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【摘 要】 目的：建立消瘀跌打药酒制剂和其主药通城虎药材中马兜铃酸I的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法。选用Inertsil ODS-XP（4.6 mm×150 mm，5μm）色谱柱，甲醇-0.05%冰醋酸溶液（53∶47）为流动相洗脱，检测波长：250 nm，流速：1 mL·min-1，柱温：30 ℃。结果：马兜铃酸I的进样浓度在3.884～38.84 μg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系，回归方程Y=55825X-12839（r=0.9999）;消瘀跌打药酒中马兜铃酸I的回收率平均为99.08%，RSD为0.61%;通城虎中马兜铃酸I的回收率平均为98.65%，RSD为1.58%。结论：建立的消瘀跌打药酒制剂和通城虎药材中马兜铃酸I含量测定方法，简便，重现性良好，可用于药材与制剂的质量控制。
【关键词】 消瘀跌打药酒;通城虎;马兜铃酸I;成分分析
【中图分类号】R286 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）14-0044-03
Abstract：Objcetivet To establish the method for the content determination of aristolochic acid I in Xiaoyudieda medicinal liquor and Aristolochia fordiana Hemsl. Methods HPLC method.Chromatographic conditions were as follows： Inertsil ODS-XP（4.6 mm×150 mm，5 μm）column was used with mobile phase consisted of methanol-0.05%glacial acetic acid（53∶47） at a flow rate of 1.0 mL·min-1 under a detection wavelength at 250 nm. The column temperature was 30 ℃. Results The linear range of aristolochic acid I was 3.884～38.84 μg·mL-1，and the regression equation was Y=55825X-12839（r=0.9999）.The average recovery rate of aristolochic acid I in Xiaoyudieda medicinal liquor was 99.08%，RSD was 0.61%.The average recovery rate of aristolochic acid I in Aristolochia fordiana Hemsl was 98.65%，RSD was 1.58%. Conclusion The method established in the experiment can be used to determine the content of aristolochic acid I in Xiaoyudieda medicinal liquor and Aristolochia fordiana Hemsl. There were significant differences in aristolochic acid I content between different producing areas and different batches.
Keywords：Xiaoyudieda Medicinal Liquor;Aristolochia fordiana Hemsl; Aristolochic acid I ;Content Determination
通城虎，又名大力王藤、五虎通城、定心草等，為马兜铃科马兜铃属植物通城虎 Aristolochia fordiana Hemsl.的根或全株，其味苦、辛，性温，有小毒，有解毒消肿、祛风镇痛、行气止咳之功[1]，是两广及香港地区常用中草药，在广东新会地区民间被广泛使用，常用于胃痛、风湿骨痛、跌打损伤、毒蛇咬伤等。通城虎是我院传统制剂消瘀跌打药酒中的主要药材之一，该制剂具有驱风活血、散瘀止痛的功效，用于跌打腰痛、扭挫伤。通城虎含马兜铃酸类成分可在体内经一系列硝基还原酶代谢活化后与DNA共价结合形成加合物而诱发癌变，并通过诱导肾小管上皮细胞凋亡及间质纤维化而导致“马兜铃酸肾病 ”（AAN）[3]。马兜铃酸主要含有马兜铃酸I和马兜铃酸II两种化合物，其中前者是马兜铃酸主要的毒性成分，为了确定通城虎和其消瘀跌打药酒制剂的毒性成分含量，有效控制其内在质量和临床用药的安全，本实验参考有关文献报道[4-6]，采用高效液相色谱法，对通城虎药材和消瘀跌打药酒制剂中的马兜铃酸I进行含量测定，现报告如下。
1 仪器和试药
1.1 主要仪器 岛津LC-20A高效液相色谱仪（日本）;Jeken PS-10超声波清洗器（洁康超声波清洗机有限公司）;HZK-FA210电子天平（福州华志科学仪器有限公司）;MILLIPORE超纯水器（广州东锐科技有限公司）。
1.2 试药 马兜铃酸I对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110746-201611）;通城虎药材共2批次（160201，1905001）;消瘀跌打药酒（江门市新会区中医院配制，批号：20190301、20190725、20191126）;甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯，水为纯化水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-XP柱（4.6mm×150 mm，5 μm），流动相：甲醇-0.05%冰醋酸溶液（53∶47），检测波长250 nm，流速为1mL·min-1，柱温为30 ℃;进样量：10 μL。 2.2 流动相的选择 选用乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相进行试验[7]，结果样品色谱图中出现连续峰、分离度差。根据文献资料[8-9]，选用甲醇-0.05%冰醋酸溶液为流动相进行试验，所得色谱图中马兜铃酸I的分离度大于1.5，峰形良好，保留时间适合，作为本实验的流动相。
2.3 供试液的制备
2.3.1 对照品储备液的制备 精密称取马兜铃酸I对照品约9.71 mg，置50 mL量瓶中，加适量甲醇溶液，振荡溶解，加甲醇溶液定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液储备液，浓度为194.2 μg·mL-1。
2.3.2 马兜铃酸I对照品溶液的制备 精密吸取2.2.1对照品储备液1 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为马兜铃酸I对照品溶液，浓度为9.71 μg·mL-1。
2.3.3 通城虎供试品溶液的制备 精密称取通城虎药材粉末0.5150g，先加入10%氨水20 mL，浸泡40 min，超声处理30 min，滤过，滤液用乙醚洗涤2次，每次20 mL，弃去乙醚洗涤液，取水层加入稀盐酸调pH至3～4，再用乙醚萃取2次，每次20 mL，合并乙醚萃取液，水浴蒸干，残渣用甲醇10 mL溶解，0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液。
2.3.4 消瘀跌打药酒供试品溶液的制备 精密量取消瘀跌打药酒60 mL，水浴蒸干，残渣先加入10%氨水20 mL溶解，滤过，自滤液用乙醚洗涤2次，每次20 mL起，按2.3.4通城虎供试品溶液的制备方法操作，作为消瘀跌打药酒供试品溶液。
2.3.5 消瘀跌打酒阴性对照溶液的制备 取缺少通城虎药材的消瘀跌打酒阴性样品60 mL，按2.3.4消瘀跌打药酒供试品溶液的制备项下操作，作为阴性对照品溶液。
2.4 系统适应性试验 在2.1项下色谱条件下，分别精密吸取马兜铃酸I对照品溶液、消瘀跌打药酒供试品溶液、消瘀跌打药酒阴性对照溶液和通城虎供试品溶液各10 μL，分别注入高效液相色谱仪进行测定。结果表明，消瘀跌打药酒供试品液与马兜铃酸I对照品液的峰型和保留时间一致，消瘀跌打药酒阴性对照无干扰。如图1所示。
2.5 线性关系 精密量取2.2.1 对照品储备液5份，每份1 mL，分别加甲醇稀释至50、25、20、10、5 mL，摇匀，浓度分别为3.884、7.768、9.71、19.42和38.84 μg·mL-1。注入高效液相色譜仪，在2.1项下色谱条件下测定，以吸收峰面积Y为纵坐标，对照品溶液的进样量X为横坐标，计算得回归方程：Y=55825X-12839，相关系数r=0.9999。结果表明，马兜铃酸I对照品在0.03～0.38 μg范围内的进样量与色谱峰面积值的线性关系良好。
2.6 精密度试验 取马兜铃酸I对照品溶液，每次10 μL，连续重复进样5次，测定马兜铃酸I对照品峰面积的RSD为0.92%。
2.7 稳定性试验 取同一通城虎和消瘀跌打药酒供试品溶液，在0、2、4、6、8、10、24 h进样，其马兜铃酸I峰面积的RSD分别为1.24%、1.09%。试验表明供试品24h内稳定性良好。
2.8 重复性试验 分别取消瘀跌打药酒（批号：20190301）和通城虎（批号：160201）各5份，按上述供试品溶液的制备操作;计算马兜铃酸I的含量。消瘀跌打药酒中马兜铃酸I的平均含量为0.7133 μg·mL-1，RSD为1.31%;通城虎中马兜铃酸I的平均含量为0.0623 mg·g-1，RSD为1.09%。
2.9 回收率试验 精密吸取已知含量的消瘀跌打药酒样品（20190301，马兜铃酸I含量为0.7133 μg·mL-1）30 mL，称取已知含量的通城虎样品（160201，马兜铃酸I含量为0.0623 mg·g-1）约0.25 g，各制备5份，分别精密加入一定量的马兜铃酸I对照品，按上述供试品溶液的制备与测定方法操作，计算马兜铃酸I的回收率。消瘀跌打药酒中马兜铃酸I的回收率平均为99.08%，RSD为0.61%;通城虎中马兜铃酸I的回收率平均为98.65%，RSD为1.58%。
2.10 样品含量测定 按2.2.4项制备消瘀跌打药酒供试品溶液并测定，3批制剂样品中马兜铃酸I的含量测定结果见表1;按2.2.3项制备通城虎供试品溶液并测定，通城虎中马兜铃酸I含量测定结果见表2。
3 讨论
首先参考文献方法[10-11]，使用甲醇提取方法制备供试品溶液，结果得到的色谱图基线高、色谱峰数量多，而且在马兜铃酸I出峰位置有干扰;再参考文献资料方法[12-14]，结合实验品种情况作出调整，采用先在碱性水溶液中用乙醚洗涤、去除乙醚的可溶成分，将水层溶液加盐酸酸化，再用乙醚萃取的提取方法制备供试品溶液，减少样品中的非测定组分，结果在马兜铃酸I出峰位置无干扰，分离度好，色谱峰数量明显减少，因此选择上述方法制备通城虎及消瘀跌打药酒供试液。
本试验方法进行3批次消瘀跌打药酒马兜铃酸I的含量测定，马兜铃酸I的含量在0.7133～0.7298 μg/mL之间，平均含量是0.7206 μg/mL。各批次马兜铃酸I的含量相对标准偏差值为1.17%。2批次通城虎中马兜铃酸I平均含量为0.0617 mg·g-1。结果表明，建立的通城虎及消瘀跌打药酒中马兜铃酸I高效液相色谱含量测定方法准确、简便、快速、重复性好，适应药材及制剂的质量控制的要求。
参考文献
[1]南京中医药大学，赵国平，戴慎等.中药大词典（下册）[M].上海：上海科学技术出版社，2006： 2777-2778.
[2]昌水平，李华，蒋三元，等.通城虎的生药鉴定[J].中药材，2016，39（3）：523-526.
[3]常菲菲，王友群.马兜铃酸体内毒性的产生及防治研究进展[J].药学进展，2010，34（3）：25-32.
[4]周文杰，陈乾平，赵芯芝.高效液相色谱法测定通城虎中马兜铃酸I、II的含量[J].医药卫生，2016（25）：86-87.
[5]李成林，唐业建.复方通城虎散剂敷治膝关节炎疗效观察[J].亚太传统医药，2012，8（8）：66-67.
[6]邱泉，覃聪慧，黄秋燕，等.神农蛇药酒的质量标准研究[J].西部中医药，2019，32（6）：21-27.
[7]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：230.
[8]曾超，刘雪梅，蒙万香，等.HPLC 法测定不同产地细辛药材中马兜铃酸的含量[J].药物与临床，2013，8（1）：56-57.
[9]王连芝，曹玲.鼻炎胶囊质量标准研究[J].中国当代医药，2014，21（2）：8-10.
[10]宋双红，色林格，陈蓓，等. HPLC 法测定4 种细辛中马兜铃酸Ⅰ和细辛脂素[J]. 中成药，2014，36（8）：1711-1715.
[11]朱光辉，王奇志，王增寿，等. 反相高效液相色谱法测定甘露消毒丸中马兜铃酸Ⅰ、Ⅱ的含量[J]. 医药导报，2006，25（6）：568-570.
[12]唐秀玲，何颂华，谢谭芳.SPE - HPLC 法测定消肿止痛酊中马兜铃酸 A 的含量[J].药物分析杂志，2012，32（9）：1690-1693.
[13]何颂华，唐秀玲，桑彤，等.液相色谱-质谱联用法测定消肿止痛酊中马兜铃酸A的含量[J].中国药房，2013，24（20）：1907-1909.
[14]李小安，贾建忠，谭华森，等. 麻杏止咳糖浆质量标准研究[J].西北药学杂志，2017，32（6）：733-737.
（收稿日期：2020-12-16 编辑：程鹏飞）
【关键词】 消瘀跌打药酒;通城虎;马兜铃酸I;成分分析
【中图分类号】R286 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）14-0044-03
Abstract：Objcetivet To establish the method for the content determination of aristolochic acid I in Xiaoyudieda medicinal liquor and Aristolochia fordiana Hemsl. Methods HPLC method.Chromatographic conditions were as follows： Inertsil ODS-XP（4.6 mm×150 mm，5 μm）column was used with mobile phase consisted of methanol-0.05%glacial acetic acid（53∶47） at a flow rate of 1.0 mL·min-1 under a detection wavelength at 250 nm. The column temperature was 30 ℃. Results The linear range of aristolochic acid I was 3.884～38.84 μg·mL-1，and the regression equation was Y=55825X-12839（r=0.9999）.The average recovery rate of aristolochic acid I in Xiaoyudieda medicinal liquor was 99.08%，RSD was 0.61%.The average recovery rate of aristolochic acid I in Aristolochia fordiana Hemsl was 98.65%，RSD was 1.58%. Conclusion The method established in the experiment can be used to determine the content of aristolochic acid I in Xiaoyudieda medicinal liquor and Aristolochia fordiana Hemsl. There were significant differences in aristolochic acid I content between different producing areas and different batches.
Keywords：Xiaoyudieda Medicinal Liquor;Aristolochia fordiana Hemsl; Aristolochic acid I ;Content Determination
通城虎，又名大力王藤、五虎通城、定心草等，為马兜铃科马兜铃属植物通城虎 Aristolochia fordiana Hemsl.的根或全株，其味苦、辛，性温，有小毒，有解毒消肿、祛风镇痛、行气止咳之功[1]，是两广及香港地区常用中草药，在广东新会地区民间被广泛使用，常用于胃痛、风湿骨痛、跌打损伤、毒蛇咬伤等。通城虎是我院传统制剂消瘀跌打药酒中的主要药材之一，该制剂具有驱风活血、散瘀止痛的功效，用于跌打腰痛、扭挫伤。通城虎含马兜铃酸类成分可在体内经一系列硝基还原酶代谢活化后与DNA共价结合形成加合物而诱发癌变，并通过诱导肾小管上皮细胞凋亡及间质纤维化而导致“马兜铃酸肾病 ”（AAN）[3]。马兜铃酸主要含有马兜铃酸I和马兜铃酸II两种化合物，其中前者是马兜铃酸主要的毒性成分，为了确定通城虎和其消瘀跌打药酒制剂的毒性成分含量，有效控制其内在质量和临床用药的安全，本实验参考有关文献报道[4-6]，采用高效液相色谱法，对通城虎药材和消瘀跌打药酒制剂中的马兜铃酸I进行含量测定，现报告如下。
1 仪器和试药
1.1 主要仪器 岛津LC-20A高效液相色谱仪（日本）;Jeken PS-10超声波清洗器（洁康超声波清洗机有限公司）;HZK-FA210电子天平（福州华志科学仪器有限公司）;MILLIPORE超纯水器（广州东锐科技有限公司）。
1.2 试药 马兜铃酸I对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110746-201611）;通城虎药材共2批次（160201，1905001）;消瘀跌打药酒（江门市新会区中医院配制，批号：20190301、20190725、20191126）;甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯，水为纯化水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-XP柱（4.6mm×150 mm，5 μm），流动相：甲醇-0.05%冰醋酸溶液（53∶47），检测波长250 nm，流速为1mL·min-1，柱温为30 ℃;进样量：10 μL。 2.2 流动相的选择 选用乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相进行试验[7]，结果样品色谱图中出现连续峰、分离度差。根据文献资料[8-9]，选用甲醇-0.05%冰醋酸溶液为流动相进行试验，所得色谱图中马兜铃酸I的分离度大于1.5，峰形良好，保留时间适合，作为本实验的流动相。
2.3 供试液的制备
2.3.1 对照品储备液的制备 精密称取马兜铃酸I对照品约9.71 mg，置50 mL量瓶中，加适量甲醇溶液，振荡溶解，加甲醇溶液定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液储备液，浓度为194.2 μg·mL-1。
2.3.2 马兜铃酸I对照品溶液的制备 精密吸取2.2.1对照品储备液1 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为马兜铃酸I对照品溶液，浓度为9.71 μg·mL-1。
2.3.3 通城虎供试品溶液的制备 精密称取通城虎药材粉末0.5150g，先加入10%氨水20 mL，浸泡40 min，超声处理30 min，滤过，滤液用乙醚洗涤2次，每次20 mL，弃去乙醚洗涤液，取水层加入稀盐酸调pH至3～4，再用乙醚萃取2次，每次20 mL，合并乙醚萃取液，水浴蒸干，残渣用甲醇10 mL溶解，0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液。
2.3.4 消瘀跌打药酒供试品溶液的制备 精密量取消瘀跌打药酒60 mL，水浴蒸干，残渣先加入10%氨水20 mL溶解，滤过，自滤液用乙醚洗涤2次，每次20 mL起，按2.3.4通城虎供试品溶液的制备方法操作，作为消瘀跌打药酒供试品溶液。
2.3.5 消瘀跌打酒阴性对照溶液的制备 取缺少通城虎药材的消瘀跌打酒阴性样品60 mL，按2.3.4消瘀跌打药酒供试品溶液的制备项下操作，作为阴性对照品溶液。
2.4 系统适应性试验 在2.1项下色谱条件下，分别精密吸取马兜铃酸I对照品溶液、消瘀跌打药酒供试品溶液、消瘀跌打药酒阴性对照溶液和通城虎供试品溶液各10 μL，分别注入高效液相色谱仪进行测定。结果表明，消瘀跌打药酒供试品液与马兜铃酸I对照品液的峰型和保留时间一致，消瘀跌打药酒阴性对照无干扰。如图1所示。
2.5 线性关系 精密量取2.2.1 对照品储备液5份，每份1 mL，分别加甲醇稀释至50、25、20、10、5 mL，摇匀，浓度分别为3.884、7.768、9.71、19.42和38.84 μg·mL-1。注入高效液相色譜仪，在2.1项下色谱条件下测定，以吸收峰面积Y为纵坐标，对照品溶液的进样量X为横坐标，计算得回归方程：Y=55825X-12839，相关系数r=0.9999。结果表明，马兜铃酸I对照品在0.03～0.38 μg范围内的进样量与色谱峰面积值的线性关系良好。
2.6 精密度试验 取马兜铃酸I对照品溶液，每次10 μL，连续重复进样5次，测定马兜铃酸I对照品峰面积的RSD为0.92%。
2.7 稳定性试验 取同一通城虎和消瘀跌打药酒供试品溶液，在0、2、4、6、8、10、24 h进样，其马兜铃酸I峰面积的RSD分别为1.24%、1.09%。试验表明供试品24h内稳定性良好。
2.8 重复性试验 分别取消瘀跌打药酒（批号：20190301）和通城虎（批号：160201）各5份，按上述供试品溶液的制备操作;计算马兜铃酸I的含量。消瘀跌打药酒中马兜铃酸I的平均含量为0.7133 μg·mL-1，RSD为1.31%;通城虎中马兜铃酸I的平均含量为0.0623 mg·g-1，RSD为1.09%。
2.9 回收率试验 精密吸取已知含量的消瘀跌打药酒样品（20190301，马兜铃酸I含量为0.7133 μg·mL-1）30 mL，称取已知含量的通城虎样品（160201，马兜铃酸I含量为0.0623 mg·g-1）约0.25 g，各制备5份，分别精密加入一定量的马兜铃酸I对照品，按上述供试品溶液的制备与测定方法操作，计算马兜铃酸I的回收率。消瘀跌打药酒中马兜铃酸I的回收率平均为99.08%，RSD为0.61%;通城虎中马兜铃酸I的回收率平均为98.65%，RSD为1.58%。
2.10 样品含量测定 按2.2.4项制备消瘀跌打药酒供试品溶液并测定，3批制剂样品中马兜铃酸I的含量测定结果见表1;按2.2.3项制备通城虎供试品溶液并测定，通城虎中马兜铃酸I含量测定结果见表2。
3 讨论
首先参考文献方法[10-11]，使用甲醇提取方法制备供试品溶液，结果得到的色谱图基线高、色谱峰数量多，而且在马兜铃酸I出峰位置有干扰;再参考文献资料方法[12-14]，结合实验品种情况作出调整，采用先在碱性水溶液中用乙醚洗涤、去除乙醚的可溶成分，将水层溶液加盐酸酸化，再用乙醚萃取的提取方法制备供试品溶液，减少样品中的非测定组分，结果在马兜铃酸I出峰位置无干扰，分离度好，色谱峰数量明显减少，因此选择上述方法制备通城虎及消瘀跌打药酒供试液。
本试验方法进行3批次消瘀跌打药酒马兜铃酸I的含量测定，马兜铃酸I的含量在0.7133～0.7298 μg/mL之间，平均含量是0.7206 μg/mL。各批次马兜铃酸I的含量相对标准偏差值为1.17%。2批次通城虎中马兜铃酸I平均含量为0.0617 mg·g-1。结果表明，建立的通城虎及消瘀跌打药酒中马兜铃酸I高效液相色谱含量测定方法准确、简便、快速、重复性好，适应药材及制剂的质量控制的要求。
参考文献
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[5]李成林，唐业建.复方通城虎散剂敷治膝关节炎疗效观察[J].亚太传统医药，2012，8（8）：66-67.
[6]邱泉，覃聪慧，黄秋燕，等.神农蛇药酒的质量标准研究[J].西部中医药，2019，32（6）：21-27.
[7]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：230.
[8]曾超，刘雪梅，蒙万香，等.HPLC 法测定不同产地细辛药材中马兜铃酸的含量[J].药物与临床，2013，8（1）：56-57.
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[10]宋双红，色林格，陈蓓，等. HPLC 法测定4 种细辛中马兜铃酸Ⅰ和细辛脂素[J]. 中成药，2014，36（8）：1711-1715.
[11]朱光辉，王奇志，王增寿，等. 反相高效液相色谱法测定甘露消毒丸中马兜铃酸Ⅰ、Ⅱ的含量[J]. 医药导报，2006，25（6）：568-570.
[12]唐秀玲，何颂华，谢谭芳.SPE - HPLC 法测定消肿止痛酊中马兜铃酸 A 的含量[J].药物分析杂志，2012，32（9）：1690-1693.
[13]何颂华，唐秀玲，桑彤，等.液相色谱-质谱联用法测定消肿止痛酊中马兜铃酸A的含量[J].中国药房，2013，24（20）：1907-1909.
[14]李小安，贾建忠，谭华森，等. 麻杏止咳糖浆质量标准研究[J].西北药学杂志，2017，32（6）：733-737.
（收稿日期：2020-12-16 编辑：程鹏飞）