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摘要：RNA干扰（RNA interference， RNAi）是指将双链RNA（double stranded RNA， dsRNA）分子导入细胞内后，能够催化降解同源靶基因的mRNA，从而抑制目的基因的表达。目前RNAi技术作为一种有效的基因沉默工具，已被广泛应用于基因功能分析及肿瘤治疗等研究领域。
关键词：肺癌；RNA干扰；dsRNA；基因沉默
肺癌是癌症相关死亡的最主要原因，严重威胁人类的健康和生命。目前虽然肺癌采用了手术、化疗和分子靶向药物等多种治疗措施，但肺癌患者5年生存率只有16.6%，仍是预后最差的肿瘤之一，因此迫切需要寻求新的有效的治疗措施。RNAi技术因其自身拥有的独特优势，在肺癌的基因治疗研究中将发挥极其重要作用。本文旨在对RNAi技术在肺癌治疗研究中的应用进行综述。
1 RNAi的分子机制
RNAi是一种序列特异性转录后基因沉默现象。目前公认的RNAi的分子机制分为三个阶段：a.起始阶段：dsRNA在体内被RNase Ⅲ样的特异性核酸内切酶（Dicer）识别并切割成21-23nt的短链RNA （siRNA ）；b.效应阶段：siRNA与一系列特异性蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合物（RISC），在ATP参与下，RISC识别同源性的靶mRNA并将其降解。c.扩增阶段：在RISC切割靶mRNA的同时，以siRNA为引物在RNA依赖的RNA聚合酶作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA，它在Dicer酶的作用下被降解形成新的siRNA，引发级联放大效应，高效抑制靶基因表达[1]。
2 RNAi在肺癌治疗中的研究应用
2.1 RNAi用于信号转导通路的研究
胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）是一种跨膜的受体酪氨酸激酶，其信号通路与肿瘤细胞的发生、发展、转移密切相关。肿瘤过表达的IGF-1R通过启动PI3K/AKT及Ras/MAPK信号通路，调节下游BAD、mTOR和c-myc等蛋白失活或激活，从而阻断凋亡途径的信号传递[2]。DU等[3]利用RNAi技术构建的重组慢病毒感染肺癌A549细胞，有效抑制IGF-1R基因表达，更有趣的是，沉默IGF-1R能显著诱导肺癌细胞Fas/FasL凋亡途径缺陷修复，促进癌细胞凋亡。以上研究提示从信号转导途径中所涉及的生物靶标的作用去寻找新型抗肿瘤靶点是一个很好的方向。
2.2 RNAi用于细胞周期调控的研究
几乎所有的癌基因和抑癌基因都直接或间接地作用于细胞周期，它们的突变引起细胞周期调控障碍，从而导致癌细胞过度增殖、凋亡减少。曹等[4]通过RNAi定向敲除肺癌细胞的COPS3基因，可上调p21蛋白表达，下调CDK4和cyclinB1蛋白表达，使细胞周期阻滞于G0/G1期，抑制肿瘤生长。Cyclin Y（CCNY）是近年来新发现的一种细胞周期蛋白，在肿瘤增殖调控中发挥重要的功能。RNAi沉默CCNY基因的表达，肺癌细胞阻滞于G1/S期，显著抑制肺癌细胞的生长[5]。因此，以细胞周期作为抗癌治疗靶点，应该是很有前途的。
2.3 RNAi用于肺癌侵袭与转移的研究
侵袭和转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征之一，也是导致肺癌患者死亡的主要原因。蛋白酶活化受体1（PAR1）是参与肺癌侵袭转移的重要信号分子，利用RNAi沉默PAR1基因能显著抑制肺癌A549细胞的生长和侵袭能力[6]。基因敲低caspase-8蛋白的表达， 使肺癌A549细胞侵袭力和转移能力的下降[7]。上述研究提示，应用RNAi技术对肺癌侵袭与转移相关基因的研究，能够为肺癌治疗提供重要的理论依据和方法。
2.4 RNAi用于肿瘤血管生成的研究
血管生成在肺癌的生长和转移过程中起着重要的作用。血管内皮生长因子（VEGF）是肿瘤血管生成的中心调控因子，张等[8]将VEGF siRNA转染到肺癌细胞和血管内皮细胞中，有效抑制了VEGF表达，破坏血管内皮细胞的网状结构，并明显抑制了荷瘤鼠模型中肿瘤的生长。此外，血小板源生长因子（PDGF）也是一个至关重要的血管生成因子，并在人类肺癌中显著表达。Hou等[9]研究证實沉默PDGF-CC基因能通过抑制GSK3β第9位丝氨酸磷酸化发挥抗血管生成作用。由上可知，阻断血管生成可以抑制肺癌的生长，通过RNAi抑制肿瘤血管生成的相关因子，很可能是肺癌治疗的重要方法之一。
2.5 RNAi用于提高肺癌对化疗及放疗的敏感性的研究
肿瘤化疗和放疗失败的主要原因是肿瘤细胞容易产生耐药性。多药耐药（multi-drug resistance， MDR）是恶性肿瘤细胞免受化疗药物攻击的最重要的细胞防御机制，是肿瘤化疗失败的关键因素。多药耐药相关蛋白-1（MRP1）过表达是MDR的重要表型之一。Wu等[10]在针对肺鳞癌MRP1基因的siRNA研究中发现，抑制MRP1表达可增加癌细胞对表柔比星的敏感性。DU等[3]利用shRNA重组慢病毒感染A549细胞，能显著增强癌细胞对紫杉醇的敏感性。候等[11]研究发现，针对chk-1的RNAi可以提高Lewis肺癌细胞的抑制率及放疗引起的肿瘤细胞的凋亡，与放疗有协同作用。化疗和放疗在肺癌的治疗中是除手术以外最重要的治疗方法，应用RNAi技术辅助化疗和放疗具有广阔的应用前景。
3结语和展望
RNAi在癌症治疗研究中已经取得了一些的进展，但还有很多问题需要解决： 如何选择特异的高效作用靶点；如何增强siRNA在细胞中的稳定性；如何保证siRNA的体内安全性等等[12]。最近有研究报道，利用新型纳米材料（如纳米脂质体/共聚物、各种无机纳米材料等）作为siRNA和药物载运系统对肿瘤的研究中，纳米材料负载的siRNA和药物，表现出转染效率高，生物相容性好，可维持长时间基因沉默等优势，在肿瘤治疗研究中极具应用前景。因此，随着RNAi技术的不断完善，RNAi技术必将会为人类疾病的治疗和预防作出巨大的贡献。 参考文献：
[1] Mcister G， Tuschl T.Mechanisms of silencing by double-stranded RNA[J].Nature. 2004，431（7006）：343-349.
[2] Brahmkhatri VP， Prasanna C， Atreya HS. Insulin-Like Growth Factor System in Cancer： Novel Targeted Therapies[J].Biomed Res Int.2015，2015：538019.
[3] 杜永亮，赵杰，贾晓民等.RNA干扰沉默IGF1R表达对A549细胞凋亡及化疗敏感性的观察[J].中华肿瘤防治杂志.2013， 20（11）：835-839.
[4] 曹鹤，李薇，钱磊等.RNA干扰COPS3基因对肺癌细胞A549增殖的抑制作用及其机制[J].吉林大学学报.2014，40（2）：238-242.
[5] Yue W， Zhao X， Zhang L et al.Cell cycle protein cyclin Y is associated with human non-small cell lung cancer proliferation and tumorigenesis[J].Clin Lung Cancer.2011，12（1）：43-50.
[6] Wu Z， Zeng Y， Zhong M， et al.Targeting A549 lung adenocarcinoma cell growth and invasion with protease-activated receptor 1 siRNA[J].Mol Med Rep.2014，9（5）：1787-93.
[7] 杜宁，孙向飞，胡丽娟等.Caspase-8在非小细胞肺癌中的表达及其在肺癌A549细胞侵袭转移中作用[J].细胞与分子免疫学杂.2012，28 （6）：572-579.
[8] 张泳，谷仲平，周勇安等.RNA沉默VEGF的表达及其治疗肺癌的初步研究[J].细胞与分子免疫学杂志.2009.25（4）：341-343， 347.
[9] Hou X， Kumar A， Lee C， et al.PDGF-CC blockade inhibits pathological angiogenesis by acting on multiple cellular and molecular targets[J].Proc Natl Acad Sci USA， 2010，107（27）：12216-12221.
[10] Wu Z， Li X， Zeng Y， et al.In vitro and in vivo inhibition of MRP gene expression and reversal of multidrug resistance by siRNA.[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol，2011，108（3）：177-184.
[11] 侯吉光，張奇，王红勇等. RNAi-chk1在抑制小鼠Lewis肺癌细胞生长作用的实验研究[J]. 中国实验诊断学，2012，16（9）：1583-1585.
[12] Crotty S， Pipkin ME.In vivo RNAi screens： concepts and applications[J].Trends Immunol. 2015，36（5）：315-322.
基金项目：广东省科技计划项目（编号：2011B08071039）广东医学院留学归国科研资助项目（编号：XH-1004）
关键词：肺癌；RNA干扰；dsRNA；基因沉默
肺癌是癌症相关死亡的最主要原因，严重威胁人类的健康和生命。目前虽然肺癌采用了手术、化疗和分子靶向药物等多种治疗措施，但肺癌患者5年生存率只有16.6%，仍是预后最差的肿瘤之一，因此迫切需要寻求新的有效的治疗措施。RNAi技术因其自身拥有的独特优势，在肺癌的基因治疗研究中将发挥极其重要作用。本文旨在对RNAi技术在肺癌治疗研究中的应用进行综述。
1 RNAi的分子机制
RNAi是一种序列特异性转录后基因沉默现象。目前公认的RNAi的分子机制分为三个阶段：a.起始阶段：dsRNA在体内被RNase Ⅲ样的特异性核酸内切酶（Dicer）识别并切割成21-23nt的短链RNA （siRNA ）；b.效应阶段：siRNA与一系列特异性蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合物（RISC），在ATP参与下，RISC识别同源性的靶mRNA并将其降解。c.扩增阶段：在RISC切割靶mRNA的同时，以siRNA为引物在RNA依赖的RNA聚合酶作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA，它在Dicer酶的作用下被降解形成新的siRNA，引发级联放大效应，高效抑制靶基因表达[1]。
2 RNAi在肺癌治疗中的研究应用
2.1 RNAi用于信号转导通路的研究
胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）是一种跨膜的受体酪氨酸激酶，其信号通路与肿瘤细胞的发生、发展、转移密切相关。肿瘤过表达的IGF-1R通过启动PI3K/AKT及Ras/MAPK信号通路，调节下游BAD、mTOR和c-myc等蛋白失活或激活，从而阻断凋亡途径的信号传递[2]。DU等[3]利用RNAi技术构建的重组慢病毒感染肺癌A549细胞，有效抑制IGF-1R基因表达，更有趣的是，沉默IGF-1R能显著诱导肺癌细胞Fas/FasL凋亡途径缺陷修复，促进癌细胞凋亡。以上研究提示从信号转导途径中所涉及的生物靶标的作用去寻找新型抗肿瘤靶点是一个很好的方向。
2.2 RNAi用于细胞周期调控的研究
几乎所有的癌基因和抑癌基因都直接或间接地作用于细胞周期，它们的突变引起细胞周期调控障碍，从而导致癌细胞过度增殖、凋亡减少。曹等[4]通过RNAi定向敲除肺癌细胞的COPS3基因，可上调p21蛋白表达，下调CDK4和cyclinB1蛋白表达，使细胞周期阻滞于G0/G1期，抑制肿瘤生长。Cyclin Y（CCNY）是近年来新发现的一种细胞周期蛋白，在肿瘤增殖调控中发挥重要的功能。RNAi沉默CCNY基因的表达，肺癌细胞阻滞于G1/S期，显著抑制肺癌细胞的生长[5]。因此，以细胞周期作为抗癌治疗靶点，应该是很有前途的。
2.3 RNAi用于肺癌侵袭与转移的研究
侵袭和转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征之一，也是导致肺癌患者死亡的主要原因。蛋白酶活化受体1（PAR1）是参与肺癌侵袭转移的重要信号分子，利用RNAi沉默PAR1基因能显著抑制肺癌A549细胞的生长和侵袭能力[6]。基因敲低caspase-8蛋白的表达， 使肺癌A549细胞侵袭力和转移能力的下降[7]。上述研究提示，应用RNAi技术对肺癌侵袭与转移相关基因的研究，能够为肺癌治疗提供重要的理论依据和方法。
2.4 RNAi用于肿瘤血管生成的研究
血管生成在肺癌的生长和转移过程中起着重要的作用。血管内皮生长因子（VEGF）是肿瘤血管生成的中心调控因子，张等[8]将VEGF siRNA转染到肺癌细胞和血管内皮细胞中，有效抑制了VEGF表达，破坏血管内皮细胞的网状结构，并明显抑制了荷瘤鼠模型中肿瘤的生长。此外，血小板源生长因子（PDGF）也是一个至关重要的血管生成因子，并在人类肺癌中显著表达。Hou等[9]研究证實沉默PDGF-CC基因能通过抑制GSK3β第9位丝氨酸磷酸化发挥抗血管生成作用。由上可知，阻断血管生成可以抑制肺癌的生长，通过RNAi抑制肿瘤血管生成的相关因子，很可能是肺癌治疗的重要方法之一。
2.5 RNAi用于提高肺癌对化疗及放疗的敏感性的研究
肿瘤化疗和放疗失败的主要原因是肿瘤细胞容易产生耐药性。多药耐药（multi-drug resistance， MDR）是恶性肿瘤细胞免受化疗药物攻击的最重要的细胞防御机制，是肿瘤化疗失败的关键因素。多药耐药相关蛋白-1（MRP1）过表达是MDR的重要表型之一。Wu等[10]在针对肺鳞癌MRP1基因的siRNA研究中发现，抑制MRP1表达可增加癌细胞对表柔比星的敏感性。DU等[3]利用shRNA重组慢病毒感染A549细胞，能显著增强癌细胞对紫杉醇的敏感性。候等[11]研究发现，针对chk-1的RNAi可以提高Lewis肺癌细胞的抑制率及放疗引起的肿瘤细胞的凋亡，与放疗有协同作用。化疗和放疗在肺癌的治疗中是除手术以外最重要的治疗方法，应用RNAi技术辅助化疗和放疗具有广阔的应用前景。
3结语和展望
RNAi在癌症治疗研究中已经取得了一些的进展，但还有很多问题需要解决： 如何选择特异的高效作用靶点；如何增强siRNA在细胞中的稳定性；如何保证siRNA的体内安全性等等[12]。最近有研究报道，利用新型纳米材料（如纳米脂质体/共聚物、各种无机纳米材料等）作为siRNA和药物载运系统对肿瘤的研究中，纳米材料负载的siRNA和药物，表现出转染效率高，生物相容性好，可维持长时间基因沉默等优势，在肿瘤治疗研究中极具应用前景。因此，随着RNAi技术的不断完善，RNAi技术必将会为人类疾病的治疗和预防作出巨大的贡献。 参考文献：
[1] Mcister G， Tuschl T.Mechanisms of silencing by double-stranded RNA[J].Nature. 2004，431（7006）：343-349.
[2] Brahmkhatri VP， Prasanna C， Atreya HS. Insulin-Like Growth Factor System in Cancer： Novel Targeted Therapies[J].Biomed Res Int.2015，2015：538019.
[3] 杜永亮，赵杰，贾晓民等.RNA干扰沉默IGF1R表达对A549细胞凋亡及化疗敏感性的观察[J].中华肿瘤防治杂志.2013， 20（11）：835-839.
[4] 曹鹤，李薇，钱磊等.RNA干扰COPS3基因对肺癌细胞A549增殖的抑制作用及其机制[J].吉林大学学报.2014，40（2）：238-242.
[5] Yue W， Zhao X， Zhang L et al.Cell cycle protein cyclin Y is associated with human non-small cell lung cancer proliferation and tumorigenesis[J].Clin Lung Cancer.2011，12（1）：43-50.
[6] Wu Z， Zeng Y， Zhong M， et al.Targeting A549 lung adenocarcinoma cell growth and invasion with protease-activated receptor 1 siRNA[J].Mol Med Rep.2014，9（5）：1787-93.
[7] 杜宁，孙向飞，胡丽娟等.Caspase-8在非小细胞肺癌中的表达及其在肺癌A549细胞侵袭转移中作用[J].细胞与分子免疫学杂.2012，28 （6）：572-579.
[8] 张泳，谷仲平，周勇安等.RNA沉默VEGF的表达及其治疗肺癌的初步研究[J].细胞与分子免疫学杂志.2009.25（4）：341-343， 347.
[9] Hou X， Kumar A， Lee C， et al.PDGF-CC blockade inhibits pathological angiogenesis by acting on multiple cellular and molecular targets[J].Proc Natl Acad Sci USA， 2010，107（27）：12216-12221.
[10] Wu Z， Li X， Zeng Y， et al.In vitro and in vivo inhibition of MRP gene expression and reversal of multidrug resistance by siRNA.[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol，2011，108（3）：177-184.
[11] 侯吉光，張奇，王红勇等. RNAi-chk1在抑制小鼠Lewis肺癌细胞生长作用的实验研究[J]. 中国实验诊断学，2012，16（9）：1583-1585.
[12] Crotty S， Pipkin ME.In vivo RNAi screens： concepts and applications[J].Trends Immunol. 2015，36（5）：315-322.
基金项目：广东省科技计划项目（编号：2011B08071039）广东医学院留学归国科研资助项目（编号：XH-1004）