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[摘要]本研究采用HPLC-DAD法，在单因素试验的基础上，用响应曲面法（RSM）对影响稻谷中叶黄素提取效果的四氢呋喃用量、KOH甲醇溶液质量浓度和提取温度三个因素进行优化，建立各因素与叶黄素提取量关系的数学模型。响应曲面法优化稻谷中叶黄素最佳提取方法为四氢呋喃15.5mL、KOH甲醇溶液质量浓度0.1g/mL、提取温度51℃，稻谷中叶黄素提取量为（1.63±0.03）μg/g。运用HPLC-DAD及响应曲面法可有效缩短稻谷中叶黄素提取时间，为高效提取稻谷中的叶黄素提供了参考。
[关键词]稻谷；叶黄素；响应曲面法；HPLC-DAD
中图分类号：TS210.1 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180808
叶黄素属于类胡萝卜素，分子式为C40H56O2，结构上由两个六元碳环和一个含有十八个碳原子的共轭双键长链组成。叶黄素是眼部黄斑区的抗氧化剂，对老年性眼球视网膜黄斑退化、动脉硬化、白内障、心血管疾病等有预防作用，同时也可预防癌症以及紫外线对皮肤的损伤。成熟收获后的稻谷中含有游离的叶黄素和叶黄素酯，主要存在于最外层的果皮、胚芽和糊粉层中。人体对叶黄素酯及酯类衍生物的吸收率较差，必须先转化为游离的叶黄素才能被人体吸收。随着消费者个性化需求越来越明显，消费观念日趋理性，人们逐渐意识到富含叶黄素等微量营养素的稻米营养更丰富，研究和检测稻米中的微量营养素也逐渐受到学者的重视。
Maelle等借助HPLC-UV法及响应面法（RSM）对叶黄素提取参数进行优化，取得了较好的提取效果。Boonnoun等使用液化二甲醚，配合HPLC-DAD法，提高了万寿菊花中游离叶黄素的提取率。Fan等利用超临界CO2及HPLC，研究提取叶黄素的最佳条件，并建立模型提高叶黄素提取率。Cobb等采用HPLC-PDA法及响应面法确定了玉米蛋白粉中叶黄素的最佳提取条件，并认为叶黄素和玉米黄质的提取量是强相关。Pal等应用HPLC法和响应面法试验设计优化提取参数，确定了黄玉米粒中叶黄素的最佳提取方法。
但是目前很少有对稻谷中微量叶黄素检测的研究。叶黄素在提取过程中会受到有机溶剂及用量、KOH甲醇溶液质量浓度及用量、提取温度、提取时间及抗氧化剂BHT添加量的影响，各个因素对叶黄素提取量的影响不同。本研究通过运用HPLC-DAD法定量检测稻谷中叶黄素的含量，采用响应曲面法优化各个提取条件，并建立各因素与叶黄素提取量关系的数学模型，确定最佳提取方法，为高效提取与测定稻谷中叶黄素提供参考。
1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1试验材料
稻谷（华梗5号）：宿州；叶黄素标准品（97%）：美国Sigma公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；四氢呋喃（THF）：天津市致远化学试剂有限公司；甲醇、正己烷、乙酸乙酯（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；氢氧化钾：西陇科学股份有限公司。
1.1.2仪器
Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪（配有光电二极管阵列检测器DAD）：戴安中国有限公司；高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；DKZ系列电热恒温振荡水槽：上海一恒科技有限公司；电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；N-1100D-WD旋转蒸发仪：上海爱朗仪器有限公司；BLH-3250实验砻谷机：浙江伯利恒仪器设备有限公司。
1.2叶黄素提取与色谱分析条件
1.2.1叶黄素提取
称取一定量的稻谷样品于砻谷机中去壳，倒入粉碎机中碾磨成粉。精确称取1g稻谷粉，按实验条件分别添加有机试剂、KOH甲醇溶液和BHT后避光振荡一段时间。过滤后的残渣重复提取一遍，合并两次上清液于50mL离心管中。以5000r/min离心20min，转移清液至另一离心管中，重复操作一次，合并上清液，于旋转蒸发仪上50℃蒸至近干，残留物溶于2mL甲醇中，过0.45μm微孔滤膜备用。上述操作均在避光条件下进行。
1.2.2色谱分析条件
色谱柱YMC-C30：4.6×250mm，5μm；检测波长：445nm；柱温：35℃；流动相：甲醇：水=95：5，等梯度洗脱；流速：0.8mL/min；进样量：20μL。
1.3标准曲线的绘制
用电子天平精确称取叶黄素标品5mg置于50mL棕色容量瓶中，用色谱级甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配置成浓度为50μg/mL的标准溶液。精密移取0.5mL、1mL、2mL.4mL、6mL、8mL、10mL溶液至50mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度并摇匀，制得浓度分别为0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL.4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg//mL的标准溶液，充氮備用。操作在昏暗条件下进行，每个系列浓度进样三次，按照上述色谱条件测定标准叶黄素的峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度（μg/mL）为横坐标（X）绘制标准曲线。
1.4单因素试验
本试验主要考虑不同的有机试剂及用量、KOH甲醇溶液质量浓度及用量、提取温度和时间以及抗氧剂BHT用量对稻谷中叶黄素提取量的影响，用叶黄素提取量评价试验效果。
初始条件设为有机溶剂用量10mL，KOH甲醇质量浓度为0.2g/mL，用量5mL，提取温度为40℃，提取时间为2h，BHT添加量为0.2g，研究甲醇、四氢呋喃、正己烷和乙酸乙酯对稻谷中叶黄素提取效果的影响。取上述实验的最佳有机溶剂，溶剂用量分别设为5mL、10mL、15mL、20mL，探究有机溶剂用量对稻谷中叶黄素提取量的影响。 在上述试验的基础上，设置KOH甲醇溶液质量浓度分别为0.05g/mL、0.1g/mL、0.15g/mL、0.2g/mL、0.25g/mL。探究KOH甲醇溶液质量浓度对稻谷中叶黄素提取量的影响。继而分别选取KOH甲醇溶液用量5mL、10mL、15mL、20mL、25mL，探究KOH甲醇溶液用量对稻谷中叶黄素提取量的影响。
选取最佳有机溶剂及用量、KOH甲醇溶液质量浓度及用量，将提取温度设为30℃、40℃、50℃、60℃，探究提取温度对稻谷中叶黄素提取量的影响。选取最佳提取温度，将提取时间设为1h、2h、3h、4h，探究提取时间对稻谷中叶黄素提取量的影响。将抗氧化剂BHT的添加量分别设为0g、0.2g、0.4g、0.6g，探究BHT添加量对稻谷中叶黄素提取量的影响。
1.5稻谷中叶黄素提取量的计算
在445nm处测出峰面积，代入标准曲线得出质量浓度C，根据公式计算叶黄素提取量。
式中，C为稻谷中叶黄素的质量浓度，单位为μg/mL；V为定容体积，单位为mL；M为稻谷质量，单位为g。
1.6响应曲面法优化稻谷中叶黄素提取方法
在单因素试验的基础上，选取三个主要因子X1、X2、X3进行响应曲面试验设计，以叶黄素的提取量为响应值进行三因素三水平试验，运用Design Expert10.0.7软件进行回归分析，确定稻谷中叶黄素的最佳提取方法。
1.7数据处理
每次测定至少重复3次，实验数据以（平均值±标准差）表示，实验数据处理使用Design Expert 10.0.7，采用Graphpad Prism7.0等软件进行处理及制图。
2结果与分析
2.1 HPLC-DAD法建立叶黄素标准曲线
根据色谱分析条件，绘制出叶黄素标准曲线，具体见图1。线性回归方程为y=1.348 4x-0.1749（R2=0.9995），叶黄素标准品浓度在0.5～50μg/mL时与峰面积呈良好的线性关系。
2.2回收率及精密度测定
精密度：取同一稻谷，进行叶黄素提取，连续测定6次，计算出叶黄素提取量的RSD为0.25%，表明精密度良好。
重复性：取同一批稻谷，称取6份同一样品进行提取，计算出叶黄素提取量的RSD为0.47%，表明重复性良好。
稳定性：取同一批稻谷，在0h、2h、4h、6h、8h各测定一次，计算出叶黄素提取量的RSD为1.22%，表明样品溶液在8h内基本稳定。
取6份处理好的稻谷，分别滴加1μg/mL的叶黄素对照品1mL，经液相进行测定，并计算回收量，加样回收实验结果见表1。试验所得平均回收率为98.38%，表明该方法具有较好的回收率。
2.3单因素试验结果
在查阅文献的基础上，结合实验试剂的安全性，选定四种试剂，分别为甲醇、四氢呋喃、正己烷、乙酸乙酯，不同有机溶剂对稻谷中叶黄素提取量的影响结果见图2。由图2可知，不同溶剂对叶黄素的提取量存在显著差异（P<0.05）。选取四氢呋喃作有机溶剂时，稻谷中叶黄素的提取量最高，为（1.54±0.03）μg/g，正己烷、乙酸乙酯次之，甲醇最低。因此，选取四氢呋喃作为提取稻谷中叶黄素的有机溶剂。
不同条件对稻谷中叶黄素提取量的影响见图3。
由图3（a）可知，四氢呋喃用量对稻谷中叶黄素的提取量影响较小。原因是稻谷中游离的叶黄素含量少，四氢呋喃对叶黄素的溶解性较好，可对稻谷中的叶黄素充分溶解。据Yuhas等的研究显示，加入四氢呋喃有利于将叶黄素与脂肪分开，提高叶黄素提取效率和回收率。另外，四氢呋喃的沸点较低，易通过旋转蒸发除去。考虑到节约实验试剂的原则，选取四氢呋喃的用量为15mL，此时叶黄素提取量为（1.56±0.02）μg/g。
由图3（b）可知，随着KOH甲醇溶液质量浓度的增加，稻谷中叶黄素的提取量先增加后减少，这是由于叶黄素与溶剂的接触面浓度差增加，渗透压增大，叶黄素更容易浸出。当质量浓度过高时，溶液中碱性增加，破坏了叶黄素在溶液中的稳定性；质量浓度为0.15g/mL时，提取量达到最大，为（1.58±0.06）μg/g，最终选定KOH甲醇溶液质量浓度为0.15g/mL。
由图3（c）可知，当KOH甲醇溶液用量为5～10mL时，叶黄素的提取量逐渐升高，高于10mL后，开始有较大幅度的下降。主要原因是随着溶液用量的增加，溶液中过强的碱性影响叶黄素的稳定性，造成提取过程中的损失，最终选定KOH甲醇溶液用量为10mL。
由图3（d）可知，稻谷中叶黄素的提取量随着温度的上升而增加，叶黄素提取量随温度变化规律与Kang等的研究一致。当温度到达50℃后，叶黄素中有不饱和键，过高的温度易导致叶黄素分解和异构化，此时不利于叶黄素的提取，所以选择提取温度为50℃。
由图3（e）可知，提取时间对稻谷中叶黄素提取量的影响是先增加后减少。一开始随着时间的增加，稻谷中游离的叶黄素可充分溶解并提取，当提取时间到达2h后，提取体系中持续存在的高温环境，使得叶黃素发生异构化，影响最后的提取量，所以选取最佳提取时间为2h。提取溶液中，溶液酸碱性复杂，在酸性条件下，H+与叶黄素的羟基发生反应，使叶黄素降解，添加抗氧化剂可以保持叶黄素在溶剂中的稳定性。
由图3（f）可知，添加0.2gBHT与没有添加BHT相比，提取量提高了14.5%。在添加BHT之后，添加量没有对叶黄素提取量产生明显的改变，最终选定BHT添加量为0.2g。
2.4响应曲面法优化稻谷中叶黄素提取方法
在2.3单因素试验结果上，对四氢呋喃用量（X1）、KOH甲醇溶液质量浓度（X2）、提取温度（X3）3个因素进行响应曲面试验设计。设响应曲面因素与水平及编码值见表2，响应曲面法优化稻谷中叶黄素提取方法见表3。 利用Design Expert对表3中的数据进行二次多元回归拟合，得到叶黄素提取量（Y）对X1、X2、X3的二次多元回归方程：
2.5试验因素交互作用分析
2.5.1四氢呋喃用量和KOH甲醇溶液质量浓度
四氢呋喃用量和KOH甲醇溶液质量浓度对稻谷中叶黄素提取量影响的响应面（a）和等高线（b）见图4。如图4所示，固定提取温度为50℃，四氢呋喃用量不变，当KOH甲醇溶液质量浓度在0.05～0.1g/mL时，稻谷中叶黄素的提取量随质量浓度的增加而增加；KOH甲醇溶液质量浓度大于0.1g/mL后，叶黄素的提取量逐渐下降；KOH甲醇溶液质量浓度一定时，随着四氢呋喃用量的增加，叶黄素提取量先增加后减少。
2.5.2四氢呋喃用量和提取温度
四氢呋喃用量和提取温度对叶黄素提取量影响的响应面和等高线见图5。如图5所示，固定KOH甲醇溶液质量浓度为0.1 g/mL，当提取温度一定时，稻谷中叶黄素提取量随四氢呋喃用量的增加而增加，到达峰值后，叶黄素提取量缓慢下降；当四氢呋喃用量不变时，提取量随温度的上升而增加，在温度到达50%后，叶黄素提取量随温度上升而逐渐下降。
2.5.3 KOH甲醇溶液质量浓度和提取温度
KOH甲醇溶液质量浓度和提取温度对稻谷中叶黄素提取量影响的响应面（a）和等高线（b）见图6。如图6所示，固定水平为四氢呋喃用量15mL，当提取温度不变，KOH甲醇溶液质量浓度在0.05～0.1g/mL时，稻谷中叶黄素的提取量随KOH甲醇溶液质量浓度的增加而快速提高；当KOH甲醇溶液质量浓度大于0.1g/mL时，叶黄素的提取量快速下降；在KOH甲醇溶液质量浓度恒定时，随着温度的升高，稻谷中叶黄素的提取量不断增加；当温度高于50%时，叶黄素提取量呈现下降的趋势。
2.6稻谷中叶黄素提取方法的确定
响应曲面优化值结果见表6。由表6可知，响应曲面优化后的最佳提取方法为四氢呋喃用量15.39mL、KOH甲醇溶液质量浓度0.1g/mL、提取温度50.69℃，理论最大值为1.61μg/g。为验证响应曲面法结果的可靠性，考虑到实际操作过程中的便利性，对理论最优值调整为四氢呋喃用量15.5mL、KOH甲醇溶液质量浓度0.1g/mL、提取溫度51℃，以此作为最佳提取方法条件并重复实验，结果见表7。
由表7可知，3次测定取平均值为（1.63±0.03）μg/g，与理论值1.61相近（相对误差1.22%），说明该回归模型具有较好的拟合度。响应面法确定的最佳提取方法下，实际叶黄素提取量比单因素条件下有所提高，这与杨秋明等的研究结果一致。通过在实际操作中优化各因素条件，最终叶黄素提取量与回归模型具有较好的拟合度，说明模型具有较好的参考价值。
3结论
本文探讨了基于HPLC-DAD稻谷中叶黄素的提取方法，通过单因素试验确定了各个因素的最佳条件。应用响应曲面法对四氢呋喃用量、KOH甲醇溶液质量浓度和提取温度三个因素进行优化，建立具有良好拟合度的回归模型，得到最佳的提取方法为四氢呋喃用量15.5mL、KOH甲醇溶液质量浓度0.1g/mL、提取温度51℃，稻谷中叶黄素提取量为（1.63±0.03）μg/g。该方法缩短了反应时间，避免了游离叶黄素的分解和异构化，具有较好的重复性。
[关键词]稻谷；叶黄素；响应曲面法；HPLC-DAD
中图分类号：TS210.1 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180808
叶黄素属于类胡萝卜素，分子式为C40H56O2，结构上由两个六元碳环和一个含有十八个碳原子的共轭双键长链组成。叶黄素是眼部黄斑区的抗氧化剂，对老年性眼球视网膜黄斑退化、动脉硬化、白内障、心血管疾病等有预防作用，同时也可预防癌症以及紫外线对皮肤的损伤。成熟收获后的稻谷中含有游离的叶黄素和叶黄素酯，主要存在于最外层的果皮、胚芽和糊粉层中。人体对叶黄素酯及酯类衍生物的吸收率较差，必须先转化为游离的叶黄素才能被人体吸收。随着消费者个性化需求越来越明显，消费观念日趋理性，人们逐渐意识到富含叶黄素等微量营养素的稻米营养更丰富，研究和检测稻米中的微量营养素也逐渐受到学者的重视。
Maelle等借助HPLC-UV法及响应面法（RSM）对叶黄素提取参数进行优化，取得了较好的提取效果。Boonnoun等使用液化二甲醚，配合HPLC-DAD法，提高了万寿菊花中游离叶黄素的提取率。Fan等利用超临界CO2及HPLC，研究提取叶黄素的最佳条件，并建立模型提高叶黄素提取率。Cobb等采用HPLC-PDA法及响应面法确定了玉米蛋白粉中叶黄素的最佳提取条件，并认为叶黄素和玉米黄质的提取量是强相关。Pal等应用HPLC法和响应面法试验设计优化提取参数，确定了黄玉米粒中叶黄素的最佳提取方法。
但是目前很少有对稻谷中微量叶黄素检测的研究。叶黄素在提取过程中会受到有机溶剂及用量、KOH甲醇溶液质量浓度及用量、提取温度、提取时间及抗氧化剂BHT添加量的影响，各个因素对叶黄素提取量的影响不同。本研究通过运用HPLC-DAD法定量检测稻谷中叶黄素的含量，采用响应曲面法优化各个提取条件，并建立各因素与叶黄素提取量关系的数学模型，确定最佳提取方法，为高效提取与测定稻谷中叶黄素提供参考。
1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1试验材料
稻谷（华梗5号）：宿州；叶黄素标准品（97%）：美国Sigma公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；四氢呋喃（THF）：天津市致远化学试剂有限公司；甲醇、正己烷、乙酸乙酯（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；氢氧化钾：西陇科学股份有限公司。
1.1.2仪器
Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪（配有光电二极管阵列检测器DAD）：戴安中国有限公司；高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；DKZ系列电热恒温振荡水槽：上海一恒科技有限公司；电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；N-1100D-WD旋转蒸发仪：上海爱朗仪器有限公司；BLH-3250实验砻谷机：浙江伯利恒仪器设备有限公司。
1.2叶黄素提取与色谱分析条件
1.2.1叶黄素提取
称取一定量的稻谷样品于砻谷机中去壳，倒入粉碎机中碾磨成粉。精确称取1g稻谷粉，按实验条件分别添加有机试剂、KOH甲醇溶液和BHT后避光振荡一段时间。过滤后的残渣重复提取一遍，合并两次上清液于50mL离心管中。以5000r/min离心20min，转移清液至另一离心管中，重复操作一次，合并上清液，于旋转蒸发仪上50℃蒸至近干，残留物溶于2mL甲醇中，过0.45μm微孔滤膜备用。上述操作均在避光条件下进行。
1.2.2色谱分析条件
色谱柱YMC-C30：4.6×250mm，5μm；检测波长：445nm；柱温：35℃；流动相：甲醇：水=95：5，等梯度洗脱；流速：0.8mL/min；进样量：20μL。
1.3标准曲线的绘制
用电子天平精确称取叶黄素标品5mg置于50mL棕色容量瓶中，用色谱级甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配置成浓度为50μg/mL的标准溶液。精密移取0.5mL、1mL、2mL.4mL、6mL、8mL、10mL溶液至50mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度并摇匀，制得浓度分别为0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL.4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg//mL的标准溶液，充氮備用。操作在昏暗条件下进行，每个系列浓度进样三次，按照上述色谱条件测定标准叶黄素的峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度（μg/mL）为横坐标（X）绘制标准曲线。
1.4单因素试验
本试验主要考虑不同的有机试剂及用量、KOH甲醇溶液质量浓度及用量、提取温度和时间以及抗氧剂BHT用量对稻谷中叶黄素提取量的影响，用叶黄素提取量评价试验效果。
初始条件设为有机溶剂用量10mL，KOH甲醇质量浓度为0.2g/mL，用量5mL，提取温度为40℃，提取时间为2h，BHT添加量为0.2g，研究甲醇、四氢呋喃、正己烷和乙酸乙酯对稻谷中叶黄素提取效果的影响。取上述实验的最佳有机溶剂，溶剂用量分别设为5mL、10mL、15mL、20mL，探究有机溶剂用量对稻谷中叶黄素提取量的影响。 在上述试验的基础上，设置KOH甲醇溶液质量浓度分别为0.05g/mL、0.1g/mL、0.15g/mL、0.2g/mL、0.25g/mL。探究KOH甲醇溶液质量浓度对稻谷中叶黄素提取量的影响。继而分别选取KOH甲醇溶液用量5mL、10mL、15mL、20mL、25mL，探究KOH甲醇溶液用量对稻谷中叶黄素提取量的影响。
选取最佳有机溶剂及用量、KOH甲醇溶液质量浓度及用量，将提取温度设为30℃、40℃、50℃、60℃，探究提取温度对稻谷中叶黄素提取量的影响。选取最佳提取温度，将提取时间设为1h、2h、3h、4h，探究提取时间对稻谷中叶黄素提取量的影响。将抗氧化剂BHT的添加量分别设为0g、0.2g、0.4g、0.6g，探究BHT添加量对稻谷中叶黄素提取量的影响。
1.5稻谷中叶黄素提取量的计算
在445nm处测出峰面积，代入标准曲线得出质量浓度C，根据公式计算叶黄素提取量。
式中，C为稻谷中叶黄素的质量浓度，单位为μg/mL；V为定容体积，单位为mL；M为稻谷质量，单位为g。
1.6响应曲面法优化稻谷中叶黄素提取方法
在单因素试验的基础上，选取三个主要因子X1、X2、X3进行响应曲面试验设计，以叶黄素的提取量为响应值进行三因素三水平试验，运用Design Expert10.0.7软件进行回归分析，确定稻谷中叶黄素的最佳提取方法。
1.7数据处理
每次测定至少重复3次，实验数据以（平均值±标准差）表示，实验数据处理使用Design Expert 10.0.7，采用Graphpad Prism7.0等软件进行处理及制图。
2结果与分析
2.1 HPLC-DAD法建立叶黄素标准曲线
根据色谱分析条件，绘制出叶黄素标准曲线，具体见图1。线性回归方程为y=1.348 4x-0.1749（R2=0.9995），叶黄素标准品浓度在0.5～50μg/mL时与峰面积呈良好的线性关系。
2.2回收率及精密度测定
精密度：取同一稻谷，进行叶黄素提取，连续测定6次，计算出叶黄素提取量的RSD为0.25%，表明精密度良好。
重复性：取同一批稻谷，称取6份同一样品进行提取，计算出叶黄素提取量的RSD为0.47%，表明重复性良好。
稳定性：取同一批稻谷，在0h、2h、4h、6h、8h各测定一次，计算出叶黄素提取量的RSD为1.22%，表明样品溶液在8h内基本稳定。
取6份处理好的稻谷，分别滴加1μg/mL的叶黄素对照品1mL，经液相进行测定，并计算回收量，加样回收实验结果见表1。试验所得平均回收率为98.38%，表明该方法具有较好的回收率。
2.3单因素试验结果
在查阅文献的基础上，结合实验试剂的安全性，选定四种试剂，分别为甲醇、四氢呋喃、正己烷、乙酸乙酯，不同有机溶剂对稻谷中叶黄素提取量的影响结果见图2。由图2可知，不同溶剂对叶黄素的提取量存在显著差异（P<0.05）。选取四氢呋喃作有机溶剂时，稻谷中叶黄素的提取量最高，为（1.54±0.03）μg/g，正己烷、乙酸乙酯次之，甲醇最低。因此，选取四氢呋喃作为提取稻谷中叶黄素的有机溶剂。
不同条件对稻谷中叶黄素提取量的影响见图3。
由图3（a）可知，四氢呋喃用量对稻谷中叶黄素的提取量影响较小。原因是稻谷中游离的叶黄素含量少，四氢呋喃对叶黄素的溶解性较好，可对稻谷中的叶黄素充分溶解。据Yuhas等的研究显示，加入四氢呋喃有利于将叶黄素与脂肪分开，提高叶黄素提取效率和回收率。另外，四氢呋喃的沸点较低，易通过旋转蒸发除去。考虑到节约实验试剂的原则，选取四氢呋喃的用量为15mL，此时叶黄素提取量为（1.56±0.02）μg/g。
由图3（b）可知，随着KOH甲醇溶液质量浓度的增加，稻谷中叶黄素的提取量先增加后减少，这是由于叶黄素与溶剂的接触面浓度差增加，渗透压增大，叶黄素更容易浸出。当质量浓度过高时，溶液中碱性增加，破坏了叶黄素在溶液中的稳定性；质量浓度为0.15g/mL时，提取量达到最大，为（1.58±0.06）μg/g，最终选定KOH甲醇溶液质量浓度为0.15g/mL。
由图3（c）可知，当KOH甲醇溶液用量为5～10mL时，叶黄素的提取量逐渐升高，高于10mL后，开始有较大幅度的下降。主要原因是随着溶液用量的增加，溶液中过强的碱性影响叶黄素的稳定性，造成提取过程中的损失，最终选定KOH甲醇溶液用量为10mL。
由图3（d）可知，稻谷中叶黄素的提取量随着温度的上升而增加，叶黄素提取量随温度变化规律与Kang等的研究一致。当温度到达50℃后，叶黄素中有不饱和键，过高的温度易导致叶黄素分解和异构化，此时不利于叶黄素的提取，所以选择提取温度为50℃。
由图3（e）可知，提取时间对稻谷中叶黄素提取量的影响是先增加后减少。一开始随着时间的增加，稻谷中游离的叶黄素可充分溶解并提取，当提取时间到达2h后，提取体系中持续存在的高温环境，使得叶黃素发生异构化，影响最后的提取量，所以选取最佳提取时间为2h。提取溶液中，溶液酸碱性复杂，在酸性条件下，H+与叶黄素的羟基发生反应，使叶黄素降解，添加抗氧化剂可以保持叶黄素在溶剂中的稳定性。
由图3（f）可知，添加0.2gBHT与没有添加BHT相比，提取量提高了14.5%。在添加BHT之后，添加量没有对叶黄素提取量产生明显的改变，最终选定BHT添加量为0.2g。
2.4响应曲面法优化稻谷中叶黄素提取方法
在2.3单因素试验结果上，对四氢呋喃用量（X1）、KOH甲醇溶液质量浓度（X2）、提取温度（X3）3个因素进行响应曲面试验设计。设响应曲面因素与水平及编码值见表2，响应曲面法优化稻谷中叶黄素提取方法见表3。 利用Design Expert对表3中的数据进行二次多元回归拟合，得到叶黄素提取量（Y）对X1、X2、X3的二次多元回归方程：
2.5试验因素交互作用分析
2.5.1四氢呋喃用量和KOH甲醇溶液质量浓度
四氢呋喃用量和KOH甲醇溶液质量浓度对稻谷中叶黄素提取量影响的响应面（a）和等高线（b）见图4。如图4所示，固定提取温度为50℃，四氢呋喃用量不变，当KOH甲醇溶液质量浓度在0.05～0.1g/mL时，稻谷中叶黄素的提取量随质量浓度的增加而增加；KOH甲醇溶液质量浓度大于0.1g/mL后，叶黄素的提取量逐渐下降；KOH甲醇溶液质量浓度一定时，随着四氢呋喃用量的增加，叶黄素提取量先增加后减少。
2.5.2四氢呋喃用量和提取温度
四氢呋喃用量和提取温度对叶黄素提取量影响的响应面和等高线见图5。如图5所示，固定KOH甲醇溶液质量浓度为0.1 g/mL，当提取温度一定时，稻谷中叶黄素提取量随四氢呋喃用量的增加而增加，到达峰值后，叶黄素提取量缓慢下降；当四氢呋喃用量不变时，提取量随温度的上升而增加，在温度到达50%后，叶黄素提取量随温度上升而逐渐下降。
2.5.3 KOH甲醇溶液质量浓度和提取温度
KOH甲醇溶液质量浓度和提取温度对稻谷中叶黄素提取量影响的响应面（a）和等高线（b）见图6。如图6所示，固定水平为四氢呋喃用量15mL，当提取温度不变，KOH甲醇溶液质量浓度在0.05～0.1g/mL时，稻谷中叶黄素的提取量随KOH甲醇溶液质量浓度的增加而快速提高；当KOH甲醇溶液质量浓度大于0.1g/mL时，叶黄素的提取量快速下降；在KOH甲醇溶液质量浓度恒定时，随着温度的升高，稻谷中叶黄素的提取量不断增加；当温度高于50%时，叶黄素提取量呈现下降的趋势。
2.6稻谷中叶黄素提取方法的确定
响应曲面优化值结果见表6。由表6可知，响应曲面优化后的最佳提取方法为四氢呋喃用量15.39mL、KOH甲醇溶液质量浓度0.1g/mL、提取温度50.69℃，理论最大值为1.61μg/g。为验证响应曲面法结果的可靠性，考虑到实际操作过程中的便利性，对理论最优值调整为四氢呋喃用量15.5mL、KOH甲醇溶液质量浓度0.1g/mL、提取溫度51℃，以此作为最佳提取方法条件并重复实验，结果见表7。
由表7可知，3次测定取平均值为（1.63±0.03）μg/g，与理论值1.61相近（相对误差1.22%），说明该回归模型具有较好的拟合度。响应面法确定的最佳提取方法下，实际叶黄素提取量比单因素条件下有所提高，这与杨秋明等的研究结果一致。通过在实际操作中优化各因素条件，最终叶黄素提取量与回归模型具有较好的拟合度，说明模型具有较好的参考价值。
3结论
本文探讨了基于HPLC-DAD稻谷中叶黄素的提取方法，通过单因素试验确定了各个因素的最佳条件。应用响应曲面法对四氢呋喃用量、KOH甲醇溶液质量浓度和提取温度三个因素进行优化，建立具有良好拟合度的回归模型，得到最佳的提取方法为四氢呋喃用量15.5mL、KOH甲醇溶液质量浓度0.1g/mL、提取温度51℃，稻谷中叶黄素提取量为（1.63±0.03）μg/g。该方法缩短了反应时间，避免了游离叶黄素的分解和异构化，具有较好的重复性。