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摘要[目的] 在肉牛繁育场中推广与应用血液早孕检测方法，提高繁殖效率。[方法] 对胚胎移植受体母牛进行血液早孕检测，分析检测准确率。[结果] 对早孕检测空怀牛在60 d进行直肠复检，结果发现空怀检测准确率达到100%。对血液检测怀孕牛在60 d进行直肠复检，结果发现复检怀孕的平均检出准确率为81.81%。[结论] 在肉牛繁育场中应用血液早孕检测方法能够尽早筛选出空怀牛只，缩短产犊间隔，节省受体牛饲养管理成本。
关键词早孕检测；肉牛场；受体牛
中图分类号S814.8文献标识码
A文章编号0517-6611（2015）28-134-02
Application of Bloodbased Early Pregnancy Diagnosis in Beef Cattle Breeding Farm
CHEN Long1，2，SUN Guiyong1，ZHAO Zengyuan2，YU Wenli1* et al
（1.Hebei Tianhe Beef Cattle Co.Ltd.，Shijiazhuang，Hebei 050051；2.Beijing Anbo Embryo Biotech Center，Beijing 100107）
Abstract [Objective] The research aimed to popularize and apply the bloodbased early pregnancy diagnosis in the beef cattle breeding farm and improve the reproduction efficiency.[Method]The bloodbased early pregnancy diagnosis was made on embryo transplanted recipient cows，and the detection accuracy rate was analyzed.[Result] The open cows by bloodbased early pregnancy diagnosis were detected by rectal palpation on the 60th day，and the accuracy rate of open cows reached 100%.The pregnant cows by bloodbased early pregnancy diagnosis were detected by rectal palpation on the 60th day，and the average accuracy rate of pregnancy was 81.81%.[Conclusion] The open cows could be screened out in advance，the calving interval could be shortened，and feeding and management cost of recipient cows could be saved by applying bloodbased early pregnancy diagnosis in beef cattle breeding farm.
Key words Early pregnancy diagnosis； Beef breeding farm； Recipient cows
近年来，国内肉牛养殖业受到国内外市场冲击而面临结构转型。适度规模能繁母牛养殖逐步开展，多地区实施基础母牛扩群补贴[1]。随着适度规模化能繁母牛场的发展，牧场管理者逐步认识到空怀饲养是能繁肉牛饲养成本居高不下的重要原因之一，唯有提高繁殖效率才是牧场赢利点的关键所在，并且不断从育种、营养和繁殖技术等角度综合提高繁殖效率。除了实施定时输精和胚胎移植等繁殖新技术外，近几年发展起来的早孕检测技术能够有效缩短空怀时间，提高繁殖效率和降低饲养成本。
目前，早孕检测技术分为B超直肠检查法和血液早孕检测法2种。B超直肠检查法对仪器质量和操作人员技术水平的要求均较高，难以在基层完全推广[2]。血液检测法使用厂商提供的试剂盒，按照说明书操作步骤进行，操作快捷，结果直观，牧场一线人员经过简单培训即可。血液早孕检测法在国内外针对人工授精的规模化奶牛场已经有所应用[3]。但是，该方法在规模化肉牛繁育场中的推广应用鲜有报道。笔者针对胚胎移植受体母牛进行血液早孕检测，验证检测准确率，以期为其在规模化肉牛繁育场中更好地推广应用提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1受体牛。由河北天和肉牛养殖有限公司提供的西门塔尔育成牛，繁殖系统正常，卵巢有活性，膘情适中。
1.1.2试剂。CIDR孕酮栓，购自美国辉瑞动物保健品公司，1.38 g孕酮/支；血液早孕检测试剂盒，购自美国爱德士（IDEXX）可视早孕试剂盒；氯前列烯醇（PG），0.322 mg/支，购自齐鲁动物保健品公司；维生素ADE、高锰酸钾、利多卡因等选用国产同类药品中的优质产品。
1.1.3耗材。采血管使用5 ml包装促凝血抽真空采血管。
1.2方法
1.2.1受体牛的同期发情方案。CIDR/CUE-MATE+PG方法：在发情周期的任一天上午8：00～10：00放置阴道栓（土霉素粉+CIDR 或土霉素粉+CUE-MATE），同时肌注维生素ADE注射液5 ml/头，当天记为第0天。第9天上午8：00同时肌注PG 0.6 mg/头和维生素ADE注射液5 ml/头，第12天上午8：00撤栓，第13～14天全天观察发情、准确记录。第21天进行胚胎移植。 1.2.2受体牛的发情鉴定。第13～14 d（撤栓后24 h）开始观察发情并记录，以站立稳定接收爬跨为标准。
1.2.3受体牛的胚胎移植。直肠检查受体牛的黄体发育状况及子宫健康状况，结合发情记录确定移植头数。保定牛只，高锰酸钾温水清洗外阴，采用尾椎硬膜外注射5 ml利多卡因方法麻醉，待尾部松弛后进行非手术法移植，胚胎移入黄体发育侧的子宫角深部。
1.2.4妊娠检查。胚胎移植后23～25 d（等同于人工授精后30～32 d），采用血液早孕检测试剂盒进行检测。在采血管上标记管号和牛号，受体牛尾根静脉采集血液5 ml，送至实验室低速离心10 min后吸取血清。设置阳性对照和阴性对照，按照试剂盒说明书依次加入稀释液、检测液、酶标抗体、底物液和终止液，依据肉眼观察微孔板颜色差异确认妊娠状况：若未观察到蓝色，颜色与阴性对照孔颜色相似，则确定空怀；若观察到蓝色，则存在妊娠相关蛋白（PAGs），确定怀孕；如果样品孔颜色很难用肉眼分辨，则认为疑似怀孕。对于疑似怀孕及确定怀孕的牛只，在移植后50～60 d统一直肠复检定胎。
2结果与分析
2.1空怀检测准确率
选择连续2个批次胚胎移植受体牛，分别在移植后30 d进行血检，针对早孕检测空怀牛在60 d直肠复检，结果表明空怀检测准确率达到100%（表1）。
2.2早孕检测准确率
3讨论
对牛进行精准及时的怀孕检测在是牧场繁殖管理程序中的重要内容之一。目前，市场上商品化的各类血检试剂盒不断出现，其基本原理是依据酶联免疫反应原理，设计、检测怀孕早期存在于牛血清或EDTA血浆中的作为怀孕标志的怀孕相关蛋白（PAGs）的浓度水平[4]，从而确认妊娠和空怀牛只。试剂盒检测准确率是该方法能否顺利推广应用的基础条件。国内外学者从不同角度作了大量试验探索血检试剂盒检测的准确程度。Piechotta等[5]对比市售2种血检试剂盒，认为无论特异性还是准确性均达到理想水平，可以在牧场推广应用。Silva等[6]针对不同胎次泌乳牛早孕血检得出以下结论：第1～3胎次泌乳牛的检测准确性分别为93.7%、95.4%和96.2%，胎次越高，准确性越高。空怀检出准确率是试剂盒新方法能否有效推广应用的关键所在，理想状态下空怀检测准确率应该达到100%。Romano等[7]对比了血检与B超检查，在28、30和35 d血检准确性均大于94%，无显著差异，但是仍然低于B超检查；同时认为由于低浓度PAG的存在或胚胎丢失，假阴性和假阳性的结果不可避免会存在。王建勇等[8]对上海地区9个牧场3 400份血样利用早孕试剂盒检测和直肠复检对比后发现空怀检出准确率为98%，怀孕牛检出准确率为94%。该试验中育成牛的空怀检测准确率达到100%，一方面说明目前试剂盒准确度不断在提高，另一方面也可能与试验样本数较少有关。牛配种或者移植后的30～60 d内，存在一定程度的胚胎早期死亡，比率大约在4%～20%左右[9-10]，所以早孕检测怀孕的牛只在60 d都需要进行直肠复检。该试验针对血检怀孕牛，在60 d直肠复检怀孕平均检出准确率为81.81%。相对冷冻精液而言，冷冻胚胎经历的冻融过程以及冷冻保护剂毒性对胚胎细胞骨架、线粒体及透明带超微结构造成一定程度不可逆的物理和化学损伤[11]，降低其与母体妊娠信号识别的能力[12]，从而冷冻胚胎移植后早期死亡的比例更高。
与常规直肠触诊相比，通过血液早孕检测可以缩短近30 d空怀期。从经济效益角度来看，试剂盒检测成本远低于空怀牛饲养成本。以河北天和肉牛养殖有限公司为例，目前受体牛饲养成本大约在12元/头左右，早孕检测空怀牛每月可以节省近360元/头。按照每月移植50头，情期受胎率45%，空怀牛早孕检测检出率80%计算，有20头空怀牛可以提前30 d检出，则全年可节省受体牛饲养管理成本：20头×30 d×12月×12元=8.64万元。
4 结论
基于免疫学原理的血液早孕检测试剂盒空怀准确率达到99%以上，能够实现尽早筛选出空怀牛只的目的，同时避免与胚胎直接接触，一定程度上降低了交叉感染和流产率。但是，胚胎相对价值较高，为了避免不必要的损失，早孕检测试剂盒需要进一步提高和稳定空怀检出准确率，同时降低检测成本（35元/头以上），从而实现在胚胎移植的能繁肉牛场广泛推广应用，最终协助牧场尽早采取技术措施，缩短产犊间隔，提高繁殖效率和生产效益。
参考文献
[1] 曹兵海.2015年肉牛牦牛产业发展趋势与政策建议[J].中国牛业科学，2015（1）：1-2.
[2] 张春光，刘光磊，陈锦昌，等.奶牛早孕诊断技术研究进展及其应用价值分析[J].中国奶牛，2015（8）：22-25.
[3] BALHARA A K，GUPTA M，SINGH S，et al.Early pregnancy diagnosis in bovines：Current status and future directions[J].The scientific world Journal，2013，2013：1-10.
[4] VELEK K，MICHAUD S，BOUCBER K，等.牛怀孕早期精准ELISA检测[C]//第四届全国牛病防治与产业发展研讨会论文集.武汉：华中农业大学，2012：158-160.
[5] PIECHOTTA M，BOLLWEIN J，FRIEDRICH M，et al.Comparison of commercial ELISA blood tests for early pregnancy detection in dairy cows[J].Journal of reproduction and development，2011，57（1）：72-75. [6] SILVA E，STERRY R A，KOLB D，et al.Accuracy of a pregnancyassociated glycoprotein ELISA to determine pregnancy status of lactating dairy cows twentyseven days after timed artificial insemination[J].Journal of dairy science，2007，90：4612-4622.
[7] ROMANL J E，LARSON J E.Accuracy of pregnancy specific proteinB test for early pregnancy diagnosis in dairy cattle[J].Theriogenology，2010，74（6）：932-939.
[8] 王建勇，庄海，李荣杰，等.血液早孕检测法在规模牛场应用效果分析[J].中国奶牛，2014（13）：23-25.
[9] SANTOS J E，THATCHER W W，CHEBEL R C，et al.The effect of embryonic death rates in cattle on the efficacy of estrus synchronization programs[J].Animal reproduction science，2004，82/83：513-535.
[10] ALEXANDER B M，JOHNSON M S，GUARDIA R O，et al.Embryonic loss from 30 to 60 days post breeding and the effect of palpation per rectum on pregnancy[J].Theriogenology，1995，43（3）：551-556.
[11] 张慧，苏雷.家畜胚胎冷冻与胚胎结构损伤的研究[J].养殖技术顾问，2009（6）：144-146.
[12] 毕江华，冯春涛，余文莉，等.妊娠识别信号影响牛胚胎移植妊娠率的研究[J].中国奶牛，2012（15）：20-22.
选用连续5个批次胚胎移植受体牛，针对血液检测怀孕牛在60 d直肠复检，结果表明复检怀孕检出的平均准确率为81.81%（表2）。
关键词早孕检测；肉牛场；受体牛
中图分类号S814.8文献标识码
A文章编号0517-6611（2015）28-134-02
Application of Bloodbased Early Pregnancy Diagnosis in Beef Cattle Breeding Farm
CHEN Long1，2，SUN Guiyong1，ZHAO Zengyuan2，YU Wenli1* et al
（1.Hebei Tianhe Beef Cattle Co.Ltd.，Shijiazhuang，Hebei 050051；2.Beijing Anbo Embryo Biotech Center，Beijing 100107）
Abstract [Objective] The research aimed to popularize and apply the bloodbased early pregnancy diagnosis in the beef cattle breeding farm and improve the reproduction efficiency.[Method]The bloodbased early pregnancy diagnosis was made on embryo transplanted recipient cows，and the detection accuracy rate was analyzed.[Result] The open cows by bloodbased early pregnancy diagnosis were detected by rectal palpation on the 60th day，and the accuracy rate of open cows reached 100%.The pregnant cows by bloodbased early pregnancy diagnosis were detected by rectal palpation on the 60th day，and the average accuracy rate of pregnancy was 81.81%.[Conclusion] The open cows could be screened out in advance，the calving interval could be shortened，and feeding and management cost of recipient cows could be saved by applying bloodbased early pregnancy diagnosis in beef cattle breeding farm.
Key words Early pregnancy diagnosis； Beef breeding farm； Recipient cows
近年来，国内肉牛养殖业受到国内外市场冲击而面临结构转型。适度规模能繁母牛养殖逐步开展，多地区实施基础母牛扩群补贴[1]。随着适度规模化能繁母牛场的发展，牧场管理者逐步认识到空怀饲养是能繁肉牛饲养成本居高不下的重要原因之一，唯有提高繁殖效率才是牧场赢利点的关键所在，并且不断从育种、营养和繁殖技术等角度综合提高繁殖效率。除了实施定时输精和胚胎移植等繁殖新技术外，近几年发展起来的早孕检测技术能够有效缩短空怀时间，提高繁殖效率和降低饲养成本。
目前，早孕检测技术分为B超直肠检查法和血液早孕检测法2种。B超直肠检查法对仪器质量和操作人员技术水平的要求均较高，难以在基层完全推广[2]。血液检测法使用厂商提供的试剂盒，按照说明书操作步骤进行，操作快捷，结果直观，牧场一线人员经过简单培训即可。血液早孕检测法在国内外针对人工授精的规模化奶牛场已经有所应用[3]。但是，该方法在规模化肉牛繁育场中的推广应用鲜有报道。笔者针对胚胎移植受体母牛进行血液早孕检测，验证检测准确率，以期为其在规模化肉牛繁育场中更好地推广应用提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1受体牛。由河北天和肉牛养殖有限公司提供的西门塔尔育成牛，繁殖系统正常，卵巢有活性，膘情适中。
1.1.2试剂。CIDR孕酮栓，购自美国辉瑞动物保健品公司，1.38 g孕酮/支；血液早孕检测试剂盒，购自美国爱德士（IDEXX）可视早孕试剂盒；氯前列烯醇（PG），0.322 mg/支，购自齐鲁动物保健品公司；维生素ADE、高锰酸钾、利多卡因等选用国产同类药品中的优质产品。
1.1.3耗材。采血管使用5 ml包装促凝血抽真空采血管。
1.2方法
1.2.1受体牛的同期发情方案。CIDR/CUE-MATE+PG方法：在发情周期的任一天上午8：00～10：00放置阴道栓（土霉素粉+CIDR 或土霉素粉+CUE-MATE），同时肌注维生素ADE注射液5 ml/头，当天记为第0天。第9天上午8：00同时肌注PG 0.6 mg/头和维生素ADE注射液5 ml/头，第12天上午8：00撤栓，第13～14天全天观察发情、准确记录。第21天进行胚胎移植。 1.2.2受体牛的发情鉴定。第13～14 d（撤栓后24 h）开始观察发情并记录，以站立稳定接收爬跨为标准。
1.2.3受体牛的胚胎移植。直肠检查受体牛的黄体发育状况及子宫健康状况，结合发情记录确定移植头数。保定牛只，高锰酸钾温水清洗外阴，采用尾椎硬膜外注射5 ml利多卡因方法麻醉，待尾部松弛后进行非手术法移植，胚胎移入黄体发育侧的子宫角深部。
1.2.4妊娠检查。胚胎移植后23～25 d（等同于人工授精后30～32 d），采用血液早孕检测试剂盒进行检测。在采血管上标记管号和牛号，受体牛尾根静脉采集血液5 ml，送至实验室低速离心10 min后吸取血清。设置阳性对照和阴性对照，按照试剂盒说明书依次加入稀释液、检测液、酶标抗体、底物液和终止液，依据肉眼观察微孔板颜色差异确认妊娠状况：若未观察到蓝色，颜色与阴性对照孔颜色相似，则确定空怀；若观察到蓝色，则存在妊娠相关蛋白（PAGs），确定怀孕；如果样品孔颜色很难用肉眼分辨，则认为疑似怀孕。对于疑似怀孕及确定怀孕的牛只，在移植后50～60 d统一直肠复检定胎。
2结果与分析
2.1空怀检测准确率
选择连续2个批次胚胎移植受体牛，分别在移植后30 d进行血检，针对早孕检测空怀牛在60 d直肠复检，结果表明空怀检测准确率达到100%（表1）。
2.2早孕检测准确率
3讨论
对牛进行精准及时的怀孕检测在是牧场繁殖管理程序中的重要内容之一。目前，市场上商品化的各类血检试剂盒不断出现，其基本原理是依据酶联免疫反应原理，设计、检测怀孕早期存在于牛血清或EDTA血浆中的作为怀孕标志的怀孕相关蛋白（PAGs）的浓度水平[4]，从而确认妊娠和空怀牛只。试剂盒检测准确率是该方法能否顺利推广应用的基础条件。国内外学者从不同角度作了大量试验探索血检试剂盒检测的准确程度。Piechotta等[5]对比市售2种血检试剂盒，认为无论特异性还是准确性均达到理想水平，可以在牧场推广应用。Silva等[6]针对不同胎次泌乳牛早孕血检得出以下结论：第1～3胎次泌乳牛的检测准确性分别为93.7%、95.4%和96.2%，胎次越高，准确性越高。空怀检出准确率是试剂盒新方法能否有效推广应用的关键所在，理想状态下空怀检测准确率应该达到100%。Romano等[7]对比了血检与B超检查，在28、30和35 d血检准确性均大于94%，无显著差异，但是仍然低于B超检查；同时认为由于低浓度PAG的存在或胚胎丢失，假阴性和假阳性的结果不可避免会存在。王建勇等[8]对上海地区9个牧场3 400份血样利用早孕试剂盒检测和直肠复检对比后发现空怀检出准确率为98%，怀孕牛检出准确率为94%。该试验中育成牛的空怀检测准确率达到100%，一方面说明目前试剂盒准确度不断在提高，另一方面也可能与试验样本数较少有关。牛配种或者移植后的30～60 d内，存在一定程度的胚胎早期死亡，比率大约在4%～20%左右[9-10]，所以早孕检测怀孕的牛只在60 d都需要进行直肠复检。该试验针对血检怀孕牛，在60 d直肠复检怀孕平均检出准确率为81.81%。相对冷冻精液而言，冷冻胚胎经历的冻融过程以及冷冻保护剂毒性对胚胎细胞骨架、线粒体及透明带超微结构造成一定程度不可逆的物理和化学损伤[11]，降低其与母体妊娠信号识别的能力[12]，从而冷冻胚胎移植后早期死亡的比例更高。
与常规直肠触诊相比，通过血液早孕检测可以缩短近30 d空怀期。从经济效益角度来看，试剂盒检测成本远低于空怀牛饲养成本。以河北天和肉牛养殖有限公司为例，目前受体牛饲养成本大约在12元/头左右，早孕检测空怀牛每月可以节省近360元/头。按照每月移植50头，情期受胎率45%，空怀牛早孕检测检出率80%计算，有20头空怀牛可以提前30 d检出，则全年可节省受体牛饲养管理成本：20头×30 d×12月×12元=8.64万元。
4 结论
基于免疫学原理的血液早孕检测试剂盒空怀准确率达到99%以上，能够实现尽早筛选出空怀牛只的目的，同时避免与胚胎直接接触，一定程度上降低了交叉感染和流产率。但是，胚胎相对价值较高，为了避免不必要的损失，早孕检测试剂盒需要进一步提高和稳定空怀检出准确率，同时降低检测成本（35元/头以上），从而实现在胚胎移植的能繁肉牛场广泛推广应用，最终协助牧场尽早采取技术措施，缩短产犊间隔，提高繁殖效率和生产效益。
参考文献
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[7] ROMANL J E，LARSON J E.Accuracy of pregnancy specific proteinB test for early pregnancy diagnosis in dairy cattle[J].Theriogenology，2010，74（6）：932-939.
[8] 王建勇，庄海，李荣杰，等.血液早孕检测法在规模牛场应用效果分析[J].中国奶牛，2014（13）：23-25.
[9] SANTOS J E，THATCHER W W，CHEBEL R C，et al.The effect of embryonic death rates in cattle on the efficacy of estrus synchronization programs[J].Animal reproduction science，2004，82/83：513-535.
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选用连续5个批次胚胎移植受体牛，针对血液检测怀孕牛在60 d直肠复检，结果表明复检怀孕检出的平均准确率为81.81%（表2）。