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【摘 要】 目的：优选葎草中木犀草苷和芦丁的最佳提取工艺。方法：采用正交实验法，以乙醇浓度、乙醇用量、提取次数、提取时间为考察因素；采用UPLC以木犀草苷和芦丁为考察指标进行含量测定，色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100mm×2.1mm，1.7μm）；流动相：甲醇- 1%冰醋酸溶液（28∶72）；流速：0.15ml/min；检测波长：350nm；柱温：30℃。结果：木犀草苷和芦丁的质量浓度分别在25.8～645μg和12.5～313.2μg范围内与峰面积具有良好的线性关系；最佳提取工艺为加25ml 75%乙醇，回流提取三次，每次1h；影响提取的主次因素为：乙醇浓度>提取次数>提取时间>乙醇用量。工艺验证结果：木犀草苷和芦丁的平均总量为0.267mg/g。结论：优选的提取工艺稳定、可行，有效成分提取率高。
【关键词】 葎草；木犀草苷；芦丁；正交试验；提取工艺
【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）06-0016-04
葎草为桑科植物葎草Humulus scandens （ Lour.） Merr.的全草，別名拉拉秧、锯子草、五爪龙、降龙草等[1]，始载于《唐本草》[2-3]。葎草为一年或多年生草本，除青海、新疆以外，全国各地均有分布，另外东北亚、北美洲也有分布[4]。葎草含有黄酮类、萜类、挥发油类、甾体等化合物[5-7]，具有清热解毒、利尿通淋功效，主治肺热咳嗽、肺痈、虚热烦渴、热淋、水肿、小便不利、湿热泻痢、热毒疮疡、皮肤瘙痒等症[8-9]。目前，葎草的研究主要集中在紫外分光光度法测定葎草中总黄酮的量及HPLC法测定葎草中木犀草素和木犀草苷的含量[10-12]，为更好的控制葎草质量，本文以葎草的有效成分木犀草苷和芦丁为考察指标，采用正交实验法对葎草的提取工艺进行考察，筛选出最佳提取工艺。为以后建立更加全面可靠的葎草质量标准奠定研究基础。
1 仪器与材料
1.1 仪器 超高液相色谱仪（Waters Acquity UPLC H-Class系统，包括四元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、PDA检测器和Empower3数据处理工作站，美国waters）；AE240电子天平（上海梅特勒有限公司）；AB204-S分析天平（上海台衡仪器仪表有限公司）；R-200旋转蒸发仪（瑞士步琦公司）；HS10260D型超声波清洗器（天津奥泰仪器有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（上海浦东物理光学仪器厂）。
1.2 材料 葎草采自贵阳市花溪区十里河滩，经贵阳中医学院生药教研室王祥培教授鉴定为Humulus scandens （ Lour.） Merr.；木犀草苷对照品（批号“111720-201106 ）、芦丁对照品（批号：0080-97050，纯度：98.6%）均购中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯，美国Tedia公司）；水为纯净水；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备 精密称定对照品木犀草苷、芦丁适量，加甲醇适量制成每毫升含木犀草苷25.8μg，含芦丁12.5μg的对照品溶液，备用。
2.2 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100mm×2.1mm，1.7μm）；流动相：甲醇-1%冰醋酸溶液（28∶72）；流速：0.15ml/min；检测波长：350nm；柱温：30℃；进样量：1μl。木犀草苷和芦丁与相邻峰的分离度均大于1.5。UPLC色谱图如下。
2.3 线性关系与灵敏度 分别精密吸取上述木犀草苷对照品溶液（25.8μg/ml）、芦丁对照品溶液（12.5μg/ml）0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μl ，在上述色谱条件下进样，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，得出木犀草苷线性回归方程：Y=2.4×107X-16133（r=0.9998）；芦丁线性回归方程：Y=1.0×107X-2418.8（ r=0.9998），结果表明，木犀草苷和芦丁质量浓度分别在25.8～645μg和12.5～313.2μg范围内与峰面积具有良好的线性关系。以3倍信噪比（S/N）对应分析物浓度作为检出限（LOD），木犀草苷LOD为310.8×10-3μg/ml，芦丁LOD为150.6×10-3μg/ml；以10倍信噪比（S/N）对应分析物浓度作为定量限（LOQ），木犀草苷LOQ为1036×10-3μg/ml，芦丁LOQ为502×10-3μg/ml。
2.4 供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）约1.6g，精密称定，置具塞圆底烧瓶中，精密加入75%乙醇25ml，密塞，称定重量，回流提取40min，放冷，再称定重量，用75%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。进样前用0.22μm微孔滤膜过滤，吸取1μl，注入超高液相色谱仪，照前述色谱条件进行测定。
2.5 精密度 取木犀草苷和芦丁对照品溶液，连续进样6次，，每次进样1μl，分别测定峰面积，其中木犀草苷的峰面积RSD为1.32%，芦丁的峰面积RSD为1.86%，表明仪器精密度良好。木犀草苷和芦丁的平均回收率分别为98.28%和99.35%，RSD分别为2.94%和2.94。
2.6 葎草提取工艺的设计
2.6.1 正交试验设计 参考文献[12]，确定用乙醇为提取溶剂，采用回流提取方法，选择提取工艺中对提取含量有影响的四项因素，即乙醇浓度A，乙醇用量B，提取次数C，提取时间D。以木犀草苷和芦丁的总提取含量为评价标准，每个因素选择3个水平，采用四因素三水平正交试验表L9（34）设计试验方案，见表4。
2.6.2 正交试验方案及结果 由正交试验结果（见表5）和方差分析（见表6）可知：乙醇浓度、提取次数、提取时间对实验结果的差异具有统计学意义，而乙醇用量对实验结果差异无统计学意义，4个因素对实验结果影响大小：乙醇浓度>提取次数>提取时间>乙醇用量，四因素最优水平组合是A2B1C3D2，即加25ml 75%乙醇回流提取3次每次1h。 2.6.3 验证试验 取同一批药材粉末，平行称取三份，每份约1.6g，按最佳提取工艺A2B1C3D2进行验证试验，测定葎草中木犀草苷和芦丁的含量，结果三份药材中木犀草苷和芦丁的总量分别为0.258、0.279、0.263mg/g，因此木犀草苷和芦丁的平均总量为0.267mg/g。工艺验证结果表明，通过正交实验设计得到的葎草中木犀草苷和芦丁的提取率较高、工艺稳定、科学合理。
综上可知，供试液的制备方法为：取葎草粉末（过三号筛）约1.6g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入75%乙醇25ml，加热回流提取三次，每次1h，滤过，合并三次滤液，用旋转蒸发仪浓缩近干，将浓缩液转移至10ml容量瓶中，加75%乙醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，经0.22μm滤膜过滤，即得。
3 讨论
3.1 木犀草苷和芦丁是葎草的有效成分，实验通过正交试验设计确定了葎草中木犀草苷和芦丁的显著性影响因素，其中四因素中乙醇浓度是影响最大的因素，其次是提取次数、提取时间，乙醇用量对实验结果没有影响，本实验为以后葎草木犀草苷和芦丁的含量测定提供了最佳提取制备方法。
3.2 在葎草指标性成分选择中，先后选择了木犀草素、大波斯菊苷、木犀草苷、芦丁等，结果木犀草素和大波斯菊苷的含量都很低，测定木犀草素在提取过程中需要水解，时间相对较长，通过比较最后选择以木犀草苷和芦丁为指标性成分。
3.3 本文通过UPLC法对葎草的提取工艺进行研究，UPLC与HPLC相比，具有分析效率更高、分析时间更短、分离能力更强、灵敏度更高的优点，为今后UPLC法测定葎草的含量提供了依据。
参考文献
[1] 陈再兴， 孟舒. 葎草研究进展[J]. 中国药事， 2011，25（2）：175-179.
[2] 候宽昭.中国种子植物科属词典[M].北京：科学出版社，1984：238.
[3] 李俊婕， 王晓静. 葎草的研究进展[J].齐鲁药事，2007，26（6）：353-355.
[4] 徐保磊，蒋建勤.葎草乙酸乙酯部位化学成分研究[J].药学与临床研究，2014，22（2）：124-127.
[5] 何顺志，徐文芬.贵州中草药资源研究[M].贵阳：贵州科技出版社，2007：2291.
[6] 尹海波，王颖，郑太坤，等.中国葎草属植物的研究进展[J].辽宁中医学院学报，2001，3（1） ：60-61.
[7] 靳凤云，赵留存，章誉，等.HS-SPEM-GC-MS法分析黔产葎草花干品和鲜品挥发性成分[J].中国药房，2014，25（31）： 2931-2934.
[8] 曹莉.葎草的化学成分研究[J].中国民族民间医药，2012，21（11）： 24-25.
[9] 彭小冰，邵进明，刘炳新，等.葎草鲜品不同部位的挥发油成分及含量[J].贵州农业科学，2014，42（4）： 178-181.
[10] 陳伟光，盛静，林霞，等.正交设计研究葎草中总黄酮提取工艺[J].时珍国医国药，2007，18（3）： 551-552.
[11] 张丹，曹纬国，王刚.西南地区不同居群葎草中总黄酮与木犀草素的含量分析[J].时珍国医国药，2010，21（8）： 1934-1936.
[12] 喻微，赵留存，吴家红，等.HPLC法测定黔产葎草中木犀草苷的含量[J].贵阳中医学院学报，2014，36（5）： 38-41.
（收稿日期：2015.12.30）
【关键词】 葎草；木犀草苷；芦丁；正交试验；提取工艺
【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）06-0016-04
葎草为桑科植物葎草Humulus scandens （ Lour.） Merr.的全草，別名拉拉秧、锯子草、五爪龙、降龙草等[1]，始载于《唐本草》[2-3]。葎草为一年或多年生草本，除青海、新疆以外，全国各地均有分布，另外东北亚、北美洲也有分布[4]。葎草含有黄酮类、萜类、挥发油类、甾体等化合物[5-7]，具有清热解毒、利尿通淋功效，主治肺热咳嗽、肺痈、虚热烦渴、热淋、水肿、小便不利、湿热泻痢、热毒疮疡、皮肤瘙痒等症[8-9]。目前，葎草的研究主要集中在紫外分光光度法测定葎草中总黄酮的量及HPLC法测定葎草中木犀草素和木犀草苷的含量[10-12]，为更好的控制葎草质量，本文以葎草的有效成分木犀草苷和芦丁为考察指标，采用正交实验法对葎草的提取工艺进行考察，筛选出最佳提取工艺。为以后建立更加全面可靠的葎草质量标准奠定研究基础。
1 仪器与材料
1.1 仪器 超高液相色谱仪（Waters Acquity UPLC H-Class系统，包括四元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、PDA检测器和Empower3数据处理工作站，美国waters）；AE240电子天平（上海梅特勒有限公司）；AB204-S分析天平（上海台衡仪器仪表有限公司）；R-200旋转蒸发仪（瑞士步琦公司）；HS10260D型超声波清洗器（天津奥泰仪器有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（上海浦东物理光学仪器厂）。
1.2 材料 葎草采自贵阳市花溪区十里河滩，经贵阳中医学院生药教研室王祥培教授鉴定为Humulus scandens （ Lour.） Merr.；木犀草苷对照品（批号“111720-201106 ）、芦丁对照品（批号：0080-97050，纯度：98.6%）均购中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯，美国Tedia公司）；水为纯净水；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备 精密称定对照品木犀草苷、芦丁适量，加甲醇适量制成每毫升含木犀草苷25.8μg，含芦丁12.5μg的对照品溶液，备用。
2.2 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100mm×2.1mm，1.7μm）；流动相：甲醇-1%冰醋酸溶液（28∶72）；流速：0.15ml/min；检测波长：350nm；柱温：30℃；进样量：1μl。木犀草苷和芦丁与相邻峰的分离度均大于1.5。UPLC色谱图如下。
2.3 线性关系与灵敏度 分别精密吸取上述木犀草苷对照品溶液（25.8μg/ml）、芦丁对照品溶液（12.5μg/ml）0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μl ，在上述色谱条件下进样，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，得出木犀草苷线性回归方程：Y=2.4×107X-16133（r=0.9998）；芦丁线性回归方程：Y=1.0×107X-2418.8（ r=0.9998），结果表明，木犀草苷和芦丁质量浓度分别在25.8～645μg和12.5～313.2μg范围内与峰面积具有良好的线性关系。以3倍信噪比（S/N）对应分析物浓度作为检出限（LOD），木犀草苷LOD为310.8×10-3μg/ml，芦丁LOD为150.6×10-3μg/ml；以10倍信噪比（S/N）对应分析物浓度作为定量限（LOQ），木犀草苷LOQ为1036×10-3μg/ml，芦丁LOQ为502×10-3μg/ml。
2.4 供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）约1.6g，精密称定，置具塞圆底烧瓶中，精密加入75%乙醇25ml，密塞，称定重量，回流提取40min，放冷，再称定重量，用75%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。进样前用0.22μm微孔滤膜过滤，吸取1μl，注入超高液相色谱仪，照前述色谱条件进行测定。
2.5 精密度 取木犀草苷和芦丁对照品溶液，连续进样6次，，每次进样1μl，分别测定峰面积，其中木犀草苷的峰面积RSD为1.32%，芦丁的峰面积RSD为1.86%，表明仪器精密度良好。木犀草苷和芦丁的平均回收率分别为98.28%和99.35%，RSD分别为2.94%和2.94。
2.6 葎草提取工艺的设计
2.6.1 正交试验设计 参考文献[12]，确定用乙醇为提取溶剂，采用回流提取方法，选择提取工艺中对提取含量有影响的四项因素，即乙醇浓度A，乙醇用量B，提取次数C，提取时间D。以木犀草苷和芦丁的总提取含量为评价标准，每个因素选择3个水平，采用四因素三水平正交试验表L9（34）设计试验方案，见表4。
2.6.2 正交试验方案及结果 由正交试验结果（见表5）和方差分析（见表6）可知：乙醇浓度、提取次数、提取时间对实验结果的差异具有统计学意义，而乙醇用量对实验结果差异无统计学意义，4个因素对实验结果影响大小：乙醇浓度>提取次数>提取时间>乙醇用量，四因素最优水平组合是A2B1C3D2，即加25ml 75%乙醇回流提取3次每次1h。 2.6.3 验证试验 取同一批药材粉末，平行称取三份，每份约1.6g，按最佳提取工艺A2B1C3D2进行验证试验，测定葎草中木犀草苷和芦丁的含量，结果三份药材中木犀草苷和芦丁的总量分别为0.258、0.279、0.263mg/g，因此木犀草苷和芦丁的平均总量为0.267mg/g。工艺验证结果表明，通过正交实验设计得到的葎草中木犀草苷和芦丁的提取率较高、工艺稳定、科学合理。
综上可知，供试液的制备方法为：取葎草粉末（过三号筛）约1.6g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入75%乙醇25ml，加热回流提取三次，每次1h，滤过，合并三次滤液，用旋转蒸发仪浓缩近干，将浓缩液转移至10ml容量瓶中，加75%乙醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，经0.22μm滤膜过滤，即得。
3 讨论
3.1 木犀草苷和芦丁是葎草的有效成分，实验通过正交试验设计确定了葎草中木犀草苷和芦丁的显著性影响因素，其中四因素中乙醇浓度是影响最大的因素，其次是提取次数、提取时间，乙醇用量对实验结果没有影响，本实验为以后葎草木犀草苷和芦丁的含量测定提供了最佳提取制备方法。
3.2 在葎草指标性成分选择中，先后选择了木犀草素、大波斯菊苷、木犀草苷、芦丁等，结果木犀草素和大波斯菊苷的含量都很低，测定木犀草素在提取过程中需要水解，时间相对较长，通过比较最后选择以木犀草苷和芦丁为指标性成分。
3.3 本文通过UPLC法对葎草的提取工艺进行研究，UPLC与HPLC相比，具有分析效率更高、分析时间更短、分离能力更强、灵敏度更高的优点，为今后UPLC法测定葎草的含量提供了依据。
参考文献
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[9] 彭小冰，邵进明，刘炳新，等.葎草鲜品不同部位的挥发油成分及含量[J].贵州农业科学，2014，42（4）： 178-181.
[10] 陳伟光，盛静，林霞，等.正交设计研究葎草中总黄酮提取工艺[J].时珍国医国药，2007，18（3）： 551-552.
[11] 张丹，曹纬国，王刚.西南地区不同居群葎草中总黄酮与木犀草素的含量分析[J].时珍国医国药，2010，21（8）： 1934-1936.
[12] 喻微，赵留存，吴家红，等.HPLC法测定黔产葎草中木犀草苷的含量[J].贵阳中医学院学报，2014，36（5）： 38-41.
（收稿日期：2015.12.30）