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[摘要] 目的 分析比较酶联免疫法（ELISA）和间接血凝法（IHA）在本实验室检测实验用家兔弓形虫特异性抗体的可行性。 方法 应用ELISA和IHA两种方法平行检测实验感染弓形虫的12只家兔阳性血清和未感染过弓形虫的30只正常家兔阴性血清中的弓形虫特异性抗体。比较两种方法敏感性、特异性、检测效率及Youden指数并运用kappa值进行一致性的评价。 结果 IHA法的敏感性41.67%，特异性93.33%，ELISA法的敏感性100%，特异性100%。ELISA方法的敏感性、特异性、检测效率及Youden指数都在IHA方法之上。两种方法的总符合率是78.57%。kappa值=0.3998。 结论 ELISA法与IHA法在本次平行检测中的一致性较差。ELISA方法敏感性、特异性明显优于IHA方法，更适用于实验动物家兔的弓形虫特异性抗体的检测。
[关键词] 弓形虫，抗体；酶联免疫试验；间接血凝试验
[中图分类号] R446.6 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）17-113-05
[Abstract] Objective To analyze and compare the feasibility of using ELISA and IHA in our laboratory for testing specific TOX-Ab in laboratory rabbit. Methods Used ELISA and IHA methods for a parallelized testing of the specific TOX-Ab contained in both the positive serum of 12 rabbits infected with toxoplasma gondii and negative serum of 30 uninfected rabbits， thus to compare the sensibility， specificity， testing efficiency and Youden index between the two methods before applying Kappa values for a consistency evaluation. Results The sensibility and specificity of IHA was 41.67% and 93.33% respectively， while that for ELISA are both 100%. The sensibility， specificity， testing efficiency and Youden index for ELISA are higher than that of IHA. The total consistency rate for such two methods was 78.57% with Kappa value equals to 0.3998. Conclusion The consistency between the use of ELISA and IHA for this parallelized testing is relatively poor， and ELISA is notably better than IHA in terms of sensitivity and specificity， therefore it is more suitable to be applied in the testing of the specific TOX-Ab in laboratory animal-rabbit.
[Key words] Toxoplasma gondii； Antibody； ELISA； IHA
刚地弓形虫简称弓形虫是寄生于猫科动物的肠道寄生虫，寄生于人体脑、眼、肺、心脏、淋巴结等组织引起寄生虫病。该虫是一种重要的机会致病原虫，尤其在宿主免疫功能低下时，可导致严重的后果。弓形虫呈世界性分布，西方发达国家和地区感染率较高，在美国所有肉食品中猪肉被认为是人类弓形虫病的最大肉食性来源。据国外报道，人群的平均感染率是25%～50%，有人推算全世界约有至少5亿人感染弓形虫[1-2]。自从1957年我国于恩庶第一个成功地从猫和兔子体内分离到弓形虫病原体开始，逐步发现我国人群感染弓形虫病原体较为广泛。人和许多动物都能感染，引起人畜共患的弓形虫病[3]。弓形虫检测方法有很多，比较常用的有病原学检查方法如动物接种法，直接染色镜检法。分子生物学诊断方法如PCR技术、核酸分子杂交技术（主要是DNA探针技术）、单克隆抗体技术以及基因芯片技术应用于检测弓形虫感染，基因芯片技术更具有灵敏、特异、早期诊断的意义，但由于基因诊断技术的高度的敏感性，操作不当，容易产生假阳性。
迄今最常用的是检测弓形虫抗体的血清学方法。1994年的实验动物寄生虫检测国标上规定间接血凝方法（IHA）是检测实验动物弓形虫抗体的两种主要的方法之一（另一种方法是IFA方法），但该方法操作耗时，结果判断容易受主观因素影响。酶联免疫法（ELISA）是很多学者公认的检测弓形虫抗体的一种可重复的方法，具有灵敏度高、特异性强、结果判断客观等优点，已被广泛应用人弓形虫病的免疫学诊断[4]。并且2008年重新修订的国标上已新增ELISA方法为实验动物弓形虫抗体的检测方法。研究表明[5]，对ELISA和其他一些血清学方法诊断弓形虫病进行评价，认为该法是检测弓形虫抗体的一种可重复的方法，易自动化和标准化。目前，临床上多采用同时检测IgM、IgG的方法来诊断现症感染。近几年主张采用两种或多种方法结合提高诊断的准确率，可以将IHA与ELISA或IFA同用，以提高的检出率和准确度[6]。新的弓形虫病的诊断方法主要在于提高敏感性和特异性，以及使操作更为简便快捷。本研究运用ELISA和IHA方法对同一批家兔血清进行检测，并对这两种定性实验检测方法的结果作比较分析。 1 材料与方法
1.1 阳性血清
由上海市疾控中心提供12只实验感染弓形虫速殖子的家兔血清并用染色方法（DT）检测确诊的阳性标本。
1.2 阴性血清
本实验室提供已用染色方法（DT）检测确诊阴性的健康家兔血清标本。
1.3 试剂
动物用弓形虫抗体检测试剂盒（酶联免疫法）从珠海经济特区海泰生物制药有限公司购得。其中主要成分及批号为：（1）酶标记物，20131106；（2）浓缩洗涤液，770131114；（3）显色液A，720130916；（4）显色液B，730131105；（5）样品稀释液，720130916；760130905；（6）终止液，740131104；（7）阳性对照，20131106；阴性对照，20131106，临界对照，20131106。弓形虫抗体间接血凝试验试剂盒，购于中国农业科学院兰州兽医研究所，批号：20131205。
1.4 仪器设备
SPECTRAmax340pc酶标仪，Thermo（815）恒温培养箱，各种刻度的微量移液器，96（12×8）孔1100 V形有机玻璃板，微型震荡器等。
1.5 检测方法
1.5.1 IHA试验操作步骤 （1）配制诊断液：弓形虫IHA诊断试剂按瓶上标示毫升数加灭菌蒸馏水稀释摇匀，2000r/min离心10min弃上清液，加等量的稀释液摇匀，置4℃下静置24h后使用。（2）加稀释液：用微量移液器在96孔有机玻璃反应板的每孔加75μL，每个样品需加稀释液3孔，均应设阳性血清、阴性血清、空白对照。阴、阳性对照加8孔（其中第8孔为稀释液对照）。（3）加待测血清、阳性对照血清、阴性对照血清：第1孔加相应血清25μL。（4）稀释：定性检测稀释到第3孔，对照血清稀释到第7孔，定性检测的第4孔、对照血清的第8孔为稀释液对照。（5）加诊断液：将诊断液摇匀，每孔加25μL诊断液，加完后将反应板置微量振荡器上振荡1～2min，取下反应板，盖上一块与反应板大小相近的玻璃置37℃作用2～3h后观察结果。（6）结果判定方法：在阳性对照血清效价不低于1∶1024，阴性对照血清除第1孔允许有前滞现象“+”外，其余各孔均为“-”稀释液对照为“-”的前提下，待检血清效价达到或超过1∶64为阳性。“++”为阳性终点。
1.5.2 ELISA试验操作步骤 （1）洗涤液配制：试剂盒放置室温平衡20～30min。浓缩洗涤液用去离子水10倍稀释。（2）样品稀释：样品1∶100稀释：将样品稀释液1mL加入一洁净小管内，加10μL待检样品，充分混匀。（3）加样反应：加板条固定于板架上，剩余的板条用不干胶密封并放入密封袋中保存。每孔加入稀释后样品100μL。临界对照加3孔，阴、阳性对照各加1孔，100μL/孔。另留一孔不加任何液体为空白对照。置37℃30min。（4）加酶反应：甩净孔中液体，洗板3次，每次停留1min后甩净拍干，除空白对照外每孔加酶标记物1滴，置37℃30min。（5）显色反应：甩净孔中液体，同上洗板3次，拍干后各孔滴加显色液A、B各1滴，置37℃避光10min。（6）终止反应：每孔立即加入终止液1滴，混匀后用酶标仪450nm读数判定结果。（7）结果判定：以空白孔调零，450nm波长测定OD值。阴性对照值≤0.20，临界对照OD值0.20～0.60，阳性对照值>0.60，证明实验成立。按以下方法判断：阳性：样品OD值>临界对照OD值平均值×1.1；可疑：临界对照OD值平均值×0.9≤样品OD值≤临界对照OD值平均值×1.1；阴性：样品OD值<临界对照OD值平均值×0.9。
1.6 统计学处理
检测数据用SPSS16.0进行一致性检验。
2 结果
2.1 IHA检测结果
应用IHA方法检测已知兔阳性血清1～12号样本中，3#、5#、8#、9#、11#5个样本红细胞部分呈膜状沉着，周围有凝集团点，中央沉点大。血清效价≥1∶64判定为“++”，其余7个样本红细胞沉集于中心，周围无沉着物，分界清楚。血清效价<1∶64均呈阴性反应。
应用IHA方法检测已知兔阴性血清1～30号样本中，除了16#、22# 2个样本血清效价≥1∶64判定为“++”，其余28个样本均呈阴性反应。
根据以上检测结果得出IHA方法检测已知兔阳性血清的敏感性是41.67%，检测已知兔阴性血清特异性是93.33%。见表1。
3 讨论
自从上个世纪60年代于恩庶等在国内首先建立DT染色试验用于检测弓形虫感染以来，现有的弓形虫感染的血清学诊断技术不下10余种。虽然DT试验特异强，敏感性高已被公认，但是DT染色试验需要弓形虫活的虫体，在实际应用中不易开展。因此现在国内已不再有人用此方法来检验弓形虫感染。目前主要用抗体检测法，如补体结合试验（CT），间接血凝试验（IHA），乳胶凝集试验（LAT），碳粒凝集试验（CAT），间接免疫荧光试验（IFA），酶联免疫吸附试验（ELISA）等。应用较多的是IHA、ELISA和IFA。IHA有商品抗原供应，操作方法简便，所以应用较广。ELISA敏感性特异性优于IHA。间接血凝试验（IHA）其原理是抗原包被于红细胞表面成为载体再与相应的抗体结合，从而使红细胞聚集在一起，出现肉眼可见的凝集反应。但容易发生非特异性凝集现象。Jacob和Lunde1957年首次将间接血凝实验用于检测弓形虫病[8]。酶联免疫吸附试验（ELISA）是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体。将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，与受检血清中特异性的抗体结合，形成固相抗原抗体复合物，再与酶标抗抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶，催化底物3，3’—5，5’—四甲基联苯胺显色，3，3’—5，5’—四甲基联苯胺显色，用酶标仪在450nm波长下读取OD值，判定有无弓形虫特异性抗体，结果较为客观。而IHA方法仅依靠肉眼识别凝集颗粒的有无以及大小，主观因素的影响不可忽视。此外，实验室之间，不同批号制备的致敏红细胞的质量大相径庭，重复性较差，这些缺点客观上不利于IHA方法的广泛使用。然而，IHA方法简便快速，所用器材简单，便于大批量样品基层单位使用。ELISA方法的操作简便快捷，但对操作和时间的要求比较严格。另外，ELISA是诊断弓形虫感染应用最广的技术之一，ELISA试剂盒的最明显的优点是设计的亲和力[9]。 当前ELISA方法在检测弓形虫病原诊断方面具有广阔的应用前景。国外不少实验室也有用重组抗原诊断弓形虫病。如Lecordier等用重组的致密颗粒抗原（Dense granule antigen，GRA）GRA1和GRA6作为诊断用抗原取得良好的结果[10]。国内贾雪梅等也建立了GRA1基因体外扩增方法，进一步研究发现GRA1与GRA6-Nt联合应用可使敏感性达到98%。GST-GRA6-Nt与GAR1联合采用ELISA法可于弓形虫病的血清学诊断[10]。亲和素-生物素-酶联免疫吸附试验（ABC-ELISA）国内外资料显示，其敏感性比ELISA法高出3～8倍，开拓了ELISA在弓形虫微量抗原/抗体的检测方面的新路。其原理是通过亲和素对生物的高度亲和力与导入生物素的酶分子紧密结合，能产生放大作用。另外，斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA），双夹心酶联免疫吸附试验（DS-ELISA），抗体抗体亲合度（Avidity）的酶联免疫吸附试验等这些新型改良后的ELISA方法使显色更为清晰，能减少假阳性率的发生。抗体抗体亲合度（Avidity）的酶联免疫吸附试验最早由Hedman等使用，这种方法可以确认4、5个月前的感染，对于检测怀孕动物最初期的抗弓形虫IgG、IgM阳性非常有用。ELISA和免疫印迹实验（IBT）方法目前主要用于检测弓形虫的特异循环抗原或抗体，广泛用于现症感染。国内周永安等认为这两种方法各有其优缺点，在人和动物弓形虫病的诊断方面传统诊断应与其他新的诊断技术取长补短，相互补充才能在弓形虫病的诊断中发挥其应有的主要作用[11]。
本研究应用ELISA和IHA两种方法，平行检测12只弓形虫IgG抗体阳性兔血清和30只弓形虫IgG抗体阴性兔血清。结果提示本次实验中两种方法阳性符合率是41.67%，阴性符合率93.33%。总符合率78.57%。ELISA方法的敏感性特异性均在IHA方法之上。吕元聪等采用同一批血清对IHA、IFA、ELISA三种血清学方法诊断弓形虫病进行了比较研究，结果IHA、IFA、ELISA检出的阳性率分别为6.9%、8.5%、15.4%。以ELISA法最为敏感。然后再用ELISA与IHA法进行特异性实验在同一条件下分别进行对照实验、重复实验和交叉实验。结果提示ELISA法有良好的特异性[12]，与本次实验的结果相似。然而本次实验中两种方法检测结果的一致性较差（kappa值=0.3998），出现这种结果可能与两种方法的试剂盒原理、操作步骤、和结果判定等因素存在着差异相关。ELISA方法的敏感性和特异性、检测效率、Youden指数均高于IHA方法。
4 结论
本实验室采用两种方法平行检测家兔弓形虫抗体的结果表明，虽然ELISA方法和IHA方法均可用于检测实验动物兔的弓形虫抗体，但前者敏感性、特异性、检测效率及Youden指数均优于后者，更适用于实验动物家兔的弓形虫特异性抗体的检测。
[参考文献]
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[3] 于恩庶.弓形虫病学[M].福州：福建科学技术出版社，1992：370-460.
[4] 罗才庆，游景洲，刘晶晶，等.ELISA和IHA检测弓形虫抗体的比较试验研究[J].中国动物保健，2012，14（10）：9.
[5] 刘福元，张云峰，徐雪萍.弓形虫病的实验室诊断及技术特点[J].草食家畜（季刊），2010（1）：71-73.
[6] 宋任浩，杨圣俊，何二龙.胶体金免疫层析法与ELISA法检测弓形虫抗体的比较[J].河北医药，2011，33（23）：80.
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[12] 周永安，余新炳，陈观今.弓形虫病诊断技术的研究进展及其应用[J].中国人兽共患病杂志，2003，19（5）：29.
（收稿日期：2014-06-27）
[关键词] 弓形虫，抗体；酶联免疫试验；间接血凝试验
[中图分类号] R446.6 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）17-113-05
[Abstract] Objective To analyze and compare the feasibility of using ELISA and IHA in our laboratory for testing specific TOX-Ab in laboratory rabbit. Methods Used ELISA and IHA methods for a parallelized testing of the specific TOX-Ab contained in both the positive serum of 12 rabbits infected with toxoplasma gondii and negative serum of 30 uninfected rabbits， thus to compare the sensibility， specificity， testing efficiency and Youden index between the two methods before applying Kappa values for a consistency evaluation. Results The sensibility and specificity of IHA was 41.67% and 93.33% respectively， while that for ELISA are both 100%. The sensibility， specificity， testing efficiency and Youden index for ELISA are higher than that of IHA. The total consistency rate for such two methods was 78.57% with Kappa value equals to 0.3998. Conclusion The consistency between the use of ELISA and IHA for this parallelized testing is relatively poor， and ELISA is notably better than IHA in terms of sensitivity and specificity， therefore it is more suitable to be applied in the testing of the specific TOX-Ab in laboratory animal-rabbit.
[Key words] Toxoplasma gondii； Antibody； ELISA； IHA
刚地弓形虫简称弓形虫是寄生于猫科动物的肠道寄生虫，寄生于人体脑、眼、肺、心脏、淋巴结等组织引起寄生虫病。该虫是一种重要的机会致病原虫，尤其在宿主免疫功能低下时，可导致严重的后果。弓形虫呈世界性分布，西方发达国家和地区感染率较高，在美国所有肉食品中猪肉被认为是人类弓形虫病的最大肉食性来源。据国外报道，人群的平均感染率是25%～50%，有人推算全世界约有至少5亿人感染弓形虫[1-2]。自从1957年我国于恩庶第一个成功地从猫和兔子体内分离到弓形虫病原体开始，逐步发现我国人群感染弓形虫病原体较为广泛。人和许多动物都能感染，引起人畜共患的弓形虫病[3]。弓形虫检测方法有很多，比较常用的有病原学检查方法如动物接种法，直接染色镜检法。分子生物学诊断方法如PCR技术、核酸分子杂交技术（主要是DNA探针技术）、单克隆抗体技术以及基因芯片技术应用于检测弓形虫感染，基因芯片技术更具有灵敏、特异、早期诊断的意义，但由于基因诊断技术的高度的敏感性，操作不当，容易产生假阳性。
迄今最常用的是检测弓形虫抗体的血清学方法。1994年的实验动物寄生虫检测国标上规定间接血凝方法（IHA）是检测实验动物弓形虫抗体的两种主要的方法之一（另一种方法是IFA方法），但该方法操作耗时，结果判断容易受主观因素影响。酶联免疫法（ELISA）是很多学者公认的检测弓形虫抗体的一种可重复的方法，具有灵敏度高、特异性强、结果判断客观等优点，已被广泛应用人弓形虫病的免疫学诊断[4]。并且2008年重新修订的国标上已新增ELISA方法为实验动物弓形虫抗体的检测方法。研究表明[5]，对ELISA和其他一些血清学方法诊断弓形虫病进行评价，认为该法是检测弓形虫抗体的一种可重复的方法，易自动化和标准化。目前，临床上多采用同时检测IgM、IgG的方法来诊断现症感染。近几年主张采用两种或多种方法结合提高诊断的准确率，可以将IHA与ELISA或IFA同用，以提高的检出率和准确度[6]。新的弓形虫病的诊断方法主要在于提高敏感性和特异性，以及使操作更为简便快捷。本研究运用ELISA和IHA方法对同一批家兔血清进行检测，并对这两种定性实验检测方法的结果作比较分析。 1 材料与方法
1.1 阳性血清
由上海市疾控中心提供12只实验感染弓形虫速殖子的家兔血清并用染色方法（DT）检测确诊的阳性标本。
1.2 阴性血清
本实验室提供已用染色方法（DT）检测确诊阴性的健康家兔血清标本。
1.3 试剂
动物用弓形虫抗体检测试剂盒（酶联免疫法）从珠海经济特区海泰生物制药有限公司购得。其中主要成分及批号为：（1）酶标记物，20131106；（2）浓缩洗涤液，770131114；（3）显色液A，720130916；（4）显色液B，730131105；（5）样品稀释液，720130916；760130905；（6）终止液，740131104；（7）阳性对照，20131106；阴性对照，20131106，临界对照，20131106。弓形虫抗体间接血凝试验试剂盒，购于中国农业科学院兰州兽医研究所，批号：20131205。
1.4 仪器设备
SPECTRAmax340pc酶标仪，Thermo（815）恒温培养箱，各种刻度的微量移液器，96（12×8）孔1100 V形有机玻璃板，微型震荡器等。
1.5 检测方法
1.5.1 IHA试验操作步骤 （1）配制诊断液：弓形虫IHA诊断试剂按瓶上标示毫升数加灭菌蒸馏水稀释摇匀，2000r/min离心10min弃上清液，加等量的稀释液摇匀，置4℃下静置24h后使用。（2）加稀释液：用微量移液器在96孔有机玻璃反应板的每孔加75μL，每个样品需加稀释液3孔，均应设阳性血清、阴性血清、空白对照。阴、阳性对照加8孔（其中第8孔为稀释液对照）。（3）加待测血清、阳性对照血清、阴性对照血清：第1孔加相应血清25μL。（4）稀释：定性检测稀释到第3孔，对照血清稀释到第7孔，定性检测的第4孔、对照血清的第8孔为稀释液对照。（5）加诊断液：将诊断液摇匀，每孔加25μL诊断液，加完后将反应板置微量振荡器上振荡1～2min，取下反应板，盖上一块与反应板大小相近的玻璃置37℃作用2～3h后观察结果。（6）结果判定方法：在阳性对照血清效价不低于1∶1024，阴性对照血清除第1孔允许有前滞现象“+”外，其余各孔均为“-”稀释液对照为“-”的前提下，待检血清效价达到或超过1∶64为阳性。“++”为阳性终点。
1.5.2 ELISA试验操作步骤 （1）洗涤液配制：试剂盒放置室温平衡20～30min。浓缩洗涤液用去离子水10倍稀释。（2）样品稀释：样品1∶100稀释：将样品稀释液1mL加入一洁净小管内，加10μL待检样品，充分混匀。（3）加样反应：加板条固定于板架上，剩余的板条用不干胶密封并放入密封袋中保存。每孔加入稀释后样品100μL。临界对照加3孔，阴、阳性对照各加1孔，100μL/孔。另留一孔不加任何液体为空白对照。置37℃30min。（4）加酶反应：甩净孔中液体，洗板3次，每次停留1min后甩净拍干，除空白对照外每孔加酶标记物1滴，置37℃30min。（5）显色反应：甩净孔中液体，同上洗板3次，拍干后各孔滴加显色液A、B各1滴，置37℃避光10min。（6）终止反应：每孔立即加入终止液1滴，混匀后用酶标仪450nm读数判定结果。（7）结果判定：以空白孔调零，450nm波长测定OD值。阴性对照值≤0.20，临界对照OD值0.20～0.60，阳性对照值>0.60，证明实验成立。按以下方法判断：阳性：样品OD值>临界对照OD值平均值×1.1；可疑：临界对照OD值平均值×0.9≤样品OD值≤临界对照OD值平均值×1.1；阴性：样品OD值<临界对照OD值平均值×0.9。
1.6 统计学处理
检测数据用SPSS16.0进行一致性检验。
2 结果
2.1 IHA检测结果
应用IHA方法检测已知兔阳性血清1～12号样本中，3#、5#、8#、9#、11#5个样本红细胞部分呈膜状沉着，周围有凝集团点，中央沉点大。血清效价≥1∶64判定为“++”，其余7个样本红细胞沉集于中心，周围无沉着物，分界清楚。血清效价<1∶64均呈阴性反应。
应用IHA方法检测已知兔阴性血清1～30号样本中，除了16#、22# 2个样本血清效价≥1∶64判定为“++”，其余28个样本均呈阴性反应。
根据以上检测结果得出IHA方法检测已知兔阳性血清的敏感性是41.67%，检测已知兔阴性血清特异性是93.33%。见表1。
3 讨论
自从上个世纪60年代于恩庶等在国内首先建立DT染色试验用于检测弓形虫感染以来，现有的弓形虫感染的血清学诊断技术不下10余种。虽然DT试验特异强，敏感性高已被公认，但是DT染色试验需要弓形虫活的虫体，在实际应用中不易开展。因此现在国内已不再有人用此方法来检验弓形虫感染。目前主要用抗体检测法，如补体结合试验（CT），间接血凝试验（IHA），乳胶凝集试验（LAT），碳粒凝集试验（CAT），间接免疫荧光试验（IFA），酶联免疫吸附试验（ELISA）等。应用较多的是IHA、ELISA和IFA。IHA有商品抗原供应，操作方法简便，所以应用较广。ELISA敏感性特异性优于IHA。间接血凝试验（IHA）其原理是抗原包被于红细胞表面成为载体再与相应的抗体结合，从而使红细胞聚集在一起，出现肉眼可见的凝集反应。但容易发生非特异性凝集现象。Jacob和Lunde1957年首次将间接血凝实验用于检测弓形虫病[8]。酶联免疫吸附试验（ELISA）是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体。将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，与受检血清中特异性的抗体结合，形成固相抗原抗体复合物，再与酶标抗抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶，催化底物3，3’—5，5’—四甲基联苯胺显色，3，3’—5，5’—四甲基联苯胺显色，用酶标仪在450nm波长下读取OD值，判定有无弓形虫特异性抗体，结果较为客观。而IHA方法仅依靠肉眼识别凝集颗粒的有无以及大小，主观因素的影响不可忽视。此外，实验室之间，不同批号制备的致敏红细胞的质量大相径庭，重复性较差，这些缺点客观上不利于IHA方法的广泛使用。然而，IHA方法简便快速，所用器材简单，便于大批量样品基层单位使用。ELISA方法的操作简便快捷，但对操作和时间的要求比较严格。另外，ELISA是诊断弓形虫感染应用最广的技术之一，ELISA试剂盒的最明显的优点是设计的亲和力[9]。 当前ELISA方法在检测弓形虫病原诊断方面具有广阔的应用前景。国外不少实验室也有用重组抗原诊断弓形虫病。如Lecordier等用重组的致密颗粒抗原（Dense granule antigen，GRA）GRA1和GRA6作为诊断用抗原取得良好的结果[10]。国内贾雪梅等也建立了GRA1基因体外扩增方法，进一步研究发现GRA1与GRA6-Nt联合应用可使敏感性达到98%。GST-GRA6-Nt与GAR1联合采用ELISA法可于弓形虫病的血清学诊断[10]。亲和素-生物素-酶联免疫吸附试验（ABC-ELISA）国内外资料显示，其敏感性比ELISA法高出3～8倍，开拓了ELISA在弓形虫微量抗原/抗体的检测方面的新路。其原理是通过亲和素对生物的高度亲和力与导入生物素的酶分子紧密结合，能产生放大作用。另外，斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA），双夹心酶联免疫吸附试验（DS-ELISA），抗体抗体亲合度（Avidity）的酶联免疫吸附试验等这些新型改良后的ELISA方法使显色更为清晰，能减少假阳性率的发生。抗体抗体亲合度（Avidity）的酶联免疫吸附试验最早由Hedman等使用，这种方法可以确认4、5个月前的感染，对于检测怀孕动物最初期的抗弓形虫IgG、IgM阳性非常有用。ELISA和免疫印迹实验（IBT）方法目前主要用于检测弓形虫的特异循环抗原或抗体，广泛用于现症感染。国内周永安等认为这两种方法各有其优缺点，在人和动物弓形虫病的诊断方面传统诊断应与其他新的诊断技术取长补短，相互补充才能在弓形虫病的诊断中发挥其应有的主要作用[11]。
本研究应用ELISA和IHA两种方法，平行检测12只弓形虫IgG抗体阳性兔血清和30只弓形虫IgG抗体阴性兔血清。结果提示本次实验中两种方法阳性符合率是41.67%，阴性符合率93.33%。总符合率78.57%。ELISA方法的敏感性特异性均在IHA方法之上。吕元聪等采用同一批血清对IHA、IFA、ELISA三种血清学方法诊断弓形虫病进行了比较研究，结果IHA、IFA、ELISA检出的阳性率分别为6.9%、8.5%、15.4%。以ELISA法最为敏感。然后再用ELISA与IHA法进行特异性实验在同一条件下分别进行对照实验、重复实验和交叉实验。结果提示ELISA法有良好的特异性[12]，与本次实验的结果相似。然而本次实验中两种方法检测结果的一致性较差（kappa值=0.3998），出现这种结果可能与两种方法的试剂盒原理、操作步骤、和结果判定等因素存在着差异相关。ELISA方法的敏感性和特异性、检测效率、Youden指数均高于IHA方法。
4 结论
本实验室采用两种方法平行检测家兔弓形虫抗体的结果表明，虽然ELISA方法和IHA方法均可用于检测实验动物兔的弓形虫抗体，但前者敏感性、特异性、检测效率及Youden指数均优于后者，更适用于实验动物家兔的弓形虫特异性抗体的检测。
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（收稿日期：2014-06-27）