为抗原来免疫小鼠获得针对CIAV的特异性的抗体，以此抗体为基础来建立ELISA试剂盒、胶体金试纸条等分子生物学检测工具。
作为目前较为成熟的表达系统，大肠杆菌的原核表达具有制备工艺方便、产量高、经济成本低等优点，但是VP1蛋白的N端氨基酸中富含精氨酸及其他大肠杆菌的稀有密码子，并且有多个两两相连靠在一起的精氨酸序列，这为该蛋白在大肠杆菌中的表达造成了一定困难。针对此情况，许多学者删除了N端的氨基酸[9]、对VP1进行了截短表达。国外有学者通过密码子优化重新设计了VP1蛋白的基因，以提高蛋白表达量[10]。此外，国内也有人使用毕赤酵母完成了真核表达[11]，这些手段相对而言较为繁琐，并且根据这些文献描述，将VP1基因截短表达后，单独的N端或C端蛋白经Westernblot检验不能与CIAV阳性鸡血清发生反应，可能对其生物活性造成了影响。笔者表达了VP1的第1～388位氨基酸多肽，最大限度地保留了VP1蛋白的全长，同时为了去除N端稀有密码子的影响，采用大肠杆菌Rosetta作为表达菌，该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充了稀有密码子的tRNAs，可以增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。SDSPAGE结果亦证实GSTVP1融合蛋白在Rosetta菌株中的
表达量比在BL21、BL21（DE3）、DE3pLysS等菌株中高。
该试验所表达的GSTVP1融合蛋白以包涵体的形式存在，这可能是由于融合蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏适当的加工与修饰，翻译完成后不能完全折叠成天然构象分泌出细胞外，但是经过Westernblot检测可以与临床上采集的CIAV病例的血清反应，因此可以作为检测抗原进行CIAV的血清学诊断。GSTVP1蛋白在大肠杆菌中的成功表达为CIAV的单克隆抗体的制备、基于VP1重组抗原的CIAV间接ELISA诊断方法等分子生物学研究提供了基础材料，为今后CIAV的诊断、监测及疫苗的研制奠定了基础。
参考文献
[1]
YUASA N，TANIGUCHI T，YOSHIDA I. Isolation and characteristics of an agent inducing anemia in chicks[J]. Avian Dis，1979，23：366-385.
[2] CUI X L，XIN G X，WU D L，et al.Identification of chicken infectious anemia virus[J].Chin Anim Poult Infec Dis，1992，6：3-5.
[3] KIM H R，KWON Y K，BAE Y C，et al.Molecular characterization of chicken infectious anemia virus detected from breeder and broiler chickens in South Korea[J].Poult Sci，2010，89（11）：2426-2431.
[4] SOMMER F，CARDONA C.Anemia virus in broilers：Dynamics of the infection in two commercial broiler flocks[J].Avian Dis，2003 ，47（4）：1466-1473.
[5] KAFFASHI A，NOORMOHAMMADI A H，ALLOTT M L.Browning GF viral load in 1dayold and 6weekold chickens infected with chicken anaemia virus by the intraocular route[J].Avian Pathol，2006，35（6）：471-475.
[6] KOCH G，VAN ROOZELAR D J，VERSCHUEREN C A J，et al.Immunogenic and protective properties of chicken anaemia virus proteins expressed by baculovirus[J].Vaccine，1995，13：763-770.
[7] PALLISTER J，FAHEY K J，SHEPPARD M.Cloning and sequencing of the chicken anemia virus（CAV） ORF 3 gene ，and the development of an ELISA for the detection of serum antibody to CAV[J].Vet Microbiol，1994，39（1/2）：167-178.
[8] LIEN Y Y，HUANG C H，SUN F C，et al.Development and characterization of a potential diagnostic monoclonal antibody against capsid protein VP1 of the chicken anemia virus[J].Veterinary science，2012，13（1）：73-79.
[9] WANG Y，WANG X M，GAO H L，et al.Cloning and expression of the gene encoding chicken infectious anemia virus VP1 Cterminal in E.coli[J].Chin Prev Vet Med，2004，26：432-435.
[10] LEE M S，HSEU Y C，LAI G H，et al.High yield expression in a recombinant E.coli of a codon optimized chicken anemia virus capsid protein VP1 useful for vaccine development[J].Microbial cell factories，2011，10：56.
[11] 林欢，高宏雷，王笑梅，等.鸡贫血病毒VP1 和VP2基因在毕赤酵母中的表达及产物免疫学特性的初步研究[J].中国预防兽医学报，2008，30（7）：496-499.
关键词鸡传染性贫血病毒；VP1蛋白；原核表达
中图分类号S858.31文献标识码
A文章编号0517-6611（2015）28-118-04
Prokaryotic Expression and Identification of Capsid Protein of Chicken Infectious Anemia Virus
YU Shupei1，2， XIA Wenlong1，2， HU CHeng1，2， CHENG Darong1，2* et al （1.College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225009；2.Jiangsu Coinnovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Yangzhou， Jiangsu 225009）
Abstract [Objective] The research aimed to use capsid protein （VP1） of chicken infectious anemia virus （CIAV） expressed by Escherichia coli as immunizing antigen and establish the serological diagnosis method of CIAV. [Method] According to the published VP1 sequence of CIAV， the antigenenriched regions were predicted by using Protean software. A pair of primers were designed and synthesized for the amplification of targeted VP1 genes by PCR. The amplified fragment of VP1 genes was connected to PGEX6P1 expression vector by T4 DNA ligase. The recombinant plasmid after correct connection was used to transform different strains of Escherichia coli for prokaryotic expression by IPTG inducement. The strain with the highest expression amount was screened out， and the best inducement time and the best inducement concentration of IPTG were confirmed. The positive serum o chicken infected with CIAV was used as primary antibody to conduct Westernblotting on recombinant protein GSTVP1. [Result] The recombinant plasmid PGEXVP1 was successfully obtained and verified by SDSPAGE and Western blot. The fusion protein GSTVP1 with the molecular weight of about 71 kD was abundantly expressed in Rosseta of E. coli in the form of inclusion body. And the recombinant protein could react with positive serum of chicken infectious anemia virus. [Conclusion]The research could lay the foundation for preparing antiCIAV monoclonal antibody and establishing the serological diagnosis method of CIAV.
Key words Chicken infectious anemia virus； VP1 protein； Prokaryotic expression 鸡贫血病毒（Chicken infectious anemia virus，CIAV）是鸡传染性贫血病（Chicken infectious anemia，CIA）的病原，该病毒能够造成鸡的造血器官和淋巴组织受损，出现再生障碍性贫血、全身淋巴组织萎缩和免疫抑制，是鸡的主要免疫抑制性疾病病原之一。1979年由日本学者Yuasa等[1]首次报道该病毒，我国于1992年由崔现兰[2]等首次分离到，在印度、韩国等国家也陆续发现该病[3]。由于该病毒宿主范围窄，只感染鸡和火鸡[4]，并且对成年鸡一般不引起明显的临床症状，因此并未引起广大养殖户和临床兽医的重视。但是，CIAV感染雏鸡后往往引发严重的免疫抑制，导致各种继发性感染和生产能力下降，因此有必要建立特异性的分子生物学检测方法，在鸡群早期进行CIAV的监测。
CIAV基因组为单股环状DNA，全长2.3 kb左右，共含有3个开放读码框，分别编码 VP1、VP2和 VP3蛋白。VP1蛋白是CIAV 的衣壳蛋白，在刺激机体产生抗体方面起着重要作用，是主要的免疫原蛋白[5]；VP2 作为辅助蛋白，能帮助 VP1 形成正确的构象。Koch等[6]研究发现VP1只有与VP2共同表达时，才可以刺激机体产生中和抗体，二者相互协调才能诱导机体产生免疫保护作用，VP3蛋白主要作用是诱导细胞凋亡。其中，VP1蛋白是刺激机体产生抗体的主要靶位点，因此选择制备VP1的重组蛋白来作为免疫抗原。VP1蛋白由449个氨基酸构成，大小约为51.6 kD，因为分子量不大。国外学者Pallister[7]将完整的VP1以谷胱甘肽转移酶（GST）融合蛋白的形式在大肠杆菌进行了表达，然而经SDSPAGE电泳分析表达量极低，无法满足高低度抗体的制备。因此，笔者利用Protean软件对VP1全长进行分析，选择抗原表位较为丰富的区域进行表达。
笔者以实验室分离到的CIAV基因组为模板，经PCR扩增出VP1基因中抗原表位较集中的片段，长度为1 164 kb，克隆至pMD18T载体并测序正确后，酶切回收小片段并经T4连接酶连至PGEX6P1表达载体中，连接成功的PGEXVP1质粒转化不同的大肠杆菌表达菌株，利用IPTG诱导进行原核表达，筛选出表达量最高的菌株以及最佳诱导时间和IPTG诱导浓度。最后，以感染CIAV的鸡阳性血清为一抗，对重组蛋白GSTVP1进行Westernblot分析，以期为CIAV单克隆抗体的制备以及血清学诊断方法的建立提供候选抗原。
1材料与方法
1.1试验材料
CIAV毒株由扬州大学兽医学院实验室分离保存；表达载体PGEX6P1、感受态细胞DH5α、大肠杆菌BL21、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS和BL21（DE3）Rosseta菌株由扬州大学兽医学院实验室保存；Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL2000、DL5000，购自宝生物工程（大连）有限公司；EcoRI、SalI限制性内切酶、T4 DNA Ligase均为Thermo公司产品；预染蛋白Marker购自上海生工生物工程有限公司；HRP标记的兔抗鸡IgG购自Sigma公司。其他均为国产分析纯试剂。
1.2试验方法
1.2.1引物的设计合成与VP1片段的扩增。
根据GenBank中发表的CIAV标准毒株Cux1序列，针对VP1基因的抗原富集区域设计扩增引物，引物序列见表1，并在上下游引物的5’端分别引入EcoRI和SalI酶切位点（下划线部分）。引物交由上海生工生物工程有限公司合成。
按照常规方法提取CIAV的基因组DNA作为模板，进行PCR反应，PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保温。PCR产物用0.1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2克隆载体pMDVP1的构建和鉴定。
扩增后的VP1基因片段切胶回收后，与pMD18T载体连接，连接产物转化DH5α感受态细胞。然后，挑取单菌落摇菌提质粒，使用EcoRI、SalI双酶切鉴定，同时将阳性克隆送至上海生工生物工程有限公司进行测序。
1.2.3重组质粒PGEXVP1的构建及酶切鉴定。
重组质粒pMD18VP1用EcoRI和SalI双酶切后回收小片段，表达载体PGEX6P1经相同酶双酶切后回收，在T4 DNA连接酶的作用下过夜连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取阳性重组菌落命名为PGEXVP1，并利用EcoRI和SalI对重组质粒进行双酶切鉴定。
1.2.4重组蛋白表达菌株的筛选。
将PGEXVP1质粒分别转化BL21、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS和BL21（DE3）Rosseta菌株中，挑取单菌落后接种于5 ml含氨苄抗生素的LB培养液中，37 ℃振荡培养至对数期生长（OD600=0.7），加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，37 ℃诱导培养6 h，将菌液离心收集后用PBS缓冲液重悬，超声波裂解菌体，进行SDSPAGE电泳分析。
1.2.5重组蛋白GSTVP1表达条件的优化及可溶性检测。
筛选出最合适的表达菌株后，将诱导表达的蛋白进行超声波裂解，收集裂解上清和沉淀，观察目的蛋白是可溶性表达还是以包涵体形式表达；随后取OD值为0.7的重组菌在不同诱导时间、不同IPTG浓度下进行表达，摸索最佳表达条件。
1.2.6融合蛋白GSTVP1的Western blot分析。
将重组蛋白样品经SDSPAGE电泳后转移到硝酸纤维素膜（NC）上，在37 ℃条件下用5%（w/v）脱脂奶粉封闭1 h，然后转入经封闭液1∶1 000稀释的鸡抗CIAV的阳性血清中，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤后再转入经PBS缓冲液1∶5 000稀释的HRP标记的兔抗鸡IgG中，37 ℃孵育1 h，最后用 ECL法进行显色。 2结果与分析
2.1VP1基因片段的扩增
以制备的CIAV基因组为模板，进行PCR扩增，获得了预期大小（1 164 bp）的特异性目的条带（图1）。
2.5融合蛋白表达条件的优化
为了获得重组蛋白的最佳诱导条件，将诱导时间和诱导剂IPTG浓度设置了梯度进行最佳条件的摸索。经过SDSPAGE分析，当诱导时间过夜（图6）、IPTG浓度1.0 mmol/L（图7）时，即可得到最佳表达量。
3讨论
鸡传染性贫血在国内发生较晚，CIAV由崔现兰等[2]于1992年首次分离到，并且由于临床病变不明显、致死率较低，并未引起养殖户及临床兽医的重视。然而，CIAV除了引发造血功能障碍，作为一种免疫抑制性病毒，同传染性法氏囊病毒（IBDV）、白血病病毒（ALV）等一样，能够造成免疫功能减弱，降低鸡群对多种传染病的抵抗力，引发较大的经济损失。因此，有必要建立分子生物学的检测方法，在鸡群早期进行CIAV的监测。CIAV是一种无囊膜病毒，其抗原特异性取决于颗粒表面的衣克蛋白，衣壳蛋白（VP1蛋白）作为CIAV的主要结构蛋白，在刺激机体产生免疫反应以及CIAV的抗原、抗体检测方面有着重要作用[8]，因此可以利用该蛋白作为抗原来免疫小鼠获得针对CIAV的特异性的抗体，以此抗体为基础来建立ELISA试剂盒、胶体金试纸条等分子生物学检测工具。
作为目前较为成熟的表达系统，大肠杆菌的原核表达具有制备工艺方便、产量高、经济成本低等优点，但是VP1蛋白的N端氨基酸中富含精氨酸及其他大肠杆菌的稀有密码子，并且有多个两两相连靠在一起的精氨酸序列，这为该蛋白在大肠杆菌中的表达造成了一定困难。针对此情况，许多学者删除了N端的氨基酸[9]、对VP1进行了截短表达。国外有学者通过密码子优化重新设计了VP1蛋白的基因，以提高蛋白表达量[10]。此外，国内也有人使用毕赤酵母完成了真核表达[11]，这些手段相对而言较为繁琐，并且根据这些文献描述，将VP1基因截短表达后，单独的N端或C端蛋白经Westernblot检验不能与CIAV阳性鸡血清发生反应，可能对其生物活性造成了影响。笔者表达了VP1的第1～388位氨基酸多肽，最大限度地保留了VP1蛋白的全长，同时为了去除N端稀有密码子的影响，采用大肠杆菌Rosetta作为表达菌，该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充了稀有密码子的tRNAs，可以增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。SDSPAGE结果亦证实GSTVP1融合蛋白在Rosetta菌株中的
表达量比在BL21、BL21（DE3）、DE3pLysS等菌株中高。
该试验所表达的GSTVP1融合蛋白以包涵体的形式存在，这可能是由于融合蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏适当的加工与修饰，翻译完成后不能完全折叠成天然构象分泌出细胞外，但是经过Westernblot检测可以与临床上采集的CIAV病例的血清反应，因此可以作为检测抗原进行CIAV的血清学诊断。GSTVP1蛋白在大肠杆菌中的成功表达为CIAV的单克隆抗体的制备、基于VP1重组抗原的CIAV间接ELISA诊断方法等分子生物学研究提供了基础材料，为今后CIAV的诊断、监测及疫苗的研制奠定了基础。
参考文献
[1]
YUASA N，TANIGUCHI T，YOSHIDA I. Isolation and characteristics of an agent inducing anemia in chicks[J]. Avian Dis，1979，23：366-385.
[2] CUI X L，XIN G X，WU D L，et al.Identification of chicken infectious anemia virus[J].Chin Anim Poult Infec Dis，1992，6：3-5.
[3] KIM H R，KWON Y K，BAE Y C，et al.Molecular characterization of chicken infectious anemia virus detected from breeder and broiler chickens in South Korea[J].Poult Sci，2010，89（11）：2426-2431.
[4] SOMMER F，CARDONA C.Anemia virus in broilers：Dynamics of the infection in two commercial broiler flocks[J].Avian Dis，2003 ，47（4）：1466-1473.
[5] KAFFASHI A，NOORMOHAMMADI A H，ALLOTT M L.Browning GF viral load in 1dayold and 6weekold chickens infected with chicken anaemia virus by the intraocular route[J].Avian Pathol，2006，35（6）：471-475.
[6] KOCH G，VAN ROOZELAR D J，VERSCHUEREN C A J，et al.Immunogenic and protective properties of chicken anaemia virus proteins expressed by baculovirus[J].Vaccine，1995，13：763-770.
[7] PALLISTER J，FAHEY K J，SHEPPARD M.Cloning and sequencing of the chicken anemia virus（CAV） ORF 3 gene ，and the development of an ELISA for the detection of serum antibody to CAV[J].Vet Microbiol，1994，39（1/2）：167-178.
[8] LIEN Y Y，HUANG C H，SUN F C，et al.Development and characterization of a potential diagnostic monoclonal antibody against capsid protein VP1 of the chicken anemia virus[J].Veterinary science，2012，13（1）：73-79.
[9] WANG Y，WANG X M，GAO H L，et al.Cloning and expression of the gene encoding chicken infectious anemia virus VP1 Cterminal in E.coli[J].Chin Prev Vet Med，2004，26：432-435.
[10] LEE M S，HSEU Y C，LAI G H，et al.High yield expression in a recombinant E.coli of a codon optimized chicken anemia virus capsid protein VP1 useful for vaccine development[J].Microbial cell factories，2011，10：56.
[11] 林欢，高宏雷，王笑梅，等.鸡贫血病毒VP1 和VP2基因在毕赤酵母中的表达及产物免疫学特性的初步研究[J].中国预防兽医学报，2008，30（7）：496-499.