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摘 要：为解决木本切花植物帝萝花‘璀璨明珠’繁殖效率低的问题，该文以帝萝花‘璀璨明珠’的幼嫩枝芽为外植体，研究了不同基本培养基对其长势的影响、不同激素种类和浓度对其增殖和生根的效果，分析了其离体繁殖的生长特点，并建立了高效的帝萝花‘璀璨明珠’组培快繁技术体系。结果表明：帝萝花‘璀璨明珠’幼嫩枝芽的消毒方法为0.1%的升汞溶液浸泡12 min，污染率为21.5%;外植体在WPM+ZT 1 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1培养基上，侧芽萌发率为73%;增殖的最佳培养基为MS + BA 0.4 mg·L-1 + NAA 0.05 mg·L-1，增殖系数为6.63，增殖方式为侧芽增殖和植株基部丛生芽增殖; 生根的适宜培养基为MS + IBA 0.75 mg·L-1+ NAA 1 mg·L-1，生根率为70%;生根瓶苗移栽于珍珠岩和细草炭（体积比为0.5∶1）的基质中，光照强度为10 000～12 000 lx，空气湿度为70%～80%下培养，60 d后成活率可达72%。该研究结果为帝萝花组培种苗的商业化生产提供了技术支撑，同时促进了该高档木本切花的推广和种植及产业化。
关键词：帝萝花‘璀璨明珠’，木本切花，植株高效再生，组培快繁
中图分类号：Q943
文献标识码：A
文章编号：1000-3142（2021）09-1542-06
Abstract：In order to improve reproduction efficiency of woody cut-flower plant Telopea speciosissima ‘Braidwood Brilliant’，we used young branches and shoots as explants to reveal the growth characteristics of T. speciosissima ‘Braidwood Brilliant’in in vitro culture and to establish its efficiently regeneration system，by studying the influence of basic medium on plant growth，the effect of hormone type，concentration on proliferation and rooting. The results were as follows：Treating explants with the 0.1% HgCl2 for 12 min，the explants contaminate rate was 21.5%; The lateral buds germination rate of explants was 73% on medium WPM+ZT 1 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1; The optimal multiplication medium was MS + BA 0.4 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1with 6.63 proliferation coefficient，and the proliferating shoots originating from axillary bud and basic adventitious bud; MS + IBA 0.75 mg·L-1+ NAA 1 mg·L-1 was the suitable rooting medium，with 70% rooting rate; The rooting seedlings were transplanted in the substrates[perlite∶moss（v∶v）=0.5∶1] in the greenhouse with light intensity 10 000-12 000 lx，air humidity 70%-80%，and the survival rate of the seedlings was 72% 60 d later. The results provide technological support for commercial production of Telopea speciosissima tissue culture seedlings，and promoted the planting and industrialization of this famous woody cut-flower.
Key words：Telopea speciosissima ‘Braidwood Brilliant’，woody cut-flower，plant efficient regeneration，tissue culture speed propagation
帝萝花（Telopea speciosissima）是山龍眼科（Proteaceae）帝萝花属（Telopea）多年生名贵木本观赏植物，原产于澳大利亚和非洲热带地区，其花形独特、花色艳丽、花期较长，既可用作切花，又可应用于园林美化。虽然早在2001年，我国广州和云南等地就开始进行帝萝花等山龙眼科木本花卉的资源引进和适应性研究（蹇洪英等，2006;苏开君等，2008），但由于繁殖效率低，因此导致其产品主要依靠进口，在市场上仍然还是“一枝独秀”。
山龙眼科植物的种子种壳坚硬且具有休眠特性，发芽率低且不整齐（Wu & Toit，2010）。其扦插繁殖生根率低，所需时间长（黎霞等，2009）。在南非、澳大利亚等原产地，依靠丰富的母本资源，帝萝花主要通过扦插繁殖（Maclennan，1993），同时也有组织培养的相关研究。早在1989年，Wrigley & Fagg（1989）指出帝萝花种苗的组培生产之所以没有商业应用，是因为其组织培养难度太大。近年来，国内外对山龙眼科植物组织培养的研究仍然较少。Wu et al.（2007）进行帝王花合子胚和子叶培养，认为植物激素抑制体细胞胚的形成，在无植物激素的培养基上诱导出胚状体，并进行红、蓝光源影响其器官发生方式的研究（Wu & Dutoit，2012）。国内仅报道过何丽娜等（2012）以茎段为材料进行帝王花启动培养研究，而关于帝王花后续繁殖和生根等方面的研究国内外没有进一步报道。Offord et al.（1992）对11个帝萝花优株进行了组织培养研究，发现不同基因型间组织培养的效果不同，并指出帝萝花组织培养成功的关键在于针对不同基因型进行生长调节物质的优化。因此，对于目前还无组培繁殖研究报道的帝萝花‘璀璨明珠’，有必要进行植株高效再生的研究，以实现其组培种苗商业化生产。 帝萝花‘璀璨明珠’（Telopea speciosissima ‘Braidwood Brilliant’）在21世纪初被引种到昆明，花红色、鲜艳，适应性强，切花产量高，具有市场开发潜力（图版I：A）。本研究以帝萝花‘璀璨明珠’幼嫩枝芽为外植体，通过不同基本培养基对其长势的影响，不同激素种类和浓度对其增殖和生根的效果，以及瓶苗移栽驯化等关键环节的研究，揭示帝萝花‘璀璨明珠’离体繁殖的生长特点，建立高效的植株再生体系，为其组培种苗的商业化生产提供技术支撑，从而促进高档木本切花——帝萝花‘璀璨明珠’的推广、种植和产业化，同时为帝萝花属其他种的离体繁殖提供借鑒。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为帝萝花‘璀璨明珠’（以下简称‘璀璨明珠’）幼嫩枝芽，采自云南省农业科学院花卉研究所资源圃。
1.2 方法
1.2.1 外植体消毒和诱导培养 选取‘璀璨明珠’幼嫩枝条，去除叶片、保留叶柄，用洗衣粉水清洗表面污垢后，剪成长度约为2 cm的茎段，每个茎段具2个叶柄，流水冲洗20 min。先用0.1%的升汞溶液浸泡12 min，再用无菌水冲洗5遍。将已消毒茎段在超净工作台上晾干表面水分后，接种至外植体诱导培养基WPM+ZT 1 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。
1.2.2 基本培养基对‘璀璨明珠’长势的影响 将‘璀璨明珠’的增殖苗切分成单棵，接种在以WPM、1/2MS、MS为基本培养基的增殖培养基上，每种培养基均附加 ZT 0.5 mg·L-1和NAA 0.05 mg·L-1。每种基本培养基处理设置3个重复，每个重复接种10个芽苗。60 d后观察芽苗的长势，并测定SPAD值和株高（表1）。
1.2.3 激素种类和浓度对‘璀璨明珠’增殖的效果 将‘璀璨明珠’丛芽分棵切开，接种到不同增殖培养基，试验不同浓度ZT或6-BA组合0.05 mg·L-1的NAA对其增殖效果，激素组合见表2。根据1.2.2的试验结果选择基本培养基，每个激素浓度处理设3个重复，每个重复接种10个芽苗。60 d后统计其增殖系数及丛生芽高度等指标。
1.2.4 生根培养和瓶苗移栽 增殖培养60 d后，将株高2 cm左右的增殖苗分棵切开，接种到不同的生根培养基。根据1.2.2的试验结果选定基本培养基，并附加不同浓度的IBA、NAA和活性炭组合（表3）。每个生根处理设3个重复，每个重复接种15株，之后观察生根情况，40 d后统计生根率、株高和愈伤组织横径。
将生根苗带瓶移至大棚内，上方盖遮阳网，光照强度为10 000～12 000 lx，炼苗1周后，移栽至育苗盒，栽培基质配比为珍珠岩和细草炭（0～5 mm）体积比为0.5∶1。
1.2.5 培养条件 瓶苗培养条件为温度（23±2）℃、光照12 h·d-1，光照强度3 000 lx。培养基附加琼脂9 g·L-1、蔗糖30 g·L-1、pH5.8。
穴盘苗培养条件：刚移栽时，光照强度为8 000～10 000 lx，空气湿度为70%～80%，土壤只需保持表面潮湿即可，大约20 d发出新根后，可逐渐增大光照强度使之适应外部环境。
1.2.6 指标测定 SPAD值用SPAD-502型叶绿素计测定。选择每一增殖丛芽中最高一株，测量其植株中部最大一片叶片的SPAD值作为该丛芽的SPAD值，测量一重复中所有丛芽的SPAD值，并取其平均值作为该重复的SPAD值。
株高、丛生芽高度和愈伤组织横径用直尺测量。从培养基表面到生根植株顶部的距离为株高，从培养基表面到丛生芽顶部的距离为丛生芽高度，植株基部愈伤组织的最大直径为其横径，测量重复中每株的株高、丛生芽高度或横径，取其平均值作为该重复的株高、丛生芽高度或横径。
增殖系数为每一重复中长度大于2 cm的增殖芽数量与初始接种芽数的比值。
生根率为每一重复中生根的植株数与初始接种芽数的百分比。
1.2.7 数据处理与统计分析 所得数据使用SPSS 18.0软件进行分析，采用邓肯法在0.05水平上进行差异显著性检验。
2 结果与分析
2.1 基本培养基对‘璀璨明珠’生长的影响
‘璀璨明珠’茎干和枝叶表面光滑，采用1.2.1的方法进行外植体消毒和芽诱导，可达到较好效果，外植体污染率为21.5%，芽萌发率为73%，萌发的侧芽叶形、叶色正常。将叶柄处萌发的侧芽进一步转接到培养基WPM+ZT1 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1后，随着培养时间延长，植株首先从老叶开始失绿，然后变黄，最后整株变黄。
试验不同基本培养基对‘璀璨明珠’生长的影响，测定SPAD值和丛生芽高等指标统计如表1所示。芽苗接种到不同基本培养基后，随着培养时间延长，植株长势和叶色表现出差异，其中1/2MS和WPM培养基上的植株不同程度出现老叶失绿、变黄或叶色变浅的症状（图版I：C，D），而MS培养基中植株生长健壮且叶色浓绿（图版I：B）。SPAD值是一个反映植株叶绿素含量的指标，叶绿素的相对含量可以反映植株叶片的生理状况。卢晓萍等（2013）的研究表明，SPAD值与单位叶面积叶绿素含量显著相关。从表1可以看出，3种不同基本培养基处理下，SPAD值和丛生芽高2个指标均存在显著差异，MS培养基中植株叶片的SPAD值和丛生芽高显著高于其他2个处理，分别为32.57 cm和4.85 cm，指标差异趋势与形态学表现一致，MS培养基更适合‘璀璨明珠’生长。
2.2 不同细胞分裂素种类和浓度对‘璀璨明珠’增殖的影响
‘璀璨明珠’芽苗接种在MS基本培养基附加不同激素浓度组合的培养基上，增殖系数和丛生芽高均表现出差异。由表2可知，6-BA对‘璀璨明珠’的增殖效果好于ZT，6-BA各处理下芽苗的增殖系数都高于ZT处理。其中，激素组合6-BA 0.4 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1处理下增殖系数达6.63（图版I：B），显著高于其他6个处理。6-BA处理下，随着其浓度增加，可以观察到瓶内增殖的丛生芽和侧芽增多，但当6-BA浓度达到0.8 mg·L-1时，统计的增殖系数反而有一定程度降低。从株高来看，无论是6-BA还是ZT处理，株高随激素浓度增加而降低，且各浓度处理之间差异显著。‘璀璨明珠’离体芽苗的增殖方式主要为叶腋处侧芽增殖和基部的丛生芽增殖（图版I：E）。0.8～1.6 mg·L-1的6-BA处理下，芽苗基部增殖出大量饱满的不定芽，但受高浓度6-BA影响，不定芽紧缩，不能伸长生长（图版I：F），导致增殖出的有效苗数少，增殖系数低，整体株高低，从而影响后续植株的生根效率。可见，‘璀璨明珠’离体芽苗增殖对6-BA敏感，一旦浓度稍高就可抑制其增殖和生长。 2.3 生根培养与炼苗移栽
MS基本培养基附加不同浓度NAA、IBA和2 000 mg·L-1活性炭组合处理，对‘璀璨明珠’进行生根诱导。从3表可以看出，在相同NAA和IBA组合浓度下，‘璀璨明珠’生根率、株高、愈伤组织横径3个指标，在是否添加活性炭的处理间存在显著差异。各个添加活性炭的处理，生根率均为零，但株高和长势却显著好于不添加的处理。这说明2 000 mg·L-1活性炭不利于‘璀璨明珠’生根，但能促进其生长。从愈伤组织横径来看，除1号和2号处理之间无显著差异外，其余在同一生長素浓度下，不添加活性炭处理的愈伤组织横径均显著大于添加处理的。‘璀璨明珠’只有在一定浓度的生长素诱导下才能生根，生根率随生长素浓度增加而提高，且相同浓度IBA 0.8 mg·L-1和NAA 0.8 mg·L-1诱导的生根率无显著差异。其中，IBA 0.75 mg·L-1+ NAA 1 mg·L-1组合下生根率为70%，显著高于其他处理（图版I：G），株高较矮，为1.22 cm，而其愈伤组织横径较小，为0.54 cm，移栽时利于成活，故MS+ IBA 0.75 mg·L-1+ NAA 1 mg·L-1为‘璀璨明珠’适宜的生根培养基。
将生根苗带瓶移至大棚内炼苗1周后，移栽至珍珠岩和细草炭（0～5 mm）体积比为0.5∶1的栽培基质中。刚移栽时，光照强度为8 000～10 000 lx，空气湿度为70%～80%，土壤只需保持表面潮湿即可，约20 d发出新根后，可逐渐增大光照强度使之适应外部环境。60 d后，穴盘苗株高为7～9 cm（图版I：H，I），成活率为72%。
3 讨论与结论
诱导培养阶段，‘璀璨明珠’外植体侧芽的萌发率、侧芽叶形和叶色正常，可满足后续培养需求。在相同培养基中，进一步增殖培养会出现叶片失绿、变黄，到最后整株出现变黄的症状。分析原因主要是诱导阶段，侧芽萌发消耗外植体茎段和芽体自身的营养物质，脱离母体进入增殖阶段后，其生长需营养支持，在不适合的培养基上便出现生长异常现象，说明本研究所用的诱导培养基还可进一步优化。
MS是组织培养中应用较为广泛的一种培养基，属于富集元素平衡培养基;WPM培养基是木本植物组织培养常用的培养基，属于中盐低氮培养基（吉训志等，2019）。‘璀璨明珠’增殖苗在中氮培养基1/2MS和低氮培养基WPM上长势弱，且叶片不同程度黄化;测定SPAD值后，SPAD值低于MS培养基中增殖苗的。闫平等（2019）认为随着施肥量的增加，2个超级稻品种叶片SPAD值呈逐步增加的趋势。蔡艳飞等（2014）研究发现，在不同氮水平下，SPAD值及相对叶色差与单位干重的总氮含量具有显著线性正相关关系，SPAD值的变化能够反映60%的单位干重叶氮含量的变化，可以利用SPAD-502型叶绿素计对高山杜鹃进行快速、无损的氮素营养诊断。本研究中，不同氮素水平下，‘璀璨明珠’增殖苗长势和叶片SPAD值的变化趋势与前人研究一致。‘璀璨明珠’虽然是木本植物，但其对基本培养基中的氮素和盐分有一定需求。
活性炭是植物组织培养中生根环节常用的添加物，适于生根的浓度为0.1%～0.5%（孙占育等，2010）。韩文璞等（2001）在甜樱桃组织培养中，在生根培养基中加入1 000 mg·L-1的活性炭，生根率达100%，根系发达、洁白，移栽成活率高。王献革等（2003）在黄金梨的生根培养基中加入500 mg·L-1的生根效果好，生根率在80%以上。孙占育等（2010）认为，在植物生根的培养基中，加入一定浓度的活性炭有利于诱导生根，但如果活性炭浓度过高，则抑制其生根。本研究中，生根培养基添加2 000 m g·L-1活性炭处理，出现植株不生根而长势健壮的情况。究其原因是活性炭浓度不合适而导致的不生根问题还是活性炭本身不适宜用于‘璀璨明珠’生根，这还有待进行活性炭多浓度梯度对生根影响的研究。
参考文献：
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（责任编辑 蒋巧媛）
关键词：帝萝花‘璀璨明珠’，木本切花，植株高效再生，组培快繁
中图分类号：Q943
文献标识码：A
文章编号：1000-3142（2021）09-1542-06
Abstract：In order to improve reproduction efficiency of woody cut-flower plant Telopea speciosissima ‘Braidwood Brilliant’，we used young branches and shoots as explants to reveal the growth characteristics of T. speciosissima ‘Braidwood Brilliant’in in vitro culture and to establish its efficiently regeneration system，by studying the influence of basic medium on plant growth，the effect of hormone type，concentration on proliferation and rooting. The results were as follows：Treating explants with the 0.1% HgCl2 for 12 min，the explants contaminate rate was 21.5%; The lateral buds germination rate of explants was 73% on medium WPM+ZT 1 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1; The optimal multiplication medium was MS + BA 0.4 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1with 6.63 proliferation coefficient，and the proliferating shoots originating from axillary bud and basic adventitious bud; MS + IBA 0.75 mg·L-1+ NAA 1 mg·L-1 was the suitable rooting medium，with 70% rooting rate; The rooting seedlings were transplanted in the substrates[perlite∶moss（v∶v）=0.5∶1] in the greenhouse with light intensity 10 000-12 000 lx，air humidity 70%-80%，and the survival rate of the seedlings was 72% 60 d later. The results provide technological support for commercial production of Telopea speciosissima tissue culture seedlings，and promoted the planting and industrialization of this famous woody cut-flower.
Key words：Telopea speciosissima ‘Braidwood Brilliant’，woody cut-flower，plant efficient regeneration，tissue culture speed propagation
帝萝花（Telopea speciosissima）是山龍眼科（Proteaceae）帝萝花属（Telopea）多年生名贵木本观赏植物，原产于澳大利亚和非洲热带地区，其花形独特、花色艳丽、花期较长，既可用作切花，又可应用于园林美化。虽然早在2001年，我国广州和云南等地就开始进行帝萝花等山龙眼科木本花卉的资源引进和适应性研究（蹇洪英等，2006;苏开君等，2008），但由于繁殖效率低，因此导致其产品主要依靠进口，在市场上仍然还是“一枝独秀”。
山龙眼科植物的种子种壳坚硬且具有休眠特性，发芽率低且不整齐（Wu & Toit，2010）。其扦插繁殖生根率低，所需时间长（黎霞等，2009）。在南非、澳大利亚等原产地，依靠丰富的母本资源，帝萝花主要通过扦插繁殖（Maclennan，1993），同时也有组织培养的相关研究。早在1989年，Wrigley & Fagg（1989）指出帝萝花种苗的组培生产之所以没有商业应用，是因为其组织培养难度太大。近年来，国内外对山龙眼科植物组织培养的研究仍然较少。Wu et al.（2007）进行帝王花合子胚和子叶培养，认为植物激素抑制体细胞胚的形成，在无植物激素的培养基上诱导出胚状体，并进行红、蓝光源影响其器官发生方式的研究（Wu & Dutoit，2012）。国内仅报道过何丽娜等（2012）以茎段为材料进行帝王花启动培养研究，而关于帝王花后续繁殖和生根等方面的研究国内外没有进一步报道。Offord et al.（1992）对11个帝萝花优株进行了组织培养研究，发现不同基因型间组织培养的效果不同，并指出帝萝花组织培养成功的关键在于针对不同基因型进行生长调节物质的优化。因此，对于目前还无组培繁殖研究报道的帝萝花‘璀璨明珠’，有必要进行植株高效再生的研究，以实现其组培种苗商业化生产。 帝萝花‘璀璨明珠’（Telopea speciosissima ‘Braidwood Brilliant’）在21世纪初被引种到昆明，花红色、鲜艳，适应性强，切花产量高，具有市场开发潜力（图版I：A）。本研究以帝萝花‘璀璨明珠’幼嫩枝芽为外植体，通过不同基本培养基对其长势的影响，不同激素种类和浓度对其增殖和生根的效果，以及瓶苗移栽驯化等关键环节的研究，揭示帝萝花‘璀璨明珠’离体繁殖的生长特点，建立高效的植株再生体系，为其组培种苗的商业化生产提供技术支撑，从而促进高档木本切花——帝萝花‘璀璨明珠’的推广、种植和产业化，同时为帝萝花属其他种的离体繁殖提供借鑒。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为帝萝花‘璀璨明珠’（以下简称‘璀璨明珠’）幼嫩枝芽，采自云南省农业科学院花卉研究所资源圃。
1.2 方法
1.2.1 外植体消毒和诱导培养 选取‘璀璨明珠’幼嫩枝条，去除叶片、保留叶柄，用洗衣粉水清洗表面污垢后，剪成长度约为2 cm的茎段，每个茎段具2个叶柄，流水冲洗20 min。先用0.1%的升汞溶液浸泡12 min，再用无菌水冲洗5遍。将已消毒茎段在超净工作台上晾干表面水分后，接种至外植体诱导培养基WPM+ZT 1 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。
1.2.2 基本培养基对‘璀璨明珠’长势的影响 将‘璀璨明珠’的增殖苗切分成单棵，接种在以WPM、1/2MS、MS为基本培养基的增殖培养基上，每种培养基均附加 ZT 0.5 mg·L-1和NAA 0.05 mg·L-1。每种基本培养基处理设置3个重复，每个重复接种10个芽苗。60 d后观察芽苗的长势，并测定SPAD值和株高（表1）。
1.2.3 激素种类和浓度对‘璀璨明珠’增殖的效果 将‘璀璨明珠’丛芽分棵切开，接种到不同增殖培养基，试验不同浓度ZT或6-BA组合0.05 mg·L-1的NAA对其增殖效果，激素组合见表2。根据1.2.2的试验结果选择基本培养基，每个激素浓度处理设3个重复，每个重复接种10个芽苗。60 d后统计其增殖系数及丛生芽高度等指标。
1.2.4 生根培养和瓶苗移栽 增殖培养60 d后，将株高2 cm左右的增殖苗分棵切开，接种到不同的生根培养基。根据1.2.2的试验结果选定基本培养基，并附加不同浓度的IBA、NAA和活性炭组合（表3）。每个生根处理设3个重复，每个重复接种15株，之后观察生根情况，40 d后统计生根率、株高和愈伤组织横径。
将生根苗带瓶移至大棚内，上方盖遮阳网，光照强度为10 000～12 000 lx，炼苗1周后，移栽至育苗盒，栽培基质配比为珍珠岩和细草炭（0～5 mm）体积比为0.5∶1。
1.2.5 培养条件 瓶苗培养条件为温度（23±2）℃、光照12 h·d-1，光照强度3 000 lx。培养基附加琼脂9 g·L-1、蔗糖30 g·L-1、pH5.8。
穴盘苗培养条件：刚移栽时，光照强度为8 000～10 000 lx，空气湿度为70%～80%，土壤只需保持表面潮湿即可，大约20 d发出新根后，可逐渐增大光照强度使之适应外部环境。
1.2.6 指标测定 SPAD值用SPAD-502型叶绿素计测定。选择每一增殖丛芽中最高一株，测量其植株中部最大一片叶片的SPAD值作为该丛芽的SPAD值，测量一重复中所有丛芽的SPAD值，并取其平均值作为该重复的SPAD值。
株高、丛生芽高度和愈伤组织横径用直尺测量。从培养基表面到生根植株顶部的距离为株高，从培养基表面到丛生芽顶部的距离为丛生芽高度，植株基部愈伤组织的最大直径为其横径，测量重复中每株的株高、丛生芽高度或横径，取其平均值作为该重复的株高、丛生芽高度或横径。
增殖系数为每一重复中长度大于2 cm的增殖芽数量与初始接种芽数的比值。
生根率为每一重复中生根的植株数与初始接种芽数的百分比。
1.2.7 数据处理与统计分析 所得数据使用SPSS 18.0软件进行分析，采用邓肯法在0.05水平上进行差异显著性检验。
2 结果与分析
2.1 基本培养基对‘璀璨明珠’生长的影响
‘璀璨明珠’茎干和枝叶表面光滑，采用1.2.1的方法进行外植体消毒和芽诱导，可达到较好效果，外植体污染率为21.5%，芽萌发率为73%，萌发的侧芽叶形、叶色正常。将叶柄处萌发的侧芽进一步转接到培养基WPM+ZT1 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1后，随着培养时间延长，植株首先从老叶开始失绿，然后变黄，最后整株变黄。
试验不同基本培养基对‘璀璨明珠’生长的影响，测定SPAD值和丛生芽高等指标统计如表1所示。芽苗接种到不同基本培养基后，随着培养时间延长，植株长势和叶色表现出差异，其中1/2MS和WPM培养基上的植株不同程度出现老叶失绿、变黄或叶色变浅的症状（图版I：C，D），而MS培养基中植株生长健壮且叶色浓绿（图版I：B）。SPAD值是一个反映植株叶绿素含量的指标，叶绿素的相对含量可以反映植株叶片的生理状况。卢晓萍等（2013）的研究表明，SPAD值与单位叶面积叶绿素含量显著相关。从表1可以看出，3种不同基本培养基处理下，SPAD值和丛生芽高2个指标均存在显著差异，MS培养基中植株叶片的SPAD值和丛生芽高显著高于其他2个处理，分别为32.57 cm和4.85 cm，指标差异趋势与形态学表现一致，MS培养基更适合‘璀璨明珠’生长。
2.2 不同细胞分裂素种类和浓度对‘璀璨明珠’增殖的影响
‘璀璨明珠’芽苗接种在MS基本培养基附加不同激素浓度组合的培养基上，增殖系数和丛生芽高均表现出差异。由表2可知，6-BA对‘璀璨明珠’的增殖效果好于ZT，6-BA各处理下芽苗的增殖系数都高于ZT处理。其中，激素组合6-BA 0.4 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1处理下增殖系数达6.63（图版I：B），显著高于其他6个处理。6-BA处理下，随着其浓度增加，可以观察到瓶内增殖的丛生芽和侧芽增多，但当6-BA浓度达到0.8 mg·L-1时，统计的增殖系数反而有一定程度降低。从株高来看，无论是6-BA还是ZT处理，株高随激素浓度增加而降低，且各浓度处理之间差异显著。‘璀璨明珠’离体芽苗的增殖方式主要为叶腋处侧芽增殖和基部的丛生芽增殖（图版I：E）。0.8～1.6 mg·L-1的6-BA处理下，芽苗基部增殖出大量饱满的不定芽，但受高浓度6-BA影响，不定芽紧缩，不能伸长生长（图版I：F），导致增殖出的有效苗数少，增殖系数低，整体株高低，从而影响后续植株的生根效率。可见，‘璀璨明珠’离体芽苗增殖对6-BA敏感，一旦浓度稍高就可抑制其增殖和生长。 2.3 生根培养与炼苗移栽
MS基本培养基附加不同浓度NAA、IBA和2 000 mg·L-1活性炭组合处理，对‘璀璨明珠’进行生根诱导。从3表可以看出，在相同NAA和IBA组合浓度下，‘璀璨明珠’生根率、株高、愈伤组织横径3个指标，在是否添加活性炭的处理间存在显著差异。各个添加活性炭的处理，生根率均为零，但株高和长势却显著好于不添加的处理。这说明2 000 mg·L-1活性炭不利于‘璀璨明珠’生根，但能促进其生长。从愈伤组织横径来看，除1号和2号处理之间无显著差异外，其余在同一生長素浓度下，不添加活性炭处理的愈伤组织横径均显著大于添加处理的。‘璀璨明珠’只有在一定浓度的生长素诱导下才能生根，生根率随生长素浓度增加而提高，且相同浓度IBA 0.8 mg·L-1和NAA 0.8 mg·L-1诱导的生根率无显著差异。其中，IBA 0.75 mg·L-1+ NAA 1 mg·L-1组合下生根率为70%，显著高于其他处理（图版I：G），株高较矮，为1.22 cm，而其愈伤组织横径较小，为0.54 cm，移栽时利于成活，故MS+ IBA 0.75 mg·L-1+ NAA 1 mg·L-1为‘璀璨明珠’适宜的生根培养基。
将生根苗带瓶移至大棚内炼苗1周后，移栽至珍珠岩和细草炭（0～5 mm）体积比为0.5∶1的栽培基质中。刚移栽时，光照强度为8 000～10 000 lx，空气湿度为70%～80%，土壤只需保持表面潮湿即可，约20 d发出新根后，可逐渐增大光照强度使之适应外部环境。60 d后，穴盘苗株高为7～9 cm（图版I：H，I），成活率为72%。
3 讨论与结论
诱导培养阶段，‘璀璨明珠’外植体侧芽的萌发率、侧芽叶形和叶色正常，可满足后续培养需求。在相同培养基中，进一步增殖培养会出现叶片失绿、变黄，到最后整株出现变黄的症状。分析原因主要是诱导阶段，侧芽萌发消耗外植体茎段和芽体自身的营养物质，脱离母体进入增殖阶段后，其生长需营养支持，在不适合的培养基上便出现生长异常现象，说明本研究所用的诱导培养基还可进一步优化。
MS是组织培养中应用较为广泛的一种培养基，属于富集元素平衡培养基;WPM培养基是木本植物组织培养常用的培养基，属于中盐低氮培养基（吉训志等，2019）。‘璀璨明珠’增殖苗在中氮培养基1/2MS和低氮培养基WPM上长势弱，且叶片不同程度黄化;测定SPAD值后，SPAD值低于MS培养基中增殖苗的。闫平等（2019）认为随着施肥量的增加，2个超级稻品种叶片SPAD值呈逐步增加的趋势。蔡艳飞等（2014）研究发现，在不同氮水平下，SPAD值及相对叶色差与单位干重的总氮含量具有显著线性正相关关系，SPAD值的变化能够反映60%的单位干重叶氮含量的变化，可以利用SPAD-502型叶绿素计对高山杜鹃进行快速、无损的氮素营养诊断。本研究中，不同氮素水平下，‘璀璨明珠’增殖苗长势和叶片SPAD值的变化趋势与前人研究一致。‘璀璨明珠’虽然是木本植物，但其对基本培养基中的氮素和盐分有一定需求。
活性炭是植物组织培养中生根环节常用的添加物，适于生根的浓度为0.1%～0.5%（孙占育等，2010）。韩文璞等（2001）在甜樱桃组织培养中，在生根培养基中加入1 000 mg·L-1的活性炭，生根率达100%，根系发达、洁白，移栽成活率高。王献革等（2003）在黄金梨的生根培养基中加入500 mg·L-1的生根效果好，生根率在80%以上。孙占育等（2010）认为，在植物生根的培养基中，加入一定浓度的活性炭有利于诱导生根，但如果活性炭浓度过高，则抑制其生根。本研究中，生根培养基添加2 000 m g·L-1活性炭处理，出现植株不生根而长势健壮的情况。究其原因是活性炭浓度不合适而导致的不生根问题还是活性炭本身不适宜用于‘璀璨明珠’生根，这还有待进行活性炭多浓度梯度对生根影响的研究。
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（责任编辑 蒋巧媛）