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摘要[目的]对蚕蛹油乙酯进行安全性评价。 [方法]采用最大耐受量法进行急性经口毒性评价,并采用Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸变试验进行蚕蛹油乙酯的遗传毒性研究,并开展大鼠30 d喂养试验。 [结果] 蚕蛹油乙酯经急性经口毒性评价为实际无毒级物质;Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸变试验均未发现蚕蛹油乙酯有显著的遗传毒性;大鼠30 d喂养试验中,各试验组大鼠生长发育良好,无异常行为和中毒症状。 [结论]蚕蛹油乙酯为实际无毒物,无遗传毒性,可长期服用。
关键词蚕蛹油乙酯;安全性;评价
中图分类号S88-9文献标识码A文章编号0517-6611(2015)28-139-03
Study on Toxicological Safety Evaluation of Ethyl Silkworm Oil
ZHAO Shichen, WU Yonghua, CHEN Shanglong et al
(Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou, Jiangsu 221111)
Abstract[Objective] To assess the toxicological safety of ethyl silkworm oil. [Method] Acute toxicity test, genetic toxicity test (Ames test, micronucleus test of born marrow in mice, sperm shapeabnormality test in mice) and thirtyday feeding test in rats were used in this study according to the procedures for toxicological assessment of food. [Result] The maximum tolerated dose(MTD) of ethyl silkworm oil on male and female mice were all larger than 17.56 g/kg.The results of Ames test, mouse bone marrow micronucleus test and detection of chromosome aberration experiment were negative. No significant toxicity was observed by 30day feeding experiment. [Conclusion] Ethyl silkworm oil is highly safe with neither acute toxicity nor genotoxicity.
Key wordsEthyl silkworm oil; Safety; Assessment
蚕蛹是一种缫丝副产品,通常被作为饲料或肥料利用,在我国某些地区也有食用蚕蛹的悠久历史。由于蚕蛹富含蛋白质、不饱和脂肪酸等成分,近年来对蚕蛹的研究已经引起国内外学者的广泛关注[1]。目前对蚕蛹的研究主要集中在对蚕蛹蛋白、肽和油脂的提取、分析检测及相关生物活性等方面。邱英华等[2]对蚕蛹蛋白提取与脱臭工艺进行了研究,最终利用蚕蛹制得灰白色无嗅可满足食品级要求的蛋白粉末。许强华等[3]将蚕蛹蛋白与畜禽肉蛋白营养差异进行了比较与探讨,结果发现蚕蛹蛋白是一种非常优质的蛋白来源。吴琼英等[4]对缫丝蚕蛹中的水溶性和碱溶性蛋白组分进行营养学评价,结果发现蚕蛹蛋白水溶性和碱溶性组分中的氨基酸种类齐全,并且发现蚕蛹的水溶性蛋白和碱溶性蛋白的碱性蛋白酶酶解产物均具有较强的ACE抑制活性。徐家玉等[5]对蚕蛹蛋白缓解运动性疲劳的作用进行了研究,结果发现蚕蛹蛋白具有缓解运动性疲劳的作用。贾俊强等[6]、潘文娟等[7]和张研宇等[8]对蚕蛹油脂肪酸组成进行了分析,发现蚕蛹油富含大量不饱和脂肪酸。张岫美等[9]蚕蛹油α亚麻酸提取工艺进行了研究。
近年来,也有部分学者对蚕蛹进行深加工以制备生物活性物质。张明春等[10]采用酶解与膜法联用分离制备得到蚕蛹生物活性肽,并且发现该肽对糖分解代谢丙酮酸生成有促进作用。施英等[11]制备了蚕蛹油微胶囊。虽然对蚕蛹进行了大量研究,但尚未见对蚕蛹油乙酯系统安全性评价的相关报道。笔者参照GB 15193.1-2014《食品安全性毒理学评价程序》对蚕蛹油乙酯进行安全性评价[12],以望为蚕蛹油乙酯的开发利用提供一定的研究基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1受试物。蚕蛹油乙酯样品由南通福尔生物制品有限公司提供,样品通过蚕蛹油与食用乙醇酯进行交换反应得到,蚕蛹油乙酯的主要成分为亚麻酸乙酯。
1.1.2实验动物。SPF级昆明种小鼠和SD大鼠。
1.1.3试验菌株。鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102试验菌株,由湖南省疾病控防中心提供。
1.2主要试剂多氯联苯(分析纯);甲醇(分析纯);二甲基亚砜(DMSO,分析纯);血液生化指标检测试剂盒。
1.3主要仪器贝克曼DXC800全自动生化分析仪,美国;OLYMPUS 显微镜,型号为CH20,日本;梅特勒托利多电子分析天平,型号XPE105,瑞士;酶标仪Spectra Max M2,美国。
1.4试验方法
1.4.1小鼠经口急性毒性试验。试验参照GB 15193.1-2014《食品安全性毒理学评价程序》进行 [12],采用最大耐受剂量法。选用体重为18~22 g的SPF级昆明种小鼠20只,雌雄各半,一次经口灌胃, 灌胃后观察2周内死亡动物数及动物的机体健康情况。 1.4.2遗传毒性试验。
1.4.2.1Ames试验。参照GB 15193.1-2014《食品安全性毒理学评价程序》进行[12]。试验采用鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型试验菌株进行试验,设5 000、1 000、200、40和8 μg/皿5个剂量组,每个剂量3个重复,平行试验1次。
1.4.2.2小鼠骨髓细胞微核试验。参照GB 15193.1-2014《食品安全性毒理学评价程序》进行[12]。采用间隔24 h 2次经口灌胃法进行试验。以40 mg/(kg·bw)剂量的环磷酰胺为阳性对照,食用植物油为阴性对照。试验组高、中、低3个剂量分别为10.00、5.00和2.50 g/(kg·bw)。采用t检验进行统计与分析。
1.4.2.3小鼠精子畸变试验。参照GB 15193.1-2014《食品安全性毒理学评价程序》进行[12]。以40 mg/(kg·bw)剂量的环磷酰胺为阳性对照,以食用植物油为阴性对照。试验组高、中、低3个剂量分别为10.00、5.00和2.50 g/(kg·bw),相应剂量的受试液采用灌胃方式给小鼠给药。每天灌胃1次,连续5 d,于末次灌胃后的第30天处死动物,取双侧副睾,取精子制成涂片,染色后显微观察统计畸变精子发生率。
1.4.3大鼠30 d喂养试验。取SD大鼠80只,雌雄各半,将实验动物随机分为4组:对照组及3个受试物组,每组20只,雌雄各半。设置样品低、中、高剂量分别为1.25、2.50和5.00 g/(kg·bw)(相当于人体推荐剂量的25、50、100倍)。采取将样品掺入饲料中给样,对照组给予基础饲料,连续30 d。
眼内睑取血测定血红蛋白含量、红细胞计数及白细胞计数、白细胞分类等血液学指标。取血清测定天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(CHO)、总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)等生化指标。
1.4.4数据统计与分析。试验数据使用SPSS11.0统计软件进行统计与分析。
2结果与分析
2.1小鼠的急性经口毒性试验试验过程中试验组小鼠,采食、活动均未发现有显著影响。由表1可知,以17.56 g/(kg·bw)剂量的样品给不同性别的昆明种小鼠灌胃后未见明显中毒症状,14 d内无死亡。试验末将受试动物处死进行解剖检查,肝、脾、肾、胃、肠、心、肺等主要脏器,未见明显异常改变。样品对雌、雄昆明种小鼠的最大受剂量(MTD)大于17.56 g/(kg·bw)。根据《保健食品检验与评价技术规范》中的急性毒性分级标准,属无毒级[13]。
2.2遗传毒性试验
2.2.1Ames试验。供试品对TA97、TA98、TA100、TA102 标准菌株在有无S9混合液条件下均未引起基因组碱基置换或移码突变,与自发回变组相同(P >0.05),而与阳性对照组相比差异级显著(P < 0.01)。由表2可知,蚕蛹油乙酯样品的Ames试验结果为阴性。
2.2.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验。按照“1.4.2”中方法进行小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验。由表3可知,各剂量组微核率与阴性对照组相比均无显著性差异(P>0.05),而环磷酰胺组与阴性对照组相比有极显著性差异(P<0.01)。这表明蚕蛹油乙酯对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果为阴性。
2.3.2血液生化学测定结果。
由表7可知,各剂量组雌雄大鼠的总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、血糖、胆固醇及甘油三酯与对照组相比均无显著差异(P>0.05),说明产品未对大鼠血液生化指标产生显著影响。
3结论与讨论
蚕蛹油具有改善记忆、抗血栓形成和治疗高脂高糖诱导的大鼠脂肪性肝炎等作用,对蚕蛹油的研究已有不少报道[14-16]。蚕蛹油乙酯是从蚕蛹中提取蚕蛹油,再经过酯交换方法得到的,其主要成分为亚麻酸乙酯。笔者通过对蚕蛹油乙酯的安全性评价,结果表明蚕蛹油乙酯对昆明种雌、雄小鼠的最大耐受剂量(MTD)均大于17.56 g/(kg·bw),属于实际无毒级;遗传毒性试验(Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸变试验)结果均为阴性,说明蚕蛹油乙酯无遗传毒性;大鼠30 d喂饲期间动物生长发育良好,蚕蛹油乙酯对大鼠体重、血液生化指标等均无显著性影响(P>0.05)。综上所述,蚕蛹油乙酯属于无毒级产品,可长期服用。
参考文献
[1] 王彦平,刘洁,吴予明.蚕蛹的营养成分分析[J].郑州大学学报,2009,44(3):638-640.
[2] 邱英华,孙卫东,王玉海,等.蚕蛹蛋白提取与脱臭工艺研究[J].中国食品添加剂,2012(3):133-136.
[3] 许强华, 王伟, 杨玉英, 等.蚕蛹蛋白与畜禽肉蛋白营养差异比较与探讨[J].安徽农业科学,2014,42(6):1722-1723.
[4] 吴琼英,徐金玲,贾俊强,等.蚕蛹不同溶解性蛋白的营养学评价及酶解物对血管紧张素转换酶的抑制活性[J].蚕业科学,2011,37(2):352-357.
[5] 徐家玉, 吕晓华.蚕蛹蛋白缓解运动性疲劳的实验研究[J].现代预防医学,2005,35(12):2309-2313.
[6] 贾俊强,吴琼英,杜金娟,等. 超声波辅助水酶法提取蚕蛹油工艺优化及脂肪酸组成分[J].食品科学,2014,35(16):52-57.
[7] 潘文娟,方婷婷,廖爱美,等.不同蚕蛹油中脂肪酸的性状及组分分析[J].食品科学,2011,32 (4): 148-151.
[8] 张研宇, 李建科. 蚕蛹油提取、精炼及其脂肪酸组成分析[J].中国油脂,2010,35(6): 76-79.
[9] 张岫美,邓树海, 魏欣冰.蚕蛹油??-亚麻酸提取工艺研究和成分分析[J].中国生化药物杂志,2003,24(5):222-223.
[10] 张明春,韩克勤,张 媛,等.酶解与膜法联用制备蚕蛹生物功能活性肽[J],食品科学,2005,24(5):222-224.
[11] 施英,吴娱明,廖森泰,等. 蚕蛹油微胶囊的制备[J].蚕业科学,2010,36(5):875-878.
[12] 中华人民共和国卫生部.食品安全性毒理学评价程序:GB 15193.1-2003[S].北京:中国标准出版社,2004.
[13] 卫生部.保健食品检验与评价技术规范[S].中华人民共和国卫生部,2003:220.
[14] 郑鸿雁,昌友权,曲红光,等.蚕蛹油抗血栓形成作用研究[J].食品科学,2005,26(9):484-486.
[15] 彭欣莉,郑鸿雁,昌友权,等.蚕蛹油改善小鼠记忆作用的实验研究[J].食品科学,2005,26(9):490-493.
[16] 朱增燕,薛洁,亓志刚.蚕蛹油对高脂高糖诱导大鼠脂肪性肝炎的治疗作用研究[J].中国药理与临床,2012,28(3):86-91.
关键词蚕蛹油乙酯;安全性;评价
中图分类号S88-9文献标识码A文章编号0517-6611(2015)28-139-03
Study on Toxicological Safety Evaluation of Ethyl Silkworm Oil
ZHAO Shichen, WU Yonghua, CHEN Shanglong et al
(Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou, Jiangsu 221111)
Abstract[Objective] To assess the toxicological safety of ethyl silkworm oil. [Method] Acute toxicity test, genetic toxicity test (Ames test, micronucleus test of born marrow in mice, sperm shapeabnormality test in mice) and thirtyday feeding test in rats were used in this study according to the procedures for toxicological assessment of food. [Result] The maximum tolerated dose(MTD) of ethyl silkworm oil on male and female mice were all larger than 17.56 g/kg.The results of Ames test, mouse bone marrow micronucleus test and detection of chromosome aberration experiment were negative. No significant toxicity was observed by 30day feeding experiment. [Conclusion] Ethyl silkworm oil is highly safe with neither acute toxicity nor genotoxicity.
Key wordsEthyl silkworm oil; Safety; Assessment
蚕蛹是一种缫丝副产品,通常被作为饲料或肥料利用,在我国某些地区也有食用蚕蛹的悠久历史。由于蚕蛹富含蛋白质、不饱和脂肪酸等成分,近年来对蚕蛹的研究已经引起国内外学者的广泛关注[1]。目前对蚕蛹的研究主要集中在对蚕蛹蛋白、肽和油脂的提取、分析检测及相关生物活性等方面。邱英华等[2]对蚕蛹蛋白提取与脱臭工艺进行了研究,最终利用蚕蛹制得灰白色无嗅可满足食品级要求的蛋白粉末。许强华等[3]将蚕蛹蛋白与畜禽肉蛋白营养差异进行了比较与探讨,结果发现蚕蛹蛋白是一种非常优质的蛋白来源。吴琼英等[4]对缫丝蚕蛹中的水溶性和碱溶性蛋白组分进行营养学评价,结果发现蚕蛹蛋白水溶性和碱溶性组分中的氨基酸种类齐全,并且发现蚕蛹的水溶性蛋白和碱溶性蛋白的碱性蛋白酶酶解产物均具有较强的ACE抑制活性。徐家玉等[5]对蚕蛹蛋白缓解运动性疲劳的作用进行了研究,结果发现蚕蛹蛋白具有缓解运动性疲劳的作用。贾俊强等[6]、潘文娟等[7]和张研宇等[8]对蚕蛹油脂肪酸组成进行了分析,发现蚕蛹油富含大量不饱和脂肪酸。张岫美等[9]蚕蛹油α亚麻酸提取工艺进行了研究。
近年来,也有部分学者对蚕蛹进行深加工以制备生物活性物质。张明春等[10]采用酶解与膜法联用分离制备得到蚕蛹生物活性肽,并且发现该肽对糖分解代谢丙酮酸生成有促进作用。施英等[11]制备了蚕蛹油微胶囊。虽然对蚕蛹进行了大量研究,但尚未见对蚕蛹油乙酯系统安全性评价的相关报道。笔者参照GB 15193.1-2014《食品安全性毒理学评价程序》对蚕蛹油乙酯进行安全性评价[12],以望为蚕蛹油乙酯的开发利用提供一定的研究基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1受试物。蚕蛹油乙酯样品由南通福尔生物制品有限公司提供,样品通过蚕蛹油与食用乙醇酯进行交换反应得到,蚕蛹油乙酯的主要成分为亚麻酸乙酯。
1.1.2实验动物。SPF级昆明种小鼠和SD大鼠。
1.1.3试验菌株。鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102试验菌株,由湖南省疾病控防中心提供。
1.2主要试剂多氯联苯(分析纯);甲醇(分析纯);二甲基亚砜(DMSO,分析纯);血液生化指标检测试剂盒。
1.3主要仪器贝克曼DXC800全自动生化分析仪,美国;OLYMPUS 显微镜,型号为CH20,日本;梅特勒托利多电子分析天平,型号XPE105,瑞士;酶标仪Spectra Max M2,美国。
1.4试验方法
1.4.1小鼠经口急性毒性试验。试验参照GB 15193.1-2014《食品安全性毒理学评价程序》进行 [12],采用最大耐受剂量法。选用体重为18~22 g的SPF级昆明种小鼠20只,雌雄各半,一次经口灌胃, 灌胃后观察2周内死亡动物数及动物的机体健康情况。 1.4.2遗传毒性试验。
1.4.2.1Ames试验。参照GB 15193.1-2014《食品安全性毒理学评价程序》进行[12]。试验采用鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型试验菌株进行试验,设5 000、1 000、200、40和8 μg/皿5个剂量组,每个剂量3个重复,平行试验1次。
1.4.2.2小鼠骨髓细胞微核试验。参照GB 15193.1-2014《食品安全性毒理学评价程序》进行[12]。采用间隔24 h 2次经口灌胃法进行试验。以40 mg/(kg·bw)剂量的环磷酰胺为阳性对照,食用植物油为阴性对照。试验组高、中、低3个剂量分别为10.00、5.00和2.50 g/(kg·bw)。采用t检验进行统计与分析。
1.4.2.3小鼠精子畸变试验。参照GB 15193.1-2014《食品安全性毒理学评价程序》进行[12]。以40 mg/(kg·bw)剂量的环磷酰胺为阳性对照,以食用植物油为阴性对照。试验组高、中、低3个剂量分别为10.00、5.00和2.50 g/(kg·bw),相应剂量的受试液采用灌胃方式给小鼠给药。每天灌胃1次,连续5 d,于末次灌胃后的第30天处死动物,取双侧副睾,取精子制成涂片,染色后显微观察统计畸变精子发生率。
1.4.3大鼠30 d喂养试验。取SD大鼠80只,雌雄各半,将实验动物随机分为4组:对照组及3个受试物组,每组20只,雌雄各半。设置样品低、中、高剂量分别为1.25、2.50和5.00 g/(kg·bw)(相当于人体推荐剂量的25、50、100倍)。采取将样品掺入饲料中给样,对照组给予基础饲料,连续30 d。
眼内睑取血测定血红蛋白含量、红细胞计数及白细胞计数、白细胞分类等血液学指标。取血清测定天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(CHO)、总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)等生化指标。
1.4.4数据统计与分析。试验数据使用SPSS11.0统计软件进行统计与分析。
2结果与分析
2.1小鼠的急性经口毒性试验试验过程中试验组小鼠,采食、活动均未发现有显著影响。由表1可知,以17.56 g/(kg·bw)剂量的样品给不同性别的昆明种小鼠灌胃后未见明显中毒症状,14 d内无死亡。试验末将受试动物处死进行解剖检查,肝、脾、肾、胃、肠、心、肺等主要脏器,未见明显异常改变。样品对雌、雄昆明种小鼠的最大受剂量(MTD)大于17.56 g/(kg·bw)。根据《保健食品检验与评价技术规范》中的急性毒性分级标准,属无毒级[13]。
2.2遗传毒性试验
2.2.1Ames试验。供试品对TA97、TA98、TA100、TA102 标准菌株在有无S9混合液条件下均未引起基因组碱基置换或移码突变,与自发回变组相同(P >0.05),而与阳性对照组相比差异级显著(P < 0.01)。由表2可知,蚕蛹油乙酯样品的Ames试验结果为阴性。
2.2.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验。按照“1.4.2”中方法进行小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验。由表3可知,各剂量组微核率与阴性对照组相比均无显著性差异(P>0.05),而环磷酰胺组与阴性对照组相比有极显著性差异(P<0.01)。这表明蚕蛹油乙酯对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果为阴性。
2.3.2血液生化学测定结果。
由表7可知,各剂量组雌雄大鼠的总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、血糖、胆固醇及甘油三酯与对照组相比均无显著差异(P>0.05),说明产品未对大鼠血液生化指标产生显著影响。
3结论与讨论
蚕蛹油具有改善记忆、抗血栓形成和治疗高脂高糖诱导的大鼠脂肪性肝炎等作用,对蚕蛹油的研究已有不少报道[14-16]。蚕蛹油乙酯是从蚕蛹中提取蚕蛹油,再经过酯交换方法得到的,其主要成分为亚麻酸乙酯。笔者通过对蚕蛹油乙酯的安全性评价,结果表明蚕蛹油乙酯对昆明种雌、雄小鼠的最大耐受剂量(MTD)均大于17.56 g/(kg·bw),属于实际无毒级;遗传毒性试验(Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸变试验)结果均为阴性,说明蚕蛹油乙酯无遗传毒性;大鼠30 d喂饲期间动物生长发育良好,蚕蛹油乙酯对大鼠体重、血液生化指标等均无显著性影响(P>0.05)。综上所述,蚕蛹油乙酯属于无毒级产品,可长期服用。
参考文献
[1] 王彦平,刘洁,吴予明.蚕蛹的营养成分分析[J].郑州大学学报,2009,44(3):638-640.
[2] 邱英华,孙卫东,王玉海,等.蚕蛹蛋白提取与脱臭工艺研究[J].中国食品添加剂,2012(3):133-136.
[3] 许强华, 王伟, 杨玉英, 等.蚕蛹蛋白与畜禽肉蛋白营养差异比较与探讨[J].安徽农业科学,2014,42(6):1722-1723.
[4] 吴琼英,徐金玲,贾俊强,等.蚕蛹不同溶解性蛋白的营养学评价及酶解物对血管紧张素转换酶的抑制活性[J].蚕业科学,2011,37(2):352-357.
[5] 徐家玉, 吕晓华.蚕蛹蛋白缓解运动性疲劳的实验研究[J].现代预防医学,2005,35(12):2309-2313.
[6] 贾俊强,吴琼英,杜金娟,等. 超声波辅助水酶法提取蚕蛹油工艺优化及脂肪酸组成分[J].食品科学,2014,35(16):52-57.
[7] 潘文娟,方婷婷,廖爱美,等.不同蚕蛹油中脂肪酸的性状及组分分析[J].食品科学,2011,32 (4): 148-151.
[8] 张研宇, 李建科. 蚕蛹油提取、精炼及其脂肪酸组成分析[J].中国油脂,2010,35(6): 76-79.
[9] 张岫美,邓树海, 魏欣冰.蚕蛹油??-亚麻酸提取工艺研究和成分分析[J].中国生化药物杂志,2003,24(5):222-223.
[10] 张明春,韩克勤,张 媛,等.酶解与膜法联用制备蚕蛹生物功能活性肽[J],食品科学,2005,24(5):222-224.
[11] 施英,吴娱明,廖森泰,等. 蚕蛹油微胶囊的制备[J].蚕业科学,2010,36(5):875-878.
[12] 中华人民共和国卫生部.食品安全性毒理学评价程序:GB 15193.1-2003[S].北京:中国标准出版社,2004.
[13] 卫生部.保健食品检验与评价技术规范[S].中华人民共和国卫生部,2003:220.
[14] 郑鸿雁,昌友权,曲红光,等.蚕蛹油抗血栓形成作用研究[J].食品科学,2005,26(9):484-486.
[15] 彭欣莉,郑鸿雁,昌友权,等.蚕蛹油改善小鼠记忆作用的实验研究[J].食品科学,2005,26(9):490-493.
[16] 朱增燕,薛洁,亓志刚.蚕蛹油对高脂高糖诱导大鼠脂肪性肝炎的治疗作用研究[J].中国药理与临床,2012,28(3):86-91.