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[摘要] 目的 应用蝎形扩增阻滞突变系统（Scorpions-ARMS）检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因突变及其临床预测价值的研究。 方法 应用蝎型扩增阻滞突变系统（Scorpions-ARMS）检测非小细胞肺癌外周血中EGFR基因第18、19、20及21外显子突变，统计分析EGFR基因突变的相关因素。结果 50例非小细胞肺癌患者中，EGFR基因的突变率为30%（15/50）。 结果 EGFR基因的突变率47.4%（女性）明显高于19.4%（男性）。非吸烟患者EGFR突变率45.5%高于吸烟患者 17.9%，差异有统计学意义（P = 0.035）。在非小细胞肺癌患者中，腺癌患者EGFR 突变率40.6%明显高于非腺癌患者11.1%，差异有统计学意义（P = 0.029）。 结论 Scorpions-ARMS是检测血清游离DNA中EGFR基因突变的可靠有效方法。
[关键词] 非小细胞肺癌；基因突变；表皮生长因子受体；蝎形扩增阻滞突变系统
[中图分类号] R734.205 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）14-0001-02
肺癌是当今世界各国最常见的恶性肿瘤之一，是导致人类死亡的首要疾病和主要原因。由于初期肺癌患者缺乏明显的临床症状，近75%患者在进行首诊时病变已属晚期，失去根治性手术的机会。然而姑息性手术或辅助性治疗仅能部分改善症状，并未起到改善症状以及延长生命的作用[1]。吉非替尼和厄洛替尼等表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂可选择性地抑制EGFR酪氨酸激酶区的活化，阻断EGFR信号转导通路，可用于至少一次化疗失败后的局部晚期或转移性非小细胞肺癌的治疗。研究显示，EGFR基因突变状态能够预测EGFR-TKIs的治疗效果[3，4]。
近年来大量研究表明，外周血EGFR与组织EGFR两者突变检测具有较高的一致性，因此用外周血检测EGFR基因突变情况是切实可行的，并可以实时监测疾病进展，较早发现获得性耐药，以给予更好的治疗与预防[5-8]。目前，外周血EGFR突变检测方法主要有变性高效液相色谱法（DHPLC）、突变富集PCR、蝎形扩增阻滞突变系统（Scorpions-ARMS）以及微流体数字PCR技术等[9-11]。
Scorpions-ARMS因其具有高灵敏性和特异性，且操作简单快速，可作为检测EGFR突变的新型定量PCR方法。文献报道使用Scorpions-ARMS方法测定晚期肺癌患者血清和肿瘤组织EGFR基因检测的一致性可达到72.7%[12，13]。因此本研究采用敏感性高的Scorpions-ARMS技术，选择易于采集并能准确反映肿瘤组织状态的外周血作为标本进行研究。
1 资料与方法
1.1 临床资料
2011年6月～2012年6月我院收治并接受手术治疗的NSCLC患者50例。年龄25～78岁，中位年龄60岁；28例有吸烟史；根据ICC2009年新的第七版修订标准进行TNM分期，III期29例，IV期21例；按WHO肺癌组织分类标准进行组织分型，腺癌32例，鳞癌15例，大细胞肺癌2例，肺泡癌1例。
1.2 标本获取
取得患者及其家属知情同意后，清晨空腹抽取患者外周静脉血5 mL置于洁净EDTA抗凝管中，-80℃冰箱冻存备用。
1.3 DNA的提取
外周血DNA提取按照QIAGEN试剂盒说明进行。
1.4 Scorpions-ARMS检测EGFR基因突变
对提取的DNA进行EGFR基因突变检测采用DxS公司EGFR 29 Mutation Kit试剂盒和IQ5实时荧光定量PCR仪，按照DxS试剂盒的说明书步骤进行操作，对患者进行必要的结果观察。
1.5 统计学分析
将所有临床病理资料数据进行分析统计，应用SPSS 17.0 统计学软件，采用χ2检验对两组患者进行分析检验。
2 结果
2.1 NSCLC患者中EGFR基因突变检测结果
在50例NSCLC癌患者外周血血清标本中，共检测出EGFR基因突变15例（30%）。在这15例突变中，外显子19发生缺失突变有11例，外显子21发生突变有4例，为L858R点突变（见图1）。未检测到外显子18及20突变。
2.2 NSCLC患者中EGFR基因突变与临床病理特征之间的关系
在50例NSCLC癌患者外周血血清标本中，从结果可以得出，在临床特征方面：性别（男/女），组织学类型（腺癌/非腺癌）以及吸烟史（有/无）等方面的比较，差异具有统计学意义，而与年龄（≤60岁/>60岁）以及TNM分期（Ⅲ期/Ⅳ期）方面无关。见表1。
3 讨论
3.1 外周血EGFR基因突变检测可行性
EGFR基因突变检测的取材不一定仅限于从肿瘤组织获得，也可以从外周血中获取。癌细胞的凋亡、坏死以及从原发病灶脱落的微转移癌细胞为肺癌患者外周血中提供了源于肿瘤组织的遗传物质，进入血循环，且外周血EGFR突变的检测与组织EGFR突变检测具有较高的一致性，因此外周血用于检测EGFR基因的突变情况是切实可行的[14]。因此，本研究选取非小细胞肺癌患者外周血作为检测对象，患者属于临床分期Ⅲ期7例（24.1%），Ⅳ期8例（38.1%），说明癌细胞随着患者病情的发展，检测概率也会跟随检测基因进行跟踪，检测外周血EGFR基因突变，也是肿瘤发生突变的根据之一，为患者的治疗提供相关的证据，可以进一步减少肿瘤的复发、转移以及恶化，提高治愈率和生存率[15]。
3.2 Scorpions-ARMS技术的运用
目前DxS EGFR 29 Mutation Kit检测基因突变是公认的用来检测EGFR的最敏感方法，对突变检测的灵敏度可达1%。其核心技术为ARMS技术和Scorpion 技术的结合，Scorpion检测技术灵敏度更高。DxS EGFR 29 Mutation Kit可对EGFR基因突变的酪氨酸激酶区18-21外显子上的29种突变进行检测，Scorpions-ARMS结合实时定量PCR可以对样品中的微量基因突变进行检测，实现了高自动化、高灵敏度的目标。 3.3 EGFR基因突变的相关因素
本研究中EGFR基因突变可能与临床病理特征具有相关性，实验结果显示女性患者EGFR基因突变率高于男性患者，不吸烟患者EGFR基因突变率高于吸烟患者，以及腺癌患者的EGFR基因突变率显著高于非腺癌患者，差异有统计学意义，有待进一步研究和验证，考虑可能是本研究的样本量太小。游离DNA含量与原发肿瘤的分期密切相关，EGFR基因突变较多，分析原因可能是非小细胞肺癌晚期患者原发肿瘤较大，可能伴有远处转移的潜能以及从母体脱落入血的肿瘤细胞数目增加，导致主动入血的突变DNA含量增加，检出突变的可能性也随之增加。
4 展望
目前，Scorpions-ARMS技术因其具有高灵敏度和特异性，在短时间内即可检测出最常见的EGFR基因突变，同时具有操作简单快速的优势，现已成为肿瘤个体化分子检测最重要、最先进的技术之一，现已作为EGFR突变的常规检测方法，在临床实践中得以应用和开展。
[参考文献]
[1] 华胸怀，张瑞祥，李印. EGFR基因突变与非小细胞肺癌分子靶向治疗的研究现况[J]. 临床肺科杂志，2012，17（1）：117-119.
[2] 王荣，石冬琴，谢华. 非小细胞肺癌中EGFR基因突变及靶向药物治疗研究进展[J]. 中国药理学通报，2013，29（1）：22-26.
[3] Naoya Nagata，Motonori Miyakawa，Seiji Amano，et al. Design and synthesis of tricyclic tetrahydroquinolines as a new series of nonsteroidal selective androgen receptor modulators（SARMs）[J]. Bioorganic
[关键词] 非小细胞肺癌；基因突变；表皮生长因子受体；蝎形扩增阻滞突变系统
[中图分类号] R734.205 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）14-0001-02
肺癌是当今世界各国最常见的恶性肿瘤之一，是导致人类死亡的首要疾病和主要原因。由于初期肺癌患者缺乏明显的临床症状，近75%患者在进行首诊时病变已属晚期，失去根治性手术的机会。然而姑息性手术或辅助性治疗仅能部分改善症状，并未起到改善症状以及延长生命的作用[1]。吉非替尼和厄洛替尼等表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂可选择性地抑制EGFR酪氨酸激酶区的活化，阻断EGFR信号转导通路，可用于至少一次化疗失败后的局部晚期或转移性非小细胞肺癌的治疗。研究显示，EGFR基因突变状态能够预测EGFR-TKIs的治疗效果[3，4]。
近年来大量研究表明，外周血EGFR与组织EGFR两者突变检测具有较高的一致性，因此用外周血检测EGFR基因突变情况是切实可行的，并可以实时监测疾病进展，较早发现获得性耐药，以给予更好的治疗与预防[5-8]。目前，外周血EGFR突变检测方法主要有变性高效液相色谱法（DHPLC）、突变富集PCR、蝎形扩增阻滞突变系统（Scorpions-ARMS）以及微流体数字PCR技术等[9-11]。
Scorpions-ARMS因其具有高灵敏性和特异性，且操作简单快速，可作为检测EGFR突变的新型定量PCR方法。文献报道使用Scorpions-ARMS方法测定晚期肺癌患者血清和肿瘤组织EGFR基因检测的一致性可达到72.7%[12，13]。因此本研究采用敏感性高的Scorpions-ARMS技术，选择易于采集并能准确反映肿瘤组织状态的外周血作为标本进行研究。
1 资料与方法
1.1 临床资料
2011年6月～2012年6月我院收治并接受手术治疗的NSCLC患者50例。年龄25～78岁，中位年龄60岁；28例有吸烟史；根据ICC2009年新的第七版修订标准进行TNM分期，III期29例，IV期21例；按WHO肺癌组织分类标准进行组织分型，腺癌32例，鳞癌15例，大细胞肺癌2例，肺泡癌1例。
1.2 标本获取
取得患者及其家属知情同意后，清晨空腹抽取患者外周静脉血5 mL置于洁净EDTA抗凝管中，-80℃冰箱冻存备用。
1.3 DNA的提取
外周血DNA提取按照QIAGEN试剂盒说明进行。
1.4 Scorpions-ARMS检测EGFR基因突变
对提取的DNA进行EGFR基因突变检测采用DxS公司EGFR 29 Mutation Kit试剂盒和IQ5实时荧光定量PCR仪，按照DxS试剂盒的说明书步骤进行操作，对患者进行必要的结果观察。
1.5 统计学分析
将所有临床病理资料数据进行分析统计，应用SPSS 17.0 统计学软件，采用χ2检验对两组患者进行分析检验。
2 结果
2.1 NSCLC患者中EGFR基因突变检测结果
在50例NSCLC癌患者外周血血清标本中，共检测出EGFR基因突变15例（30%）。在这15例突变中，外显子19发生缺失突变有11例，外显子21发生突变有4例，为L858R点突变（见图1）。未检测到外显子18及20突变。
2.2 NSCLC患者中EGFR基因突变与临床病理特征之间的关系
在50例NSCLC癌患者外周血血清标本中，从结果可以得出，在临床特征方面：性别（男/女），组织学类型（腺癌/非腺癌）以及吸烟史（有/无）等方面的比较，差异具有统计学意义，而与年龄（≤60岁/>60岁）以及TNM分期（Ⅲ期/Ⅳ期）方面无关。见表1。
3 讨论
3.1 外周血EGFR基因突变检测可行性
EGFR基因突变检测的取材不一定仅限于从肿瘤组织获得，也可以从外周血中获取。癌细胞的凋亡、坏死以及从原发病灶脱落的微转移癌细胞为肺癌患者外周血中提供了源于肿瘤组织的遗传物质，进入血循环，且外周血EGFR突变的检测与组织EGFR突变检测具有较高的一致性，因此外周血用于检测EGFR基因的突变情况是切实可行的[14]。因此，本研究选取非小细胞肺癌患者外周血作为检测对象，患者属于临床分期Ⅲ期7例（24.1%），Ⅳ期8例（38.1%），说明癌细胞随着患者病情的发展，检测概率也会跟随检测基因进行跟踪，检测外周血EGFR基因突变，也是肿瘤发生突变的根据之一，为患者的治疗提供相关的证据，可以进一步减少肿瘤的复发、转移以及恶化，提高治愈率和生存率[15]。
3.2 Scorpions-ARMS技术的运用
目前DxS EGFR 29 Mutation Kit检测基因突变是公认的用来检测EGFR的最敏感方法，对突变检测的灵敏度可达1%。其核心技术为ARMS技术和Scorpion 技术的结合，Scorpion检测技术灵敏度更高。DxS EGFR 29 Mutation Kit可对EGFR基因突变的酪氨酸激酶区18-21外显子上的29种突变进行检测，Scorpions-ARMS结合实时定量PCR可以对样品中的微量基因突变进行检测，实现了高自动化、高灵敏度的目标。 3.3 EGFR基因突变的相关因素
本研究中EGFR基因突变可能与临床病理特征具有相关性，实验结果显示女性患者EGFR基因突变率高于男性患者，不吸烟患者EGFR基因突变率高于吸烟患者，以及腺癌患者的EGFR基因突变率显著高于非腺癌患者，差异有统计学意义，有待进一步研究和验证，考虑可能是本研究的样本量太小。游离DNA含量与原发肿瘤的分期密切相关，EGFR基因突变较多，分析原因可能是非小细胞肺癌晚期患者原发肿瘤较大，可能伴有远处转移的潜能以及从母体脱落入血的肿瘤细胞数目增加，导致主动入血的突变DNA含量增加，检出突变的可能性也随之增加。
4 展望
目前，Scorpions-ARMS技术因其具有高灵敏度和特异性，在短时间内即可检测出最常见的EGFR基因突变，同时具有操作简单快速的优势，现已成为肿瘤个体化分子检测最重要、最先进的技术之一，现已作为EGFR突变的常规检测方法，在临床实践中得以应用和开展。
[参考文献]
[1] 华胸怀，张瑞祥，李印. EGFR基因突变与非小细胞肺癌分子靶向治疗的研究现况[J]. 临床肺科杂志，2012，17（1）：117-119.
[2] 王荣，石冬琴，谢华. 非小细胞肺癌中EGFR基因突变及靶向药物治疗研究进展[J]. 中国药理学通报，2013，29（1）：22-26.
[3] Naoya Nagata，Motonori Miyakawa，Seiji Amano，et al. Design and synthesis of tricyclic tetrahydroquinolines as a new series of nonsteroidal selective androgen receptor modulators（SARMs）[J]. Bioorganic