论文部分内容阅读
摘要 [目的]筛选适合皖南烟区稻曲病防治的杀菌剂，为皖南烟区水稻稻曲病的防治提供参考。[方法]对南粳9108水稻稻曲病的发病情况进行了调查及病原菌鉴定，同时采用生长速率法测定6种杀菌剂对稻曲病病原菌的室内毒力。[结果]南粳9108水稻稻曲病的发生较严重，发病率达62%；稻曲病病原菌为半知菌亚门稻绿核菌属绿核菌；6种药剂对菌丝生长的抑制效果不同，30%苯甲·丙环唑EC和6%井冈·枯芽菌WP的抑菌作用最强，其EC50分别为0.245 7和3.150 1 μg/mL。[结论]30%苯甲·丙环唑EC和6%井冈·枯芽菌WP的防治效果较好，可进一步用于大田防治试验。
关键词 稻曲病；病害调查；病原菌鉴定；杀菌剂筛选
中图分类号 S435.111.4+6 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）23-126-03
烟稻轮作种植模式是指烟草和水稻充分利用土地，实现土地用养，从而有效地提高水稻品质、增加经济收益[1]。近年来，皖南烟区推行烟稻轮作种植模式，旨在解决烟叶连作障碍的同时充分利用土地资源，实现利益最大化。
随着高产优质水稻大面积推广、相应施肥水平的提高，稻曲病危害逐年加重[2]。该病不仅造成水稻减产，其带有毒素的孢子还会污染健康的稻谷，降低稻米的品质，严重制约着水稻的无公害生产[3]。多数水稻品种不能对稻曲病菌高抗，因此，筛选高效低毒药剂成为防治稻曲病的一个重要手段。鉴于此，笔者对水稻稻曲病进行了系统的病害调查及室内药剂试验，以期为稻曲病的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试作物。
水稻品种：南粳9108。
1.1.2 供试农药。30%苯甲·丙环唑EC[先正达（苏州）作物保护有限公司]、6%井冈·枯芽菌WP（江苏省苏科农化有限责任公司）、25%氟环唑SC（山东省联合农药工业有限公司）、20%井冈霉素WP（浙江省桐庐汇丰生物科技有限公司）、75%肟菌·戊唑醇WG[拜耳作物科学（中国）有限公司]、50%多菌灵WP（江苏省江阴市农药二厂有限公司）。
1.2 调查地概况
皖南烟区地处安徽省宣城市宣州区杨柳镇，属亚热带湿润季风气候，阳光充足，年降雨量大。烟区水稻种植面积大，种植品种达20余种。随着种植年份的增加，稻曲病在某些水稻品种上的发病也越严重，严重影响水稻的品质和经济效益。
1.3 调查方法
于2015年7月（拔节期）开始对南粳9108稻曲病进行定点、定期调查并拍照。从水稻拔节期开始，采用5点法，每小区随机选取10 穗水稻，每隔10 d调查一次稻曲病的发生情况，至蜡熟期为止。按稻曲病分级标准进行病害统计，计算其穗发病率及病情指数。
稻曲病分级标准：0级，未发病；1级，1个菌球；2级，2～5个菌球；3级，6～10个菌球；4级，11～15个菌球；5级，16个菌球以上[4]。
穗发病率=调查病穗数/调查总穗数×100%
病情指数=∑[（各级穗数×该级代表值）/（调查总穗数×5）]×100
1.4 病原菌的鉴定及致病性测定
1.4.1 形态学鉴定。
选取具有典型症状的稻曲病样品，徒手切片、刮取或挑取病部病征制片，显微镜下观察病原菌形态特征。对分离纯化得到的病原菌，观测其在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上培养的性状，包括菌落的性状、大小和颜色等，观测菌丝及厚垣孢子的形态特征，描述其形态并进行显微拍照等。根据病组织症状，结合病原菌形态特征进行病原菌的初步鉴定[5]。
1.4.2 分子鉴定。
对已分离纯化的病原菌，采用CTAB法进行DNA的提取，然后在ITS等保守的区域设计通用引物，PCR扩展、测序，最后对测序的结果在NCBI上进行Blast比对鉴定到属或种[6]。
1.5 防治药剂筛选
采用生长速率法测定6种杀菌剂对稻曲病菌的抑菌效果。将供试杀菌剂分别于无菌条件下配成对应浓度的10倍，取1 mL母液和9 mL PDA培养基混匀后倒入9.0 cm培养皿中，制成所需浓度的培养基，每处理3个平行。用内径为0.5 cm打孔器在经分离培养的菌落上打取菌饼，将带菌丝面转接至每个含药的PDA平板上，同时以加入等量无菌水作为对照（CK）。在25 ℃恒温箱中培养5 d后用十字交叉法测量菌落直径，取均值并计算抑制率。运用DPS7.05数据处理软件[7]，分别以处理浓度的对数值为横坐标，抑制率为纵坐标计算毒力回归方程，并求出抑制中浓度（EC50）及相关系数（r）[8]。
抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-0.5）×100%
2 结果与分析
2.1 稻曲病田间发病情况
由图1可知，水稻稻曲病的调查从7月21日开始，7月31日开始发病，且发病越来越重。其中，8月10日发病率为26%，病情指数10.0，分别较7月31日发病率（6%）、病情指数（1.2）提高20%、8.8；8月20日发病率为40%，病情指数为17.2，分别比8月10日提高14%、7.2，这2个时期的变化尤为显著，病害发生严重。分析原因，除遗传因素外，该区域7～8月为降雨多发月份，正值南粳9108孕穗期、抽穗期的稻曲病易发生育期，因而造成了稻曲病的大暴发。
2.2 稻曲病病原菌的鉴定
2.2.1 发病症状。
稻曲病在开花后至乳熟期发病，病菌危害穗部谷粒。发病初期在颖壳外形成乳白色的薄膜包被的扁平球体，在颖壳内部形成菌丝块并逐渐长大，露出淡黄色小型块状物，而后小型块状物逐渐长大并撑开内外颖壳自合缝处外露，包裹整个花器，最后逐渐开裂并有绿褐色绒状物生出，整个病粒形成1个菌核结构[9]。一般每穗稻上的病粒数为1～10粒，多则超过20粒。 2.2.2 形态学特征。
稻曲病菌在PDA上培养3 d左右产生白色菌丝，后菌落逐渐扩大，7 d左右开始形成渐黄色厚垣孢子堆（图2）。厚垣孢子有黄色、黄绿色和黑色3种类型[10]，侧生于菌丝上，球形或椭圆形，大小为（4.0～7.8）×（3.0～7.0）μm。未成熟的厚垣孢子较小，黄色光滑而透明，胞内基质均匀，周围刺不明显；成熟的厚垣孢子较大，颜色深墨绿色至黑色，壁厚0.3 μm，胞内基质浓厚，周围有明显的瘤状突起（图3）。
2.2.3 分子生物学鉴定。
以分离纯化得到的菌株基因组DNA为模板，以ITS1和ITS4引物进行PCR扩增，产物送至北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，得到菌株的ITS区序列：
TGAAACTCCAACTCAAACGAAGTCGTATGCG-TGCGACAAAGCGAAGCGTCCTCTCAATGCTTTTATGGCTTTC-CGAAGTAAGCGCTAATTCTCGTTATCGAAGATTTTTACGCTG-ACTCTAAAACTAGGCTACTATCTGAAGATGTTCCCTGATGTT-CAGCAAAAAACTGCGTCTGGATTTTTGACCACCCTGTGGAA-CAAGGATCCGTTCCGAAATAAATGGGCGTTGATAGCCAAA-GTTA。
上述序列经Blast并与NCBI数据库中的已知序列进行同源性比较，并结合形态学鉴定结果，该病原菌为半知菌亚门稻绿核菌属绿核菌[Ustilaginoidea virens（Cooke.）Takah]。
2.3 各种杀菌剂对稻曲病病原的抑制作用
2.3.1 抑制率。
由表1可知，菌丝的生长在设定药剂浓度的范围内均受到不同程度的抑制，且抑制率随药剂浓度的升高而增大。各药剂的抑制率大小顺序为30%苯甲·丙环唑EC、6%井冈·枯芽菌WP、25%氟环唑SC、20%井冈霉素WP、75%肟菌·戊唑醇WG、50%多菌灵WP。
2.3.2 毒力。
由表2可知，6种供试药剂的浓度与抑菌率的相关系数均大于0.9，线性关系良好。各药剂中，30%苯甲·丙环唑EC的抑菌作用最强，其EC50值为0.245 7 μg/mL；6%井冈·枯芽菌WP次之，其EC50值为3.150 1 μg/mL，其抑菌作用较强；25%氟环唑SC、20%井冈霉素WP也有较好的抑菌活性，其EC50值分别为16.233 0和28.046 0 μg/mL；75%肟菌·戊唑醇WG的抑菌活性较差，尤以50%多菌灵WP的抑菌作用最差，EC50值为885.481 5 μg/mL。
3 结论与讨论
通过对稻曲病病原菌形态学特性和分子生物学鉴定，确定了稻曲病病原菌为半知菌亚门稻绿核菌属绿核菌。防治稻曲病应掌握防治时期，尤其是孕穗期至抽穗期遇多雨天气，发病多且重，应抓住雨停时间及时施药，错过施药时间，防治效果会明显下降。
除气候因素外，水稻稻曲病因防治药剂的单一和局限性，常常得不到及时有效的预防和控制。试验结果表明，6种杀菌剂对稻曲病菌菌丝的生长均有不同程度的抑制作用，可选用30%苯甲·丙环唑EC和6%井冈·枯芽菌WP交替施用，提高防治效果的同时降低稻曲菌抗药性能，以有效防控皖南烟区水稻稻曲病的发生。
参考文献
[1]范月梅.烟稻轮作种植模式分析[J].吉林农业，2012（4）：109.
[2]蔡广成，孙友武，张梦梅.6%井冈霉素·240亿枯草芽孢杆菌WP对稻曲病的控制效果研究[J].安徽农业科学，20139（8）：4576-4577.
[3]陈曜.稻曲病菌的生物学、侵染特性与防治[D].福州：福建农林大学，2013.
[4]邓根生，刘铸德，杨治华.稻曲病分级标准研究[J].陕西农业科学，1989（4）：23-25.
[5]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.
[6]周小燕.贵州柑橘主要真菌病害防治药剂筛选及抗病品种引进[D].贵阳：贵州大学，2012.
[7]唐启义，冯明光.实用统计分析及其计算机处理平台[M].北京：中国农业出版社，1997：135-139.
[8]孙广宇，宗兆锋.植物病理学实验技术[M].北京：中国农业出版社，2002.
[9]夏宝远，王林.我国水稻稻曲病的研究现状[J].畜牧与饲料科学，2009，30（1）：33-34.
[10]张君成，陈志谊，张炳欣，等.稻曲病菌的形态学观察研究[J].植物病理学报，2003，33（6）：517-523.
关键词 稻曲病；病害调查；病原菌鉴定；杀菌剂筛选
中图分类号 S435.111.4+6 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）23-126-03
烟稻轮作种植模式是指烟草和水稻充分利用土地，实现土地用养，从而有效地提高水稻品质、增加经济收益[1]。近年来，皖南烟区推行烟稻轮作种植模式，旨在解决烟叶连作障碍的同时充分利用土地资源，实现利益最大化。
随着高产优质水稻大面积推广、相应施肥水平的提高，稻曲病危害逐年加重[2]。该病不仅造成水稻减产，其带有毒素的孢子还会污染健康的稻谷，降低稻米的品质，严重制约着水稻的无公害生产[3]。多数水稻品种不能对稻曲病菌高抗，因此，筛选高效低毒药剂成为防治稻曲病的一个重要手段。鉴于此，笔者对水稻稻曲病进行了系统的病害调查及室内药剂试验，以期为稻曲病的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试作物。
水稻品种：南粳9108。
1.1.2 供试农药。30%苯甲·丙环唑EC[先正达（苏州）作物保护有限公司]、6%井冈·枯芽菌WP（江苏省苏科农化有限责任公司）、25%氟环唑SC（山东省联合农药工业有限公司）、20%井冈霉素WP（浙江省桐庐汇丰生物科技有限公司）、75%肟菌·戊唑醇WG[拜耳作物科学（中国）有限公司]、50%多菌灵WP（江苏省江阴市农药二厂有限公司）。
1.2 调查地概况
皖南烟区地处安徽省宣城市宣州区杨柳镇，属亚热带湿润季风气候，阳光充足，年降雨量大。烟区水稻种植面积大，种植品种达20余种。随着种植年份的增加，稻曲病在某些水稻品种上的发病也越严重，严重影响水稻的品质和经济效益。
1.3 调查方法
于2015年7月（拔节期）开始对南粳9108稻曲病进行定点、定期调查并拍照。从水稻拔节期开始，采用5点法，每小区随机选取10 穗水稻，每隔10 d调查一次稻曲病的发生情况，至蜡熟期为止。按稻曲病分级标准进行病害统计，计算其穗发病率及病情指数。
稻曲病分级标准：0级，未发病；1级，1个菌球；2级，2～5个菌球；3级，6～10个菌球；4级，11～15个菌球；5级，16个菌球以上[4]。
穗发病率=调查病穗数/调查总穗数×100%
病情指数=∑[（各级穗数×该级代表值）/（调查总穗数×5）]×100
1.4 病原菌的鉴定及致病性测定
1.4.1 形态学鉴定。
选取具有典型症状的稻曲病样品，徒手切片、刮取或挑取病部病征制片，显微镜下观察病原菌形态特征。对分离纯化得到的病原菌，观测其在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上培养的性状，包括菌落的性状、大小和颜色等，观测菌丝及厚垣孢子的形态特征，描述其形态并进行显微拍照等。根据病组织症状，结合病原菌形态特征进行病原菌的初步鉴定[5]。
1.4.2 分子鉴定。
对已分离纯化的病原菌，采用CTAB法进行DNA的提取，然后在ITS等保守的区域设计通用引物，PCR扩展、测序，最后对测序的结果在NCBI上进行Blast比对鉴定到属或种[6]。
1.5 防治药剂筛选
采用生长速率法测定6种杀菌剂对稻曲病菌的抑菌效果。将供试杀菌剂分别于无菌条件下配成对应浓度的10倍，取1 mL母液和9 mL PDA培养基混匀后倒入9.0 cm培养皿中，制成所需浓度的培养基，每处理3个平行。用内径为0.5 cm打孔器在经分离培养的菌落上打取菌饼，将带菌丝面转接至每个含药的PDA平板上，同时以加入等量无菌水作为对照（CK）。在25 ℃恒温箱中培养5 d后用十字交叉法测量菌落直径，取均值并计算抑制率。运用DPS7.05数据处理软件[7]，分别以处理浓度的对数值为横坐标，抑制率为纵坐标计算毒力回归方程，并求出抑制中浓度（EC50）及相关系数（r）[8]。
抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-0.5）×100%
2 结果与分析
2.1 稻曲病田间发病情况
由图1可知，水稻稻曲病的调查从7月21日开始，7月31日开始发病，且发病越来越重。其中，8月10日发病率为26%，病情指数10.0，分别较7月31日发病率（6%）、病情指数（1.2）提高20%、8.8；8月20日发病率为40%，病情指数为17.2，分别比8月10日提高14%、7.2，这2个时期的变化尤为显著，病害发生严重。分析原因，除遗传因素外，该区域7～8月为降雨多发月份，正值南粳9108孕穗期、抽穗期的稻曲病易发生育期，因而造成了稻曲病的大暴发。
2.2 稻曲病病原菌的鉴定
2.2.1 发病症状。
稻曲病在开花后至乳熟期发病，病菌危害穗部谷粒。发病初期在颖壳外形成乳白色的薄膜包被的扁平球体，在颖壳内部形成菌丝块并逐渐长大，露出淡黄色小型块状物，而后小型块状物逐渐长大并撑开内外颖壳自合缝处外露，包裹整个花器，最后逐渐开裂并有绿褐色绒状物生出，整个病粒形成1个菌核结构[9]。一般每穗稻上的病粒数为1～10粒，多则超过20粒。 2.2.2 形态学特征。
稻曲病菌在PDA上培养3 d左右产生白色菌丝，后菌落逐渐扩大，7 d左右开始形成渐黄色厚垣孢子堆（图2）。厚垣孢子有黄色、黄绿色和黑色3种类型[10]，侧生于菌丝上，球形或椭圆形，大小为（4.0～7.8）×（3.0～7.0）μm。未成熟的厚垣孢子较小，黄色光滑而透明，胞内基质均匀，周围刺不明显；成熟的厚垣孢子较大，颜色深墨绿色至黑色，壁厚0.3 μm，胞内基质浓厚，周围有明显的瘤状突起（图3）。
2.2.3 分子生物学鉴定。
以分离纯化得到的菌株基因组DNA为模板，以ITS1和ITS4引物进行PCR扩增，产物送至北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，得到菌株的ITS区序列：
TGAAACTCCAACTCAAACGAAGTCGTATGCG-TGCGACAAAGCGAAGCGTCCTCTCAATGCTTTTATGGCTTTC-CGAAGTAAGCGCTAATTCTCGTTATCGAAGATTTTTACGCTG-ACTCTAAAACTAGGCTACTATCTGAAGATGTTCCCTGATGTT-CAGCAAAAAACTGCGTCTGGATTTTTGACCACCCTGTGGAA-CAAGGATCCGTTCCGAAATAAATGGGCGTTGATAGCCAAA-GTTA。
上述序列经Blast并与NCBI数据库中的已知序列进行同源性比较，并结合形态学鉴定结果，该病原菌为半知菌亚门稻绿核菌属绿核菌[Ustilaginoidea virens（Cooke.）Takah]。
2.3 各种杀菌剂对稻曲病病原的抑制作用
2.3.1 抑制率。
由表1可知，菌丝的生长在设定药剂浓度的范围内均受到不同程度的抑制，且抑制率随药剂浓度的升高而增大。各药剂的抑制率大小顺序为30%苯甲·丙环唑EC、6%井冈·枯芽菌WP、25%氟环唑SC、20%井冈霉素WP、75%肟菌·戊唑醇WG、50%多菌灵WP。
2.3.2 毒力。
由表2可知，6种供试药剂的浓度与抑菌率的相关系数均大于0.9，线性关系良好。各药剂中，30%苯甲·丙环唑EC的抑菌作用最强，其EC50值为0.245 7 μg/mL；6%井冈·枯芽菌WP次之，其EC50值为3.150 1 μg/mL，其抑菌作用较强；25%氟环唑SC、20%井冈霉素WP也有较好的抑菌活性，其EC50值分别为16.233 0和28.046 0 μg/mL；75%肟菌·戊唑醇WG的抑菌活性较差，尤以50%多菌灵WP的抑菌作用最差，EC50值为885.481 5 μg/mL。
3 结论与讨论
通过对稻曲病病原菌形态学特性和分子生物学鉴定，确定了稻曲病病原菌为半知菌亚门稻绿核菌属绿核菌。防治稻曲病应掌握防治时期，尤其是孕穗期至抽穗期遇多雨天气，发病多且重，应抓住雨停时间及时施药，错过施药时间，防治效果会明显下降。
除气候因素外，水稻稻曲病因防治药剂的单一和局限性，常常得不到及时有效的预防和控制。试验结果表明，6种杀菌剂对稻曲病菌菌丝的生长均有不同程度的抑制作用，可选用30%苯甲·丙环唑EC和6%井冈·枯芽菌WP交替施用，提高防治效果的同时降低稻曲菌抗药性能，以有效防控皖南烟区水稻稻曲病的发生。
参考文献
[1]范月梅.烟稻轮作种植模式分析[J].吉林农业，2012（4）：109.
[2]蔡广成，孙友武，张梦梅.6%井冈霉素·240亿枯草芽孢杆菌WP对稻曲病的控制效果研究[J].安徽农业科学，20139（8）：4576-4577.
[3]陈曜.稻曲病菌的生物学、侵染特性与防治[D].福州：福建农林大学，2013.
[4]邓根生，刘铸德，杨治华.稻曲病分级标准研究[J].陕西农业科学，1989（4）：23-25.
[5]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.
[6]周小燕.贵州柑橘主要真菌病害防治药剂筛选及抗病品种引进[D].贵阳：贵州大学，2012.
[7]唐启义，冯明光.实用统计分析及其计算机处理平台[M].北京：中国农业出版社，1997：135-139.
[8]孙广宇，宗兆锋.植物病理学实验技术[M].北京：中国农业出版社，2002.
[9]夏宝远，王林.我国水稻稻曲病的研究现状[J].畜牧与饲料科学，2009，30（1）：33-34.
[10]张君成，陈志谊，张炳欣，等.稻曲病菌的形态学观察研究[J].植物病理学报，2003，33（6）：517-523.