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【摘要】重组百日咳毒素s1亚基基因的质粒在大肠杆菌DH5α和TOP10的两种菌株中表达，并初步纯化了表达产物。从用粗rS1免疫的家兔获得的血清用于通过HP-PT包被的ELISA测定效价并进行被动免疫保护试验。在发酵罐中培养百日咳杆菌CS菌株后，通过热萃取，硫酸铵分级沉淀和离子交换色谱法获得纯化的PRN，并测试了纯化的PRN的纯度和生物学特性。各种测试表明，纯化的PRN的纯度超过95%，其相对分子量和等电点与标准PRN一致。随着pH值继续上升，PT活性开始下降。 FHA活性和凝血功效显示出相似的变化，通过测量培养基的pH值以确定何时收获，可以获得富含PT和FHA并保持高水平活性的培养基。
【关键词】百日咳杆菌;高活茵数;发酵培养
【中图分类号】R392-33 【文献标识码】B 【文章编号】2096-7225（2020）07-0021-02
引言
百日咳是由革兰氏阴性细菌百日咳杆菌引起的细菌性呼吸道感染。主要的临床症状是持续数周的咳嗽。这种疾病在婴儿和幼儿中最严重。许多儿童患有严重的阵发性咳嗽，导致营养不良，呼吸暂停，肺炎和脑炎，有些儿童死亡。因此，自1980年代以来，包括日本，中国，美国和意大利在内的世界许多国家不断开发出一种含有百日咳细菌各种活性成分的无细胞百日咳疫苗。研究结果表明，百日咳杆菌特异性细胞免疫的产生与百日咳杆菌对呼吸道感染的抗性获得有关[1]。在这项研究中，根据发酵24小时后存活细菌的数量，研究了混合发酵的最佳工艺条件，并提供了百日咳杆菌有效免疫原发酵培养的参考数据。
1 材料和方法
1.1菌种
采用百日咳C.SI相菌株。
1.2培养基
采用改良的S-S液体培养基。
1.3发酵液吸光度值的测定
将发酵液用无菌水稀释（发酵液：无菌水=1：2），混合并离心（5℃，5000g，8分钟），沉淀用无菌盐水洗涤1-3次，然后以1：1的比例将细菌重悬在生理盐水中。使用生理盐水作为空白对照，在510nm下测量样品的吸光度，并且使每个样品为三个平行。
1.4免疫血清制备
使用完全福氏补充剂（家兔1和2）和AI（OH）3通过腹股沟（家兔3和4）使家兔敏感。1周后，將rS1粗品与佐剂（830μg/只）混合以继续免疫，免疫后6天，福氏不完全佐剂和A1（OH）3 +抗原继续免疫1000μg/只。两周后，通过耳静脉添加了两次疫苗。第一个为100μg/只，第二个为200μg/只，间隔一周。免疫后3天通过HP-PT-ELISA测定血清滴度[2]。
1.5小鼠免疫保护的特异性试验
为进一步确定抗血清的特异性，将0.5 mL的GST-PC兔抗血清与50μg天然PRN蛋白均匀混合，并以5 mL恒定体积加入PBS，稀释5倍，然后在36°C下稀释5倍35分钟。发酵后，PRN-ELISA方法测量两种抗体的水平。之后，腹膜内注射在5只小鼠中培养的血清（0.5mL /小鼠）。以相同的方式治疗兔GST-PRN抗血清，并注射4只小鼠。1.5小时后，对所有小鼠进行腹膜内10LD50（4.4x106CFU）HH0809攻击，观察1个月内的发病率和死亡，并立即对死小鼠进行尸检以分离并确认病原体。
2 结果
2.1 细菌生长曲线和pH与溶解氧的动态
延长了培养时间，细菌的浓度逐渐增加。在24小时变化中，细菌浓度为45亿/ml，并且在培养48小时结束时确定细菌浊度为280亿/ml。同时，随着延长的培养时间和细菌的生长，细菌液体和溶解氧的pH值也继续上升。培养开始时，培养液的pH为7.5。40小时后，pH值可达到8.017（图1）。其中，FHA的活性在培养过程中的变化与PT相似，但FHA活性出现最高峰较PT滞后2-3 h（图2）。
2.2 血凝滴度的动态
在培养开始时，培养上清液的血凝滴度为1：3，当细菌浓度达到90亿/ml时，血凝滴度开始上升。当细菌浓度达到230亿/毫升时，在FHA活性最高时，凝血滴度可以达到1：452的最大值，培养基的pH值增加，FHA活性降低，并且凝血滴度也开始下降至1：24（图3）。
2.3 培养条件与菌形和血清学特异性的关系
从8小时培养开始到48小时结束时采集样品以测量血清凝集效价，结果均为1：13600，表明菌株在培养过程中保持稳定而没有相变。取样染色，革兰氏染色，奥林巴斯光学显微镜，百日咳细菌是典型的球状杆菌，未发现细菌污染。
3 讨论
乳酸杆菌已被证明能够从人体中清除过量的自由基，并具有抗氧化和抗衰老的作用。抗氧化剂主要是酶和其他代谢产物，这些产品在乳酸菌细胞内部和外部具有不同的分布[3]，它也与有氧和厌氧生长环境有关[4]。因此，人们试图使用基因工程方法来增加PT的产量，或进一步开发基因工程百日咳疫苗或亚单位疫苗。研究表明，PRN的不同区域包含一些表位，因此它们都可以具有特定的免疫原性。然而，基于动物免疫保护试验尚未证实PRN多肽片段的免疫原性。目前，大多数PRN的外部提取均使用基因缺失菌株，例如PT缺失突变W28Aptx，FHA和Agg缺失突变Bp353。我国对PRN的研究利用了全基因的CS菌株，通过共纯化硫酸铵沉淀和蔗糖密度梯度离心来纯化PRN，同时纯化PrI1和FHA保护性抗原。在大规模发酵罐中表达工程菌之前，必须检查质粒的稳定性，以确保外源基因在宿主细胞中一致且稳定地表达，并且每批的产量和活性均保持一致。
各种测试指标的综合分析表明，百日咳杆菌的生长和培养pH值，溶解氧，FHA活性和凝血滴度，溶解氧，CO2压力等检测指标均发生了变化。dOMP免疫小鼠血清抗体滴度的动态变化表明，单免疫动物的特异性抗体滴度较低，保留时间较短，且抗体类型主要为IgM。同样，厌氧培养物的抗菌作用远大于需氧培养物。因此，在细胞分裂过程中随机产生携带这些突变的细胞的可能性非常低，但这些细胞生长迅速，最终取代了正常宿主细胞，并在持续增殖后被培养。另外，免疫血清的保护速率是剂量依赖性的，并且与血清抗体滴度相关，如通过ELSA测量的，表明抗rS1血清具有中和PT毒性的作用。 在有关进行的抗凝集素抗体应答研究表明，在传统百日咳疫苗接种后，较高的抗体滴度导致较低的抗体应答。实际上，在正常使用过程中产生高水平凝集抗体和低水平抗PT抗体的百日咳细胞疫苗不如产生高水平抗PT抗体的疫苗有效。由于ELSA可以测量特异性反应抗体与PT结合的能力，因此可以推断出，抗rS1抗血清对小鼠的被动保护能力源于门的结合作用。正在进行研究以评估细胞免疫力和疫苗功效数据之间的关系，但尚未获得结果，因此无法与血清学研究进行比较。因此，在培养过程中通过取样确定pH值来确定停止时间更加方便和准确。
自发感染百日咳后，免疫反應不能消除细菌，但是持续感染会导致呼吸道粘膜免疫病理损害。但是，许多实验表明，免疫可以预防或治疗百日咳，这表明在有效接种疫苗后，机体可以诱导出家兔的保护性反应[5]。这表明PRN的C末端蛋白肽保留了PRN的大部分免疫原性。同时，在预防足部感染中阻断感染机制的关键环节表明，可以完全预防口蹄疫。对无细胞百日咳疫苗的免疫反应不取决于免疫前抗体的效价，无论免疫前的抗PT抗体滴度如何，无细胞百日咳疫苗均可诱导高抗PT抗体滴度。尚不清楚无细胞百日咳疫苗的PT免疫原性是否较高，是否还没有全细胞疫苗的其他成分或尚未发现的其他因素。在存在PRN或PRNF/IM的情况下，FHA不能显着减轻疾病，但并不表明FHA不是保护性抗原。期望rs1将是百日咳基因工程亚单位疫苗的保护性抗原，并且具有良好的适用性，且在提高rs1的纯度之后，免疫保护功能将进一步提高。
综上所述，百日咳多亚基粘膜佐剂疫苗的免疫保护机制的深入研究可能解决了如何选择更好的抗原组合和更理想的免疫途径的问题。此外，更广泛，科学和严格的动物测试结果将为下一次人体实验打下良好基础，从而有可能彻底预防和消除百日咳。
参考文献：
[1] 胡业勤， 段凯， 李新国， et al. 组分无细胞百日咳疫苗纯化新工艺的建立[J]. 中国新药杂志， 2018， 027（021）：2498-2504.
[2] 高晶晶， 李鑫， 乔瑞洁， et al. 百日咳小鼠呼吸道感染模型的建立与应用[J]. 微生物学免疫学进展， 2018， 46（05）：34-41.
[3] 邓继岿， 王红梅， 田树凤. 儿童百日咳的临床特点及实验室诊断[J]. 中华实用儿科临床杂志， 2017， 032（022）：P.1692-1695.
[4] None. Incidence and Burden of Pertussis Among Infants Less Than 1 Year of Age： ERRATUM[J]. The Pediatric Infectious Disease Journal， 2017， 36（4）：443.
[5] 鲍永毅， 陈晓， 牛明福， et al. 茵陈内生细菌的分离鉴定与抑菌活性成分分析[J]. 天然产物研究与开发， 2019， 031（011）： 1919-1927.
【关键词】百日咳杆菌;高活茵数;发酵培养
【中图分类号】R392-33 【文献标识码】B 【文章编号】2096-7225（2020）07-0021-02
引言
百日咳是由革兰氏阴性细菌百日咳杆菌引起的细菌性呼吸道感染。主要的临床症状是持续数周的咳嗽。这种疾病在婴儿和幼儿中最严重。许多儿童患有严重的阵发性咳嗽，导致营养不良，呼吸暂停，肺炎和脑炎，有些儿童死亡。因此，自1980年代以来，包括日本，中国，美国和意大利在内的世界许多国家不断开发出一种含有百日咳细菌各种活性成分的无细胞百日咳疫苗。研究结果表明，百日咳杆菌特异性细胞免疫的产生与百日咳杆菌对呼吸道感染的抗性获得有关[1]。在这项研究中，根据发酵24小时后存活细菌的数量，研究了混合发酵的最佳工艺条件，并提供了百日咳杆菌有效免疫原发酵培养的参考数据。
1 材料和方法
1.1菌种
采用百日咳C.SI相菌株。
1.2培养基
采用改良的S-S液体培养基。
1.3发酵液吸光度值的测定
将发酵液用无菌水稀释（发酵液：无菌水=1：2），混合并离心（5℃，5000g，8分钟），沉淀用无菌盐水洗涤1-3次，然后以1：1的比例将细菌重悬在生理盐水中。使用生理盐水作为空白对照，在510nm下测量样品的吸光度，并且使每个样品为三个平行。
1.4免疫血清制备
使用完全福氏补充剂（家兔1和2）和AI（OH）3通过腹股沟（家兔3和4）使家兔敏感。1周后，將rS1粗品与佐剂（830μg/只）混合以继续免疫，免疫后6天，福氏不完全佐剂和A1（OH）3 +抗原继续免疫1000μg/只。两周后，通过耳静脉添加了两次疫苗。第一个为100μg/只，第二个为200μg/只，间隔一周。免疫后3天通过HP-PT-ELISA测定血清滴度[2]。
1.5小鼠免疫保护的特异性试验
为进一步确定抗血清的特异性，将0.5 mL的GST-PC兔抗血清与50μg天然PRN蛋白均匀混合，并以5 mL恒定体积加入PBS，稀释5倍，然后在36°C下稀释5倍35分钟。发酵后，PRN-ELISA方法测量两种抗体的水平。之后，腹膜内注射在5只小鼠中培养的血清（0.5mL /小鼠）。以相同的方式治疗兔GST-PRN抗血清，并注射4只小鼠。1.5小时后，对所有小鼠进行腹膜内10LD50（4.4x106CFU）HH0809攻击，观察1个月内的发病率和死亡，并立即对死小鼠进行尸检以分离并确认病原体。
2 结果
2.1 细菌生长曲线和pH与溶解氧的动态
延长了培养时间，细菌的浓度逐渐增加。在24小时变化中，细菌浓度为45亿/ml，并且在培养48小时结束时确定细菌浊度为280亿/ml。同时，随着延长的培养时间和细菌的生长，细菌液体和溶解氧的pH值也继续上升。培养开始时，培养液的pH为7.5。40小时后，pH值可达到8.017（图1）。其中，FHA的活性在培养过程中的变化与PT相似，但FHA活性出现最高峰较PT滞后2-3 h（图2）。
2.2 血凝滴度的动态
在培养开始时，培养上清液的血凝滴度为1：3，当细菌浓度达到90亿/ml时，血凝滴度开始上升。当细菌浓度达到230亿/毫升时，在FHA活性最高时，凝血滴度可以达到1：452的最大值，培养基的pH值增加，FHA活性降低，并且凝血滴度也开始下降至1：24（图3）。
2.3 培养条件与菌形和血清学特异性的关系
从8小时培养开始到48小时结束时采集样品以测量血清凝集效价，结果均为1：13600，表明菌株在培养过程中保持稳定而没有相变。取样染色，革兰氏染色，奥林巴斯光学显微镜，百日咳细菌是典型的球状杆菌，未发现细菌污染。
3 讨论
乳酸杆菌已被证明能够从人体中清除过量的自由基，并具有抗氧化和抗衰老的作用。抗氧化剂主要是酶和其他代谢产物，这些产品在乳酸菌细胞内部和外部具有不同的分布[3]，它也与有氧和厌氧生长环境有关[4]。因此，人们试图使用基因工程方法来增加PT的产量，或进一步开发基因工程百日咳疫苗或亚单位疫苗。研究表明，PRN的不同区域包含一些表位，因此它们都可以具有特定的免疫原性。然而，基于动物免疫保护试验尚未证实PRN多肽片段的免疫原性。目前，大多数PRN的外部提取均使用基因缺失菌株，例如PT缺失突变W28Aptx，FHA和Agg缺失突变Bp353。我国对PRN的研究利用了全基因的CS菌株，通过共纯化硫酸铵沉淀和蔗糖密度梯度离心来纯化PRN，同时纯化PrI1和FHA保护性抗原。在大规模发酵罐中表达工程菌之前，必须检查质粒的稳定性，以确保外源基因在宿主细胞中一致且稳定地表达，并且每批的产量和活性均保持一致。
各种测试指标的综合分析表明，百日咳杆菌的生长和培养pH值，溶解氧，FHA活性和凝血滴度，溶解氧，CO2压力等检测指标均发生了变化。dOMP免疫小鼠血清抗体滴度的动态变化表明，单免疫动物的特异性抗体滴度较低，保留时间较短，且抗体类型主要为IgM。同样，厌氧培养物的抗菌作用远大于需氧培养物。因此，在细胞分裂过程中随机产生携带这些突变的细胞的可能性非常低，但这些细胞生长迅速，最终取代了正常宿主细胞，并在持续增殖后被培养。另外，免疫血清的保护速率是剂量依赖性的，并且与血清抗体滴度相关，如通过ELSA测量的，表明抗rS1血清具有中和PT毒性的作用。 在有关进行的抗凝集素抗体应答研究表明，在传统百日咳疫苗接种后，较高的抗体滴度导致较低的抗体应答。实际上，在正常使用过程中产生高水平凝集抗体和低水平抗PT抗体的百日咳细胞疫苗不如产生高水平抗PT抗体的疫苗有效。由于ELSA可以测量特异性反应抗体与PT结合的能力，因此可以推断出，抗rS1抗血清对小鼠的被动保护能力源于门的结合作用。正在进行研究以评估细胞免疫力和疫苗功效数据之间的关系，但尚未获得结果，因此无法与血清学研究进行比较。因此，在培养过程中通过取样确定pH值来确定停止时间更加方便和准确。
自发感染百日咳后，免疫反應不能消除细菌，但是持续感染会导致呼吸道粘膜免疫病理损害。但是，许多实验表明，免疫可以预防或治疗百日咳，这表明在有效接种疫苗后，机体可以诱导出家兔的保护性反应[5]。这表明PRN的C末端蛋白肽保留了PRN的大部分免疫原性。同时，在预防足部感染中阻断感染机制的关键环节表明，可以完全预防口蹄疫。对无细胞百日咳疫苗的免疫反应不取决于免疫前抗体的效价，无论免疫前的抗PT抗体滴度如何，无细胞百日咳疫苗均可诱导高抗PT抗体滴度。尚不清楚无细胞百日咳疫苗的PT免疫原性是否较高，是否还没有全细胞疫苗的其他成分或尚未发现的其他因素。在存在PRN或PRNF/IM的情况下，FHA不能显着减轻疾病，但并不表明FHA不是保护性抗原。期望rs1将是百日咳基因工程亚单位疫苗的保护性抗原，并且具有良好的适用性，且在提高rs1的纯度之后，免疫保护功能将进一步提高。
综上所述，百日咳多亚基粘膜佐剂疫苗的免疫保护机制的深入研究可能解决了如何选择更好的抗原组合和更理想的免疫途径的问题。此外，更广泛，科学和严格的动物测试结果将为下一次人体实验打下良好基础，从而有可能彻底预防和消除百日咳。
参考文献：
[1] 胡业勤， 段凯， 李新国， et al. 组分无细胞百日咳疫苗纯化新工艺的建立[J]. 中国新药杂志， 2018， 027（021）：2498-2504.
[2] 高晶晶， 李鑫， 乔瑞洁， et al. 百日咳小鼠呼吸道感染模型的建立与应用[J]. 微生物学免疫学进展， 2018， 46（05）：34-41.
[3] 邓继岿， 王红梅， 田树凤. 儿童百日咳的临床特点及实验室诊断[J]. 中华实用儿科临床杂志， 2017， 032（022）：P.1692-1695.
[4] None. Incidence and Burden of Pertussis Among Infants Less Than 1 Year of Age： ERRATUM[J]. The Pediatric Infectious Disease Journal， 2017， 36（4）：443.
[5] 鲍永毅， 陈晓， 牛明福， et al. 茵陈内生细菌的分离鉴定与抑菌活性成分分析[J]. 天然产物研究与开发， 2019， 031（011）： 1919-1927.