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摘要：目的：研究分析大环内酯类抗生素诱导肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）的耐药机制。方法：对临床收集的300份咽拭子标本进行MP的分离培养；应用药敏试验对MP分离株进行测定并筛选出大环内酯类抗生素的MIC耐药株；应用PCR扩增仪对MP特异性16S核蛋白RNA（16SrRNA）基因进行扩增与分子鉴定；以红霉素为例，设计PCR扩增作用其靶位23S核蛋白RNA（23SrRNA）基因，并对扩增产物进行全自动的DNA测序，将所测序列与NCBI中已登录的MP标准株M129的23SrRNA进行对比。结果：300份咽拭子标本共分离出40株MP，其中包括耐药株37株，敏感株3株。耐药菌株的阿奇霉素、红霉素、交沙霉素的MIC值均有所升高。3株敏感株以及MP国际标准株的FH 23SrRNA序列与已知基因库MP序列相同，其余37株耐药株的23SrRNA均发生基因点突变，其中31株的突变位点位于V区的中心环2063位，29株发生了碱基A—G的突变，2株发生了碱基A—C的突变；其余6株的突变位点位于中心环2064位（A—G）。结论：大环内酯类抗生素诱导MP的耐药机制主要为23SrRNA靶基因的碱基点突变，以2063位突变为主导，此基因突变点的MP对阿奇霉素、红霉素、交沙霉素的MIC值均有所升高。
关键词：大环内酯类抗生素；肺炎支原体；耐药机制
肺炎支原体是引起临床获得性呼吸道感染的主要病原体之一，尤其在儿童及青少年中较常见，由于肺炎支原体属于最小原核真核生物行列且无细胞壁，对头孢类抗菌素不敏感，对本研究中的大环内酯类较敏感[1]。然而，在近年来的临床中，经大环内酯类治疗无效的病例逐渐增多，且分离得到了耐药株，引起临床研究者的广泛重视。本文笔者旨在研究大环内酯类抗生素诱导肺炎支原体的耐药机制，现汇报研究结果如下。
1资料与方法
1.1肺炎支原体（MP）的分离培养
（1） 研究标本来源：选择我院儿科自2012年2月至2014年2月的呼吸道患儿的300份咽拭子，其中60份标本来自门诊患儿，240份标本来自病房患儿。
（2） MP培养基的制备：应用PPLO型基础培养基，加入10%鲜酵母浸液、15%新生的小牛血清、1%葡萄糖、0.4%的酚红指示剂以及青霉素G500 U/ml等。新鲜酵母浸液由儿研所制备提供，新生小牛血清由四川省华西生化制品厂提取生产，葡萄糖和青霉素G购自华北制药，0.4%的酚红指示剂来自北京市化学制剂公司。
（3） 接种培养方法：将收集的300份咽拭子标本接种于制备好的培养基中，混合均匀后将其放置于37℃的温箱中孵育，并针对性设置阳性对照。
若存在肺炎支原体的生长，将对葡萄糖发酵产酸，使得培养基的pH有所下降，从而指示剂的颜色发生变化，并与设置的阳性对照进行对比，培养基颜色由红变黄，即可作为有肺炎支原体生长的指征。
1.2 MP的药物敏感性试验
应用配制的MP液体培养基进行系列倍数比稀释药物，在各试管中加入同等量的浓度为105 CCU/m1的MP菌液，将其放置于37℃的温箱中进行孵育，可以对MP生长产生抑制的药物最低浓度为此药物的MIC。进入研究的药物分别为阿奇霉素、红霉素、交沙霉素标准品等，上述药物均有中国药品生物制品检定所生产。
1.3临床MP的分离株分子鉴定
应用PCR扩增仪对MP特异性16S核蛋白RNA（16SrRNA）基因进行扩增与分子鉴定。此研究中应用的PCR扩增仪属于套式结构类型，由克隆遗传技术研究单位提供。
1.4以红霉素为靶位的23SrRNA基因分析
应用PCR扩增仪（套式）对临床MP分离株的23S核蛋白RNA
基因进行扩增，对PCR扩增产物采用直接测序方法进行测序，将其所测序列与在NCBI体系已登录的标准型23SrRNA基因进行详细对比。
1.5统计学方法
本文的数值资料采用SPSS17.0统计软件进行分析。对研究中的37株MP耐药株的药物MIC值进行多个独立样本的秩和检验，配对样本及计数资料采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1肺炎支原体的分离培养
临床收集的300份咽拭子标本中共分离出40株MP，分离的阳性率为13.3%。由于肺炎支原体在体外环境中营养要求苛刻，因此生长极为缓慢，培养时间为至少2个月甚至更多。分离得出的40株MP中，所需分离培养时间最长的1株耗时为96d，其中所需培养时间最短的1株为14d，平均的分离培养时间为（39.2±1.5）d。分离得出的40株MP菌株以及MP的国际标准株FH经过MP种特异性16SrRNA基因PCR（套式扩增仪）扩增均出现了417bp的目的标志性条带，可以证实所分离得出的菌株均为肺炎支原体。
2.2 MP的药物敏感性试验结果
临床常用的大环内酯类抗生素药物的MIC值分布如下：阿奇霉素的MIC值≤0.004～0.01μg/ml；红霉素的MIC值≤0.004～0.05μg/ml；交沙霉素的MIC值≤0.01～0.02μg/ml。对收集培养分离得出的40株MP进行体外培养基的药物敏感性试验，所需的判断时间大约分布为9～16d，结果发现其中存在3株敏感株，37株的MIC值显著升高，升级为耐药株，占据总株数的92.5%。其中阿奇霉素耐药株的MIC值为17～255μg/ml、红霉素耐药株的MIC值为127～511μg/ml、交沙霉素耐药株的MIC值为3～65μg/ml。上述药物的MIC值均较正常值有所升高，其中以阿奇霉素及红霉素升高最为显著。
2.3以红霉素为靶位的23SrRNA基因分析结果
经分离得出的40株MP菌株以及其标准株FH经23SrRNA基因的套式PCR扩增均表现出792bp的目的性条带。PCR产物经测序后与NCBI体系登录的MP基因序列相比较而言，经分离得出3株敏感株及MP标准株的FH 23SrRNA基因序列与NBI体系登录的MP基因序列一致，其余37株耐药株的23SrRNA均发生基因点突变，其中31株的突变位点位于V区的中心环2063位，29株发生了碱基A—G的突变，2株发生了碱基A—C的突变；其余6株的突变位点位于中心环2064位（A—G）。
3讨论
大环内酯类抗生素是治疗临床由肺炎支原体引起的儿童和青少年呼吸道感染的首选药物类型，但随其在临床的应用时间不断延长，临床对大环内酯类药物的耐药病例不断出现，但是其具体耐药机制并不明确。
大环内酯类药物的作用机制主要为通过结合于核糖体的50S亚基转肽酶中心与此肽输出通道的狭窄部分，从而机械性阻塞肽通道进而抑制体肽的进一步延伸，以阻碍机体蛋白质的合成而发挥其抑菌作用[2]。目前临床对于MP分离株以及耐药菌株的研究只局限于发现点突变。在本文研究中发现6株的突变位点位于中心环2064位（A—G），31株的突变位点位于V区的中心环2063位，从而提示引起MP分离株的主要耐药机制为50S亚单位的23SrRNA基因V区中心环的点突变，占主导地位的为2063位点突变。本文研究中的病例多为耐药MP菌株感染，由于缺乏敏感菌株的感染病例作为对照，因此，在机体内的大环内酯类抗生素对耐药MP菌株是否有效，仍待临床进一步研究。
参考文献：
[1]马晓丽，郑跃杰.肺炎支原体肺炎对大环内酯类药物耐药研究进展[J].国际儿科学杂志，2011，38（6）：538-540，544.
[2]刘杨.肺炎支原体耐药性及耐药机制研究[D].复旦大学，2010.
关键词：大环内酯类抗生素；肺炎支原体；耐药机制
肺炎支原体是引起临床获得性呼吸道感染的主要病原体之一，尤其在儿童及青少年中较常见，由于肺炎支原体属于最小原核真核生物行列且无细胞壁，对头孢类抗菌素不敏感，对本研究中的大环内酯类较敏感[1]。然而，在近年来的临床中，经大环内酯类治疗无效的病例逐渐增多，且分离得到了耐药株，引起临床研究者的广泛重视。本文笔者旨在研究大环内酯类抗生素诱导肺炎支原体的耐药机制，现汇报研究结果如下。
1资料与方法
1.1肺炎支原体（MP）的分离培养
（1） 研究标本来源：选择我院儿科自2012年2月至2014年2月的呼吸道患儿的300份咽拭子，其中60份标本来自门诊患儿，240份标本来自病房患儿。
（2） MP培养基的制备：应用PPLO型基础培养基，加入10%鲜酵母浸液、15%新生的小牛血清、1%葡萄糖、0.4%的酚红指示剂以及青霉素G500 U/ml等。新鲜酵母浸液由儿研所制备提供，新生小牛血清由四川省华西生化制品厂提取生产，葡萄糖和青霉素G购自华北制药，0.4%的酚红指示剂来自北京市化学制剂公司。
（3） 接种培养方法：将收集的300份咽拭子标本接种于制备好的培养基中，混合均匀后将其放置于37℃的温箱中孵育，并针对性设置阳性对照。
若存在肺炎支原体的生长，将对葡萄糖发酵产酸，使得培养基的pH有所下降，从而指示剂的颜色发生变化，并与设置的阳性对照进行对比，培养基颜色由红变黄，即可作为有肺炎支原体生长的指征。
1.2 MP的药物敏感性试验
应用配制的MP液体培养基进行系列倍数比稀释药物，在各试管中加入同等量的浓度为105 CCU/m1的MP菌液，将其放置于37℃的温箱中进行孵育，可以对MP生长产生抑制的药物最低浓度为此药物的MIC。进入研究的药物分别为阿奇霉素、红霉素、交沙霉素标准品等，上述药物均有中国药品生物制品检定所生产。
1.3临床MP的分离株分子鉴定
应用PCR扩增仪对MP特异性16S核蛋白RNA（16SrRNA）基因进行扩增与分子鉴定。此研究中应用的PCR扩增仪属于套式结构类型，由克隆遗传技术研究单位提供。
1.4以红霉素为靶位的23SrRNA基因分析
应用PCR扩增仪（套式）对临床MP分离株的23S核蛋白RNA
基因进行扩增，对PCR扩增产物采用直接测序方法进行测序，将其所测序列与在NCBI体系已登录的标准型23SrRNA基因进行详细对比。
1.5统计学方法
本文的数值资料采用SPSS17.0统计软件进行分析。对研究中的37株MP耐药株的药物MIC值进行多个独立样本的秩和检验，配对样本及计数资料采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1肺炎支原体的分离培养
临床收集的300份咽拭子标本中共分离出40株MP，分离的阳性率为13.3%。由于肺炎支原体在体外环境中营养要求苛刻，因此生长极为缓慢，培养时间为至少2个月甚至更多。分离得出的40株MP中，所需分离培养时间最长的1株耗时为96d，其中所需培养时间最短的1株为14d，平均的分离培养时间为（39.2±1.5）d。分离得出的40株MP菌株以及MP的国际标准株FH经过MP种特异性16SrRNA基因PCR（套式扩增仪）扩增均出现了417bp的目的标志性条带，可以证实所分离得出的菌株均为肺炎支原体。
2.2 MP的药物敏感性试验结果
临床常用的大环内酯类抗生素药物的MIC值分布如下：阿奇霉素的MIC值≤0.004～0.01μg/ml；红霉素的MIC值≤0.004～0.05μg/ml；交沙霉素的MIC值≤0.01～0.02μg/ml。对收集培养分离得出的40株MP进行体外培养基的药物敏感性试验，所需的判断时间大约分布为9～16d，结果发现其中存在3株敏感株，37株的MIC值显著升高，升级为耐药株，占据总株数的92.5%。其中阿奇霉素耐药株的MIC值为17～255μg/ml、红霉素耐药株的MIC值为127～511μg/ml、交沙霉素耐药株的MIC值为3～65μg/ml。上述药物的MIC值均较正常值有所升高，其中以阿奇霉素及红霉素升高最为显著。
2.3以红霉素为靶位的23SrRNA基因分析结果
经分离得出的40株MP菌株以及其标准株FH经23SrRNA基因的套式PCR扩增均表现出792bp的目的性条带。PCR产物经测序后与NCBI体系登录的MP基因序列相比较而言，经分离得出3株敏感株及MP标准株的FH 23SrRNA基因序列与NBI体系登录的MP基因序列一致，其余37株耐药株的23SrRNA均发生基因点突变，其中31株的突变位点位于V区的中心环2063位，29株发生了碱基A—G的突变，2株发生了碱基A—C的突变；其余6株的突变位点位于中心环2064位（A—G）。
3讨论
大环内酯类抗生素是治疗临床由肺炎支原体引起的儿童和青少年呼吸道感染的首选药物类型，但随其在临床的应用时间不断延长，临床对大环内酯类药物的耐药病例不断出现，但是其具体耐药机制并不明确。
大环内酯类药物的作用机制主要为通过结合于核糖体的50S亚基转肽酶中心与此肽输出通道的狭窄部分，从而机械性阻塞肽通道进而抑制体肽的进一步延伸，以阻碍机体蛋白质的合成而发挥其抑菌作用[2]。目前临床对于MP分离株以及耐药菌株的研究只局限于发现点突变。在本文研究中发现6株的突变位点位于中心环2064位（A—G），31株的突变位点位于V区的中心环2063位，从而提示引起MP分离株的主要耐药机制为50S亚单位的23SrRNA基因V区中心环的点突变，占主导地位的为2063位点突变。本文研究中的病例多为耐药MP菌株感染，由于缺乏敏感菌株的感染病例作为对照，因此，在机体内的大环内酯类抗生素对耐药MP菌株是否有效，仍待临床进一步研究。
参考文献：
[1]马晓丽，郑跃杰.肺炎支原体肺炎对大环内酯类药物耐药研究进展[J].国际儿科学杂志，2011，38（6）：538-540，544.
[2]刘杨.肺炎支原体耐药性及耐药机制研究[D].复旦大学，2010.