【摘 要】
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目的构建人凝血因子Ⅸ小基因(Mini-hF9)及无义突变体,检测其mRNA表达水平,分析microRNA125对无义突变的F9基因表达调控的分子机制。方法利用PCR定点突变技术构建若干无义突变的人Mini-hF9并转染哺乳动物细胞HEK293T等,同时转染miR-125模拟物,通过实时荧光定量PCR (q-PCR)检测Mini-hF9基因mRNA表达水平。结果成功构建了Mini-hF9并在细胞中正
【机 构】
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030001 太原,山西医科大学第二临床医学院、山西医科大学第二医院血液科,030001 太原,山西医科大学第二临床医学院、山西医科大学第二医院血液科,山西大学生物技术研究所、化学生物学与分子工程教育
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目的构建人凝血因子Ⅸ小基因(Mini-hF9)及无义突变体,检测其mRNA表达水平,分析microRNA125对无义突变的F9基因表达调控的分子机制。
方法利用PCR定点突变技术构建若干无义突变的人Mini-hF9并转染哺乳动物细胞HEK293T等,同时转染miR-125模拟物,通过实时荧光定量PCR (q-PCR)检测Mini-hF9基因mRNA表达水平。
结果成功构建了Mini-hF9并在细胞中正确剪接。成功构建了无义突变体M1 (nt 34 G>T in Exon 7)、M2 (nt 52 G>T in Exon 7)和M3 (nt 85 G>T in Exon 7)。M1和M2突变体中Mini-hF9基因mRNA表达水平分别为野生型的14.1%(t=15.464,P=0.004)和22.4%(t=15.755 ,P=0.004),通过放线菌酮处理实验证实这是由于无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)所致。分别转染miR-125a模拟物和miR-125b模拟物后,M1突变体中Mini-hF9基因mRNA水平分别升高到1.70倍(t=-4.883 ,P=0.039)和2.40倍(t=-17.537,P= 0.003),M2突变体Mini-hF9mRNA水平分别升高到2.02倍(t=-19.264,P=0.003)和2.07倍(t=-9.158,P=0.012 )。
结论无义突变发生的位置是触发NMD途径的一个关键因素;microRNA125能够通过抑制NMD途径提高无义突变的凝血因子Ⅸ的mRNA水平。
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