【目的】构建秦川牛醇溶蛋白2(Gli2)基因的重组干扰腺病毒，为研究Hh信号通路在秦川牛脂肪形成过程中的功能奠定基础。【方法】构建3条短发卡RNA（shRNA）：shRNA-LY1、shRNA-LY2、shRNA-LY3，利用双荧光素酶报告系统检测其干扰效率。再用干扰效率较高的shRNA-LY3构建腺病毒干扰载体pAD/PL-DEST/CMV-GFP/U6-LY3，转染HEK 293A细胞进行腺病毒的包装并扩繁以提高病毒滴度。利用LaSRT法测定腺病毒的滴度，并将得到的病毒以不同剂量侵染秦川牛脂肪细胞，确定其最佳感染复数（MOI）。【结果】筛选得到shRNA-LY3干扰效率最高，达到85%；成功构建了秦川牛Gli2基因腺病毒干扰载体pAD/PL-DEST/CMV-GFP/U6-LY3，包装后获得了重组干扰腺病毒Ad-shRNA-LY3；LaSRT法测得其滴度为1×109 PFU/mL。腺病毒对秦川牛脂肪细胞的最佳MOI为50。【结论】成功构建了秦川牛Gli2基因腺病毒干扰载体，包装后获得了高滴度的重组干扰腺病毒Ad-sh-RNA-LY3，其对秦川牛脂肪细胞的最佳MOI为50。