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摘要：目的： 研究产超光谱β-内酰胺酶（ESBL）肠杆菌科细菌的表型与基因型，探讨其耐药性机制。方法： 对我院临床分离的50株产ESBL肠杆菌科细菌，通过纸片扩散法，测定产酶菌对不同抗生素的MIC值，作出表型确证；同时采用PCR技术，用针对SHV、TEM、CTX-M基因的特异性引物进行扩增，确定ESBL基因型。结果： 60株ESBLs菌株中， 肺炎克雷伯氏菌占38.25%，大肠埃希氏菌49.63%，产气肠杆菌3.11%，阴沟肠杆菌2.67%，铜绿假单胞菌5.30%，其他1.04% 。；采用PCR扩增后， SHV、TEM、和CTX-M阳性率分别为21.6%、75.5%、和2.9%。可见我院流行的ESBLs菌株主要为大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌，且以TEM型为主。结论：PCR技术是监控产ESBLs菌株基因型的好方法，对临床抗生素的使用有指导意义。
关键词： ESBLs 耐药性 PCR 纸片扩散法
细菌感染一直严重威胁着人类的生存。抗生素曾使人类有效控制了许多可怕的细菌感染性疾病，发病率和死亡率明显下降。然而，进入20 世纪80 年代，越来越多的细菌产生了耐药性，甚至多重耐药。本课题利用PCR测序等技术对来自本院的产β-内酰胺酶的肠杆菌的表型和基因型进行测定，研究其耐药性机制，对于指导临床正确应用抗生素，减少医院内感染的发生，具有重要的临床应用价值。具体报道如下：
1. 临床材料
1.1 菌株来源
本研究收集2013年10月～2014年6月间，本院从住院患者送检标本中分离到产ESBLs的肠杆菌科细菌共60株。主要有肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、和铜绿假单胞菌等。
1.2 试剂和仪器
1.2.1主要试剂 TaqDNA聚合酶购自Promega公司；dNTP购自上海生物工程公司；质粒提取试剂盒、质粒纯化试剂盒均购自上海申能博彩生物科技有限公司。
1.2.2实验仪器
电泳仪（水平式）YW型，PTC-100TM PCR扩增仪，抑菌圈测定仪，数控超净工作台TOP-1300，紫外检测仪BIO-BAD
2方法
2.1ESBLs表型确证试验
2.1.1药敏纸片： 头孢曲松、头孢他啶、氨曲南、头孢曲松+克拉维酸、头孢他啶+克拉维酸，氨曲南+克拉维酸，药敏纸片均购自英国Oxoid公司。质控菌株：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌购自卫生部药品鉴定所
2.1.2釆用临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的标准纸片扩散确证法测定。
2.2 ESBLs基因型确证试验
2.2.1引物序列：blaSHV基因引物序列1：5′-TCGGGCCGCGTAGGCATGAT-3′、序列2： 5′-TCCcGcAGATAAATCACCA-3；blaTEM基因引物序列1： 5′-ATAAAATT-CTTGAC-3′、序列2： 5′-TTACCAATGCTTAA-TCA-3′；blaCTX-M基因引物序列1： 5′-CGTTTTGCGATGTGCAG-3′、序列2： 5′-ACCGCGATGTCGTTGGT-3′。
2.2.2PCR反应步骤：（1）煮沸提取所选5株代表性细菌DNA，制备模板；（2）PCR反应体系：引物1μL，dNTP（200μmol/μL）1μL，Taq酶0. 5 U，DNA模板2μL，缓冲液（含Mg2+）5μL，加二次蒸馏水至总体积为50μL。（3）反应条件：94℃30min条件下预变性，94℃30s变性，45℃40s退火，72℃延伸45s，共35个循环。（4）扩增产物置琼脂糖凝胶中电泳1h，观察凝胶成像。
3结果
经纸片扩散法得60株ESBLs菌株中， 肺炎克雷伯氏菌占38.25%，大肠埃希氏菌49.63%，产气肠杆菌3.11%，阴沟肠杆菌2.67%，铜绿假单胞菌5.30%，其他1.04% 。表明我院临床产酶株主要为大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌。针对SHV、TEM、和CTX-M三对引物，采用PCR扩增后，阳性率分别为21.6%、75.5%、和2.9%。可见我院ESBLs菌株主要为TEM型，部分为SHV型，少数为CTX-M型。
4讨论
超广谱β -内酰胺酶（ESBL）是以灭活窄谱和广谱头孢菌素、单环类抗生素及抗格兰阴性杆菌青霉素等抗生素为特征的β -内酰胺酶，是细菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制。细菌的耐药给临床工作带来了巨大的难题，成为人类健康事业面临的严重问题之一。与西方国家相比，特别是与美国相比，我国抗菌药物使用问题较多，最突出问题为缺乏相应法规，导致责任不明，缺乏管理及监督的混乱和失控状态。相关研究表明， ESBL主要存在于临床分离的革兰阴性杆菌中， 我国多分布于肠杆菌科细菌，以肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌最为常见，在阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌、变形杆菌等菌种中也有报道。根据质粒所携带编码基因同源性的不同，主要分为TEM、SHV、CTX-M、OXA等类型。
本研究采用纸片扩散法确证了本院临床分离菌株的表型，主要为大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌。在利用PCR技术对不同型引物扩增培养后，将测序结果在NCBI数据库进行基因比对，同源性均在99%以上。发现我院流行的ESBLs菌株基因型主要为TEM型，部分为SHV型，少数为CTX-M型。这些结果对我院临床细菌感染疾病的预防和治疗以及抗生素用药有指导意义。
参考文献：
[1] 胡付品，朱德妹.2013年中国CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志.2014，9，14（5）
[2] 张亚兰.肠杆菌科中产超广谱β-内酰胺酶菌株的基因型分析[D].2012
[3] 刘淑敏.肠杆菌科细菌对β-内酰胺类抗生素耐药机制的研究现状[J]. 微生物学免疫学进展.2014，10，42（5）
[4] Crivellaro S， Leone I， Bianco O，et al. Surveillance of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated in Torino （northwest Italy） [J].Diagn Microbiol Infect Dis. 2011， 69（3）：250-7.
关键词： ESBLs 耐药性 PCR 纸片扩散法
细菌感染一直严重威胁着人类的生存。抗生素曾使人类有效控制了许多可怕的细菌感染性疾病，发病率和死亡率明显下降。然而，进入20 世纪80 年代，越来越多的细菌产生了耐药性，甚至多重耐药。本课题利用PCR测序等技术对来自本院的产β-内酰胺酶的肠杆菌的表型和基因型进行测定，研究其耐药性机制，对于指导临床正确应用抗生素，减少医院内感染的发生，具有重要的临床应用价值。具体报道如下：
1. 临床材料
1.1 菌株来源
本研究收集2013年10月～2014年6月间，本院从住院患者送检标本中分离到产ESBLs的肠杆菌科细菌共60株。主要有肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、和铜绿假单胞菌等。
1.2 试剂和仪器
1.2.1主要试剂 TaqDNA聚合酶购自Promega公司；dNTP购自上海生物工程公司；质粒提取试剂盒、质粒纯化试剂盒均购自上海申能博彩生物科技有限公司。
1.2.2实验仪器
电泳仪（水平式）YW型，PTC-100TM PCR扩增仪，抑菌圈测定仪，数控超净工作台TOP-1300，紫外检测仪BIO-BAD
2方法
2.1ESBLs表型确证试验
2.1.1药敏纸片： 头孢曲松、头孢他啶、氨曲南、头孢曲松+克拉维酸、头孢他啶+克拉维酸，氨曲南+克拉维酸，药敏纸片均购自英国Oxoid公司。质控菌株：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌购自卫生部药品鉴定所
2.1.2釆用临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的标准纸片扩散确证法测定。
2.2 ESBLs基因型确证试验
2.2.1引物序列：blaSHV基因引物序列1：5′-TCGGGCCGCGTAGGCATGAT-3′、序列2： 5′-TCCcGcAGATAAATCACCA-3；blaTEM基因引物序列1： 5′-ATAAAATT-CTTGAC-3′、序列2： 5′-TTACCAATGCTTAA-TCA-3′；blaCTX-M基因引物序列1： 5′-CGTTTTGCGATGTGCAG-3′、序列2： 5′-ACCGCGATGTCGTTGGT-3′。
2.2.2PCR反应步骤：（1）煮沸提取所选5株代表性细菌DNA，制备模板；（2）PCR反应体系：引物1μL，dNTP（200μmol/μL）1μL，Taq酶0. 5 U，DNA模板2μL，缓冲液（含Mg2+）5μL，加二次蒸馏水至总体积为50μL。（3）反应条件：94℃30min条件下预变性，94℃30s变性，45℃40s退火，72℃延伸45s，共35个循环。（4）扩增产物置琼脂糖凝胶中电泳1h，观察凝胶成像。
3结果
经纸片扩散法得60株ESBLs菌株中， 肺炎克雷伯氏菌占38.25%，大肠埃希氏菌49.63%，产气肠杆菌3.11%，阴沟肠杆菌2.67%，铜绿假单胞菌5.30%，其他1.04% 。表明我院临床产酶株主要为大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌。针对SHV、TEM、和CTX-M三对引物，采用PCR扩增后，阳性率分别为21.6%、75.5%、和2.9%。可见我院ESBLs菌株主要为TEM型，部分为SHV型，少数为CTX-M型。
4讨论
超广谱β -内酰胺酶（ESBL）是以灭活窄谱和广谱头孢菌素、单环类抗生素及抗格兰阴性杆菌青霉素等抗生素为特征的β -内酰胺酶，是细菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制。细菌的耐药给临床工作带来了巨大的难题，成为人类健康事业面临的严重问题之一。与西方国家相比，特别是与美国相比，我国抗菌药物使用问题较多，最突出问题为缺乏相应法规，导致责任不明，缺乏管理及监督的混乱和失控状态。相关研究表明， ESBL主要存在于临床分离的革兰阴性杆菌中， 我国多分布于肠杆菌科细菌，以肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌最为常见，在阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌、变形杆菌等菌种中也有报道。根据质粒所携带编码基因同源性的不同，主要分为TEM、SHV、CTX-M、OXA等类型。
本研究采用纸片扩散法确证了本院临床分离菌株的表型，主要为大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌。在利用PCR技术对不同型引物扩增培养后，将测序结果在NCBI数据库进行基因比对，同源性均在99%以上。发现我院流行的ESBLs菌株基因型主要为TEM型，部分为SHV型，少数为CTX-M型。这些结果对我院临床细菌感染疾病的预防和治疗以及抗生素用药有指导意义。
参考文献：
[1] 胡付品，朱德妹.2013年中国CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志.2014，9，14（5）
[2] 张亚兰.肠杆菌科中产超广谱β-内酰胺酶菌株的基因型分析[D].2012
[3] 刘淑敏.肠杆菌科细菌对β-内酰胺类抗生素耐药机制的研究现状[J]. 微生物学免疫学进展.2014，10，42（5）
[4] Crivellaro S， Leone I， Bianco O，et al. Surveillance of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated in Torino （northwest Italy） [J].Diagn Microbiol Infect Dis. 2011， 69（3）：250-7.