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【摘 要】 目的：建立RP-HPLC同时测定栀子柏皮汤传统汤剂、经方颗粒剂及单味配方颗粒剂中甘草苷、甘草酸铵含量的分析方法。方法：采用Agilent Extend-C18色谱柱（250mm× 46mm，5μm），以乙腈-005%磷酸水溶液-甲醇为流动相梯度洗脱，流速为08ml/min，检测波长为237nm，柱温30℃。结果：甘草苷及甘草酸铵进样量分别在010～080μg和010～050μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率（n=9）分别为10036%（RSD=076%）、10043%（RSD=110%）。结论：本法适用于不同剂型栀子柏皮汤中甘草苷、甘草酸铵的同时测定。
【关键词】 栀子柏皮汤；不同剂型；反相高效液相色谱法；甘草苷；甘草酸铵
【中图分类号】R2841 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）05-0024-02
RP-HPLC Simultaneous Determination of the Content of Liquiritin and Glycyrrhetinic inDifferent Dosage Form of Zhizi Baipi Soup
LI Xiang1，YU Lin2，PENG Xiaobing2*，LIANG Guangyi2
1Qiannan Medical College for Nationalities，Duyun 558000，China；
2Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550000，China
Abstract：Objective To establish the analytical method for RP-HPLC simultaneous determin ation of the content of liquiritin and glycyrrhetinic acid in traditional Zhizi Baipi soup，the granule of classical prescription and the granule of single herb.Method The operating conditions were Agilent Extend-C18 column（250mm×46mm，5μm）at 30℃ and gradient elution of mobile phase which was composed of acetonitrile-005% phosphoric acid solution-methanol at a flow of 08ml·min-1 and wavelength at 237nm.Result The sample size of liquiritin and glycyrrhetinic acid respectively in 010-080μg and 010-050μg had a good linear relationship with peak area.The average recoveries（n=9）were 10036%（RSD=076%） and 10043%（RSD=110%）.[WTHZ]Conclusions[WTBZ] The method applies for simultaneous determination of liquiritin and glycyrrhetinic in different dosage form of Zhizi Baipi soup.
Keywords：Zhizi Baipi soup；different dosage form；RP-HPLC；liquiritin； glycyrrhetinic acid
栀子柏皮汤始载于汉代名医张仲景的《伤寒论》，由栀子、黄柏和炙甘草三味药材组成，用于治疗湿热发黄、热重于湿之阳黄症[1]。甘草的主要有效成分甘草酸、甘草次酸、甘草苷、甘草酸铵，均具有保肝作用[2] 。为了更好的控制该方的质量，保证临床用药安全，实验以甘草苷、甘草酸铵为考察指标，参考相关文献资料[3-8]，同时测定栀子柏皮汤传统汤剂、经方颗粒剂、单味配方颗粒剂中甘草苷、甘草酸铵含量。结果表明，供试品在反相高效液相色谱中分离效果较好，阴性样品溶液对测定无干扰，方法简单、准确、重复性好，可用于不同剂型栀子柏皮汤中甘草苷、甘草酸铵的同时测定。
1 仪器与材料
11 仪器 安捷伦1100高效液相色谱仪（Agilent ChemStation色谱工作站）；WS205电子天平（十万分之一，瑞士梅特公司）；HS10260D超声波清洗机（天津市恒奥科技有限公司）。
12 材料 甘草苷对照品（批号：111610-200604）、甘草酸铵对照品（批号：110731-200408）均购自中国药品生物制品检定所；乙腈、甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。
药材均购自贵州圣济堂制药有限公司，经贵阳中医学院贺祝英主任药师鉴定，栀子是茜草科植物山栀Gardenia jasminoides Ellis的果实；黄柏为芸香科植物黄皮Phellodendron chinense Schneid的干燥树皮，习称“川黄柏”；甘草为豆科植物甘草Glycxycrrhiza uralensis Fisch的干燥根及根茎，均符合2010版《中国药典》的规定。
2 方法与结果
21 色谱条件与系统适用性实验 采用Agilent Extend-C18色谱柱（250mm× 46mm，5μm），以乙腈（A）-005%磷酸水溶液（B）-甲醇（C）为流动相梯度洗脱（表1），检测波长为237nm，流速为08ml/min，柱温30℃，进样量为10μl，理论板数不低于3000。在此色谱条件下，甘草苷、甘草酸铵与其他组分的分离效果较好。 22 溶液制备
221 对照品溶液的制备 分别精密称取甘草苷、甘草酸铵对照品13mg和10mg，加70%甲醇溶解，分别定容至25ml和50ml，制成52μg/ml的甘草苷对照品溶液、20μg/ml的甘草酸铵盐对照品溶液。
222 供试品溶液的制备
2221 传统汤剂供试品溶液的制备 处方：栀子10g，黄柏6g，甘草3g。按处方比例称取各味药材粗粉（10倍处方量）。加水6000ml煮至约2400ml，过滤，浓缩，定容至1000ml备用（传统方法）。精密吸取汤剂20ml于水浴上蒸干，残渣加入70%甲醇定容至25ml，超声30 min，过滤，滤液备用。
2222 复方颗粒供试品溶液的制备 按传统汤剂制备方法制备得汤剂，进一步浓缩，常压80℃烘干，粉碎，得干浸膏粉备用。精密称取经方干浸膏粉约07251g，置于具塞锥形瓶中，加入70%甲醇定容至25ml，超声处理30 min，过滤，滤液备用。
2223 配方颗粒供试品溶液的制备 称取各味药材（粗粉）适量，各加8倍量水浸泡20min，煎煮60min，过滤，滤液另器收集，药渣再加6倍量水煎煮60min，过滤，合并两次煎液，制备成各药材的煎液，常压80℃烘干，粉碎，得各单味药干浸膏粉。按处方比例称取适量干浸膏粉配研混合，得单味配方干浸膏粉备用。精密称取单味配方干浸膏粉约11472g置于具塞锥形瓶中，加入70%甲醇定容至25ml，超声处理30min，过滤，滤液备用。
223 阴性供试品溶液的制备
2231 空白溶液的制备 取70%甲醇溶液25ml，超声处理30 min，过滤，滤液备用。
2232 缺甘草溶液的制备 按“2221”项下方法制备不含甘草的空白对照溶液，备用。
23 方法学考察
231 专属性考察 精密吸取对照品溶液、供试品溶液和空白溶液各10μl，按“21”项下条件进样测定。结果见图1，阴性对照样品色谱图中在甘草苷、甘草酸铵相应保留时间位置未见吸收峰，表明其他成分对甘草苷、甘草酸铵含量测定无干扰。
232 线性关系考察 分别精密称取甘草苷对照品，甘草酸铵对照品各20mg，定容至10ml，作对照品储备液。取甘草苷对照品储备液，分别稀释成浓度为10、20、40、60、80μg/ml；取甘草酸铵对照品储备液，分别稀释成浓度为10、20、30、40、50μg/ml，按“21”项下条件进样测定、以甘草苷，甘草酸铵对照品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），计算甘草苷、甘草酸铵的回归方程分别为：Y=19787X-16037（r=09995）；Y=602X-44（r=09997）。结果表明甘草苷进样量在010～080μg与峰面积呈良好的线性关系，甘草酸铵进样量在010～050μg与峰面积呈良好的线性关系。
233 精密度试验 精密吸取“221”项下甘草苷、甘草酸铵对照品溶液，按“21”项下条件进样测定。重复进样测定6次，测得甘草苷峰面积值的RSD为075%，甘草酸铵峰面积值的RSD为074%，数据表明精密度良好。
234 稳定性实验 依据“2221”项下制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24h时进样，按“21”项下条件进样测定，测定其峰面积。甘草苷RSD为151%，甘草酸铵RSD为068%。说明供试品溶液在24h内稳定。
235 重复性试验 依据“2221”项下制备供试品溶液，分别制备6份，按“21”项下条件进样测定。甘草苷RSD为196%，甘草酸铵RSD为209%，结果表明重复性良好。
236 加样回收率试验 分别精密称取甘草苷及甘草酸铵对照品32mg、17mg，加70%甲醇定容至5ml。按照“221”项下的制备方法减半取样平行制备样品9份，分别置锥形瓶中，按高、中、低浓度精密加入甘草苷对照液084、101、126ml，甘草酸铵对照液074、088、11ml，分别按“2221”项下方法制备得供试品溶液，按“21”项下条件进样测定，分别测得样品中甘草苷及甘草酸铵的含量，计算加样回收率。结果甘草苷、甘草酸铵的平均回收率（n=9）分别为10036%（RSD=076%）、10043%（RSD=110%）。
24 样品含量测定 按“222”项下方法制备传统汤剂供试液、复方颗粒供试液及单味配方颗粒供试液，各3份，分别按“21”项下条件进样测定，样品溶液中甘草苷及甘草酸铵的含量结果见表2。
3 结果与讨论
探讨采用反相高效液相色谱法同时测定栀子柏皮汤中传统汤剂、复方颗粒、配方颗粒中甘草苷、甘草酸铵的含量，从而摸索这2个指标成分含量测定方法。进一步对栀子柏皮汤配方颗粒、汤剂和复方颗粒中甘草苷及甘草酸铵的含量进行比较，结果显示甘草苷含量（配方>汤剂>复方），甘草酸铵含量（配方>复方>汤剂），甘草苷和甘草酸铵在配方颗粒中含量均比其他剂型高，可能是因为两种成分在复方中煎煮时发生反应，减少含量。
实验考查了多种色谱条件，分别有乙腈-005%磷酸、甲醇-005%磷酸，并分别用不同洗脱程序分离；同时对流速、柱温等方面也进行考察选择最优条件。但是上述多种条件在分离甘草苷的时候都具有拖尾现象，且分离不好，而在流速为08ml/min，柱温为30℃，乙腈-甲醇-005%磷酸梯度洗脱色谱条件最好。
参考文献
[1]苗润田.伤寒论教程[M].北京：科学出版社，2000：167.
[2]郑占虎，董泽宏，余靖.中药现代研究与应用（第二卷）[M].北京：学苑出版社，1997.
[3]张科卫，崔小兵，吴皓，等.双波长梯度洗脱法测定栀子柏皮汤制剂中栀子苷、甘草苷的含量[J].中成药，2008，30（11）：1629-1631.
[4]彭小冰，靳凤云，李香，等.小青龙汤不同煎液中甘草苷的含量比较[J].时珍国医国药，2008，19（5）：1046-1047.
[5]吴杨，吕雄文，毛名扬，等.HPLC法测定甘黄燥湿洗液中盐酸小檗碱和甘草酸铵的含量[J].安徽医药，2009，13（4）：384-386.
[6]张爱君.HPLC法测定小儿止嗽丸中甘草酸铵含量[J].辽宁中医杂志，2008，3（56）：912-913.
[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010.
[8]朱怡洁，李勇，魏金津，等.RP-HPLC法同时测定皮而康胶囊中3个成分含量[J].药物分析杂志，2013，33（1）：116-119.
（收稿日期：20141214）
【关键词】 栀子柏皮汤；不同剂型；反相高效液相色谱法；甘草苷；甘草酸铵
【中图分类号】R2841 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）05-0024-02
RP-HPLC Simultaneous Determination of the Content of Liquiritin and Glycyrrhetinic inDifferent Dosage Form of Zhizi Baipi Soup
LI Xiang1，YU Lin2，PENG Xiaobing2*，LIANG Guangyi2
1Qiannan Medical College for Nationalities，Duyun 558000，China；
2Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550000，China
Abstract：Objective To establish the analytical method for RP-HPLC simultaneous determin ation of the content of liquiritin and glycyrrhetinic acid in traditional Zhizi Baipi soup，the granule of classical prescription and the granule of single herb.Method The operating conditions were Agilent Extend-C18 column（250mm×46mm，5μm）at 30℃ and gradient elution of mobile phase which was composed of acetonitrile-005% phosphoric acid solution-methanol at a flow of 08ml·min-1 and wavelength at 237nm.Result The sample size of liquiritin and glycyrrhetinic acid respectively in 010-080μg and 010-050μg had a good linear relationship with peak area.The average recoveries（n=9）were 10036%（RSD=076%） and 10043%（RSD=110%）.[WTHZ]Conclusions[WTBZ] The method applies for simultaneous determination of liquiritin and glycyrrhetinic in different dosage form of Zhizi Baipi soup.
Keywords：Zhizi Baipi soup；different dosage form；RP-HPLC；liquiritin； glycyrrhetinic acid
栀子柏皮汤始载于汉代名医张仲景的《伤寒论》，由栀子、黄柏和炙甘草三味药材组成，用于治疗湿热发黄、热重于湿之阳黄症[1]。甘草的主要有效成分甘草酸、甘草次酸、甘草苷、甘草酸铵，均具有保肝作用[2] 。为了更好的控制该方的质量，保证临床用药安全，实验以甘草苷、甘草酸铵为考察指标，参考相关文献资料[3-8]，同时测定栀子柏皮汤传统汤剂、经方颗粒剂、单味配方颗粒剂中甘草苷、甘草酸铵含量。结果表明，供试品在反相高效液相色谱中分离效果较好，阴性样品溶液对测定无干扰，方法简单、准确、重复性好，可用于不同剂型栀子柏皮汤中甘草苷、甘草酸铵的同时测定。
1 仪器与材料
11 仪器 安捷伦1100高效液相色谱仪（Agilent ChemStation色谱工作站）；WS205电子天平（十万分之一，瑞士梅特公司）；HS10260D超声波清洗机（天津市恒奥科技有限公司）。
12 材料 甘草苷对照品（批号：111610-200604）、甘草酸铵对照品（批号：110731-200408）均购自中国药品生物制品检定所；乙腈、甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。
药材均购自贵州圣济堂制药有限公司，经贵阳中医学院贺祝英主任药师鉴定，栀子是茜草科植物山栀Gardenia jasminoides Ellis的果实；黄柏为芸香科植物黄皮Phellodendron chinense Schneid的干燥树皮，习称“川黄柏”；甘草为豆科植物甘草Glycxycrrhiza uralensis Fisch的干燥根及根茎，均符合2010版《中国药典》的规定。
2 方法与结果
21 色谱条件与系统适用性实验 采用Agilent Extend-C18色谱柱（250mm× 46mm，5μm），以乙腈（A）-005%磷酸水溶液（B）-甲醇（C）为流动相梯度洗脱（表1），检测波长为237nm，流速为08ml/min，柱温30℃，进样量为10μl，理论板数不低于3000。在此色谱条件下，甘草苷、甘草酸铵与其他组分的分离效果较好。 22 溶液制备
221 对照品溶液的制备 分别精密称取甘草苷、甘草酸铵对照品13mg和10mg，加70%甲醇溶解，分别定容至25ml和50ml，制成52μg/ml的甘草苷对照品溶液、20μg/ml的甘草酸铵盐对照品溶液。
222 供试品溶液的制备
2221 传统汤剂供试品溶液的制备 处方：栀子10g，黄柏6g，甘草3g。按处方比例称取各味药材粗粉（10倍处方量）。加水6000ml煮至约2400ml，过滤，浓缩，定容至1000ml备用（传统方法）。精密吸取汤剂20ml于水浴上蒸干，残渣加入70%甲醇定容至25ml，超声30 min，过滤，滤液备用。
2222 复方颗粒供试品溶液的制备 按传统汤剂制备方法制备得汤剂，进一步浓缩，常压80℃烘干，粉碎，得干浸膏粉备用。精密称取经方干浸膏粉约07251g，置于具塞锥形瓶中，加入70%甲醇定容至25ml，超声处理30 min，过滤，滤液备用。
2223 配方颗粒供试品溶液的制备 称取各味药材（粗粉）适量，各加8倍量水浸泡20min，煎煮60min，过滤，滤液另器收集，药渣再加6倍量水煎煮60min，过滤，合并两次煎液，制备成各药材的煎液，常压80℃烘干，粉碎，得各单味药干浸膏粉。按处方比例称取适量干浸膏粉配研混合，得单味配方干浸膏粉备用。精密称取单味配方干浸膏粉约11472g置于具塞锥形瓶中，加入70%甲醇定容至25ml，超声处理30min，过滤，滤液备用。
223 阴性供试品溶液的制备
2231 空白溶液的制备 取70%甲醇溶液25ml，超声处理30 min，过滤，滤液备用。
2232 缺甘草溶液的制备 按“2221”项下方法制备不含甘草的空白对照溶液，备用。
23 方法学考察
231 专属性考察 精密吸取对照品溶液、供试品溶液和空白溶液各10μl，按“21”项下条件进样测定。结果见图1，阴性对照样品色谱图中在甘草苷、甘草酸铵相应保留时间位置未见吸收峰，表明其他成分对甘草苷、甘草酸铵含量测定无干扰。
232 线性关系考察 分别精密称取甘草苷对照品，甘草酸铵对照品各20mg，定容至10ml，作对照品储备液。取甘草苷对照品储备液，分别稀释成浓度为10、20、40、60、80μg/ml；取甘草酸铵对照品储备液，分别稀释成浓度为10、20、30、40、50μg/ml，按“21”项下条件进样测定、以甘草苷，甘草酸铵对照品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），计算甘草苷、甘草酸铵的回归方程分别为：Y=19787X-16037（r=09995）；Y=602X-44（r=09997）。结果表明甘草苷进样量在010～080μg与峰面积呈良好的线性关系，甘草酸铵进样量在010～050μg与峰面积呈良好的线性关系。
233 精密度试验 精密吸取“221”项下甘草苷、甘草酸铵对照品溶液，按“21”项下条件进样测定。重复进样测定6次，测得甘草苷峰面积值的RSD为075%，甘草酸铵峰面积值的RSD为074%，数据表明精密度良好。
234 稳定性实验 依据“2221”项下制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24h时进样，按“21”项下条件进样测定，测定其峰面积。甘草苷RSD为151%，甘草酸铵RSD为068%。说明供试品溶液在24h内稳定。
235 重复性试验 依据“2221”项下制备供试品溶液，分别制备6份，按“21”项下条件进样测定。甘草苷RSD为196%，甘草酸铵RSD为209%，结果表明重复性良好。
236 加样回收率试验 分别精密称取甘草苷及甘草酸铵对照品32mg、17mg，加70%甲醇定容至5ml。按照“221”项下的制备方法减半取样平行制备样品9份，分别置锥形瓶中，按高、中、低浓度精密加入甘草苷对照液084、101、126ml，甘草酸铵对照液074、088、11ml，分别按“2221”项下方法制备得供试品溶液，按“21”项下条件进样测定，分别测得样品中甘草苷及甘草酸铵的含量，计算加样回收率。结果甘草苷、甘草酸铵的平均回收率（n=9）分别为10036%（RSD=076%）、10043%（RSD=110%）。
24 样品含量测定 按“222”项下方法制备传统汤剂供试液、复方颗粒供试液及单味配方颗粒供试液，各3份，分别按“21”项下条件进样测定，样品溶液中甘草苷及甘草酸铵的含量结果见表2。
3 结果与讨论
探讨采用反相高效液相色谱法同时测定栀子柏皮汤中传统汤剂、复方颗粒、配方颗粒中甘草苷、甘草酸铵的含量，从而摸索这2个指标成分含量测定方法。进一步对栀子柏皮汤配方颗粒、汤剂和复方颗粒中甘草苷及甘草酸铵的含量进行比较，结果显示甘草苷含量（配方>汤剂>复方），甘草酸铵含量（配方>复方>汤剂），甘草苷和甘草酸铵在配方颗粒中含量均比其他剂型高，可能是因为两种成分在复方中煎煮时发生反应，减少含量。
实验考查了多种色谱条件，分别有乙腈-005%磷酸、甲醇-005%磷酸，并分别用不同洗脱程序分离；同时对流速、柱温等方面也进行考察选择最优条件。但是上述多种条件在分离甘草苷的时候都具有拖尾现象，且分离不好，而在流速为08ml/min，柱温为30℃，乙腈-甲醇-005%磷酸梯度洗脱色谱条件最好。
参考文献
[1]苗润田.伤寒论教程[M].北京：科学出版社，2000：167.
[2]郑占虎，董泽宏，余靖.中药现代研究与应用（第二卷）[M].北京：学苑出版社，1997.
[3]张科卫，崔小兵，吴皓，等.双波长梯度洗脱法测定栀子柏皮汤制剂中栀子苷、甘草苷的含量[J].中成药，2008，30（11）：1629-1631.
[4]彭小冰，靳凤云，李香，等.小青龙汤不同煎液中甘草苷的含量比较[J].时珍国医国药，2008，19（5）：1046-1047.
[5]吴杨，吕雄文，毛名扬，等.HPLC法测定甘黄燥湿洗液中盐酸小檗碱和甘草酸铵的含量[J].安徽医药，2009，13（4）：384-386.
[6]张爱君.HPLC法测定小儿止嗽丸中甘草酸铵含量[J].辽宁中医杂志，2008，3（56）：912-913.
[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010.
[8]朱怡洁，李勇，魏金津，等.RP-HPLC法同时测定皮而康胶囊中3个成分含量[J].药物分析杂志，2013，33（1）：116-119.
（收稿日期：20141214）