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摘要 目的：运用网络药理学结合分子对接技术研究参芪扶正注射液抗非小细胞肺癌（NSCLC）的活性成分及作用机制，为临床应用提供理论依据。方法：应用中药系统药理学数据库与分析平台（ TCMSP）获取参芪扶正注射液的活性成分及靶点，通过美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库获取NSCLC与正常肺组织的差异基因，并采用STRING数据库及Cytoscape构建共同靶点可视化网络图。借助DAVID数据库实现基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG） 富集分析，利用AutoDock Vina和PyMoL进行分子对接以验证。结果：获取参芪扶正注射液活性成分41个，NSCLC差异基因2 861个，共同靶点58个。GO分析显示生物学过程主要涉及对类固醇激素、氧化应激、多种化学物理因素刺激等反应的调节;KEGG富集显示主要通过TNF、Relaxin、IL-17、P13K/AKT、Estrogen等通路发挥抗癌作用。分子对接表明药物主要活性成分与关键靶点结合性较好，从分子层面对参芪扶正注射液的有效性进行了验证。结论：运用网络药理学及分子对接的方法证明参芪扶正注射液通过多成分、多靶点、多通路发挥对NSCLC的治疗作用，并为临床应用提供了理论支持。
关键词 参芪扶正注射液;非小细胞肺癌;网络药理学;分子对接
Abstract Objective：To explore the active components and mechanism of Shenqi Fuzheng Injection for the treatment of non-small cell lung cancer（NSCLC） by network pharmacology and molecular docking technology，and to provide theoretical basis for clinical application.Methods：TCMSP database was used to obtain the active components and targets of Shenqi Fuzheng Injection.The differential genes between NSCLC and normal lung tissue were obtained by NCBI database.And the visual network of common targets was drawed by STRING database and Cytoscape.The DAVID database was used to perform GO analysis and KEGG pathway analysis.The molecular docking technology was carried out by using AutoDock Vina and PyMOL for further verification.Results：A total of 41 active components of Shenqi Fuzheng Injection，2 861 differential genes of NSCLC and 58 common targets were obtained.GO enrichment analysis showed that the biological process mainly involved in the regulation of steroid hormone，oxidative stress response，and multiple chemical and physical responses; KEGG enrichment showed that anti-cancer effect was mainly through TNF pathway，Relaxin pathway，IL-17 pathway，P13K/AKT pathway and Estrogen pathway.The results of molecular docking showed that the main active components had good binding with key targets，and the effectiveness of Shenqi Fuzheng Injection was verified from the molecular level.Conclusion：The therapeutic effect of Shenqi Fuzheng Injection on NSCLC through multi-components，multi-targets and multi-pathways can be proved by network pharmacology and molecular docking，which provides theoretical support for clinical application.
Keywords Shenqi Fuzheng Injection; Non-small cell lung cancer; Network pharmacology; Molecular docking
中圖分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.001
原发性支气管肺癌简称肺癌，是我国及全球范围内最常见的严重威胁人群生命和健康的恶性肿瘤。2018年全球癌症数据统计显示，肺癌以11.6%的发病率及18.4%的病死率高居所有类型癌症榜首[1]。同时，根据癌症中心提供的数据，我国肺癌患者人数约为78.1万且以2%～3%的增长率逐年增多[2]。其中，非小细胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer，NSCLC）占肺癌患者总数的绝大部分，且由于其癌细胞生长分裂速度慢，扩散转移相对较晚，2/3的患者确诊时已为晚期或发生远处转移从而丧失手术机会[3]。化疗是这部分患者的标准治疗措施，但由于不良反应大，且严重影响患者生命质量。故寻求不良反应小且有疗效的NSCLC替代或辅助支持疗法具有重大的临床意义。 参芪扶正注射液（Shenqi Fuzheng Injection，SFI）是以党参和黄芪为主要成分的中药制剂。中医认为党参益气养精、健脾益肺;而黄芪具有补气固表的功效[4]。现代药理研究证实参芪扶正注射液能够抑制炎症介质产生抗炎作用，通过调控细胞周期促进癌细胞凋亡从而产生抗肿瘤、增强机体免疫力等多种药理作用[5-6]。该中药制剂临床应用多年，常用于肺癌、胃癌等多种癌症的辅助治疗。同时临床研究表明，参芪扶正注射液在改善中晚期肺癌患者生命质量，减轻放化疗不良反应并提高其疗效等方面具有良好的临床疗效[7-8]。但其具体的作用机制和有效活性成分有待进一步研究，以便更好地指导临床用药。
由于中医药治疗疾病具有多种成分、多个靶点、多条通路共同发挥作用的特点，对复方中药治疗疾病的生物学机制研究需兼顾整体性和系统性。网络药理学是一种研究中药活性化合物、作用靶标和疾病之间相互作用的新方法，本质上是基于大数据信息挖掘的系统生物学。该方法对于药物功效的评价、作用机制的研究具有科学性和可视化的特点[9]。分子对接技术将药物小分子作为配体与受体蛋白进行3D结构间的对接，来预测蛋白和药物分子的亲和力及结合模式从而达到药物设计及验证的目的。基于此，本研究运用网络药理学探索参芪扶正注射液核心活性成分和靶点，并结合生物学、通路分析和分子对接技术，预测其干预NSCLC的作用机制，从而为参芪扶正注射液临床运用提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 参芪扶正注射液中化合物收集
将参芪扶正注射液主要成分“党参”“黄芪”作为关键词，输入至中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），检索出成分对应的化合物。
1.2 药物的活性成分和靶蛋白筛选
药物口服生物利用度（OB）是药动学ADME参数中的重要指标之一，指药物中有效活性成分经吸收进入人体血液循环的速度与程度。OB值越低提示药物的治疗效果可能越差。类药性（DL）是指某化合物与已知药物的相似程度，通常DL值越低，该化合物作为药物活性成分的可能性越低[10]。因此，以OB≥30%和DL≥0.18为标准，进一步筛选出具有较高生物学活性的成分。将成分在TCMSP中进行药物靶标的匹配，并将获取的靶标经Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）校正为标准基因名。
1.3 NSCLC差异基因获取
通过NCBI平台（National Center for Biotechnology Information，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的GEO数据库，将物种选择为智人且样本量以>20为选择标准，下载非小细胞肺癌及癌旁正常肺组织DNA测序数据。利用R语言edgR软件包对肺癌差异表达基因做进一步分析，设置logFCfilter≥1，显著性P-value>0.05，并使用R语言gplots软件包绘制差异基因火山图及热图。
1.4 药物和疾病共同靶点获取
利用VENNY 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny），对非小细胞肺癌差异基因和参芪扶正注射液主要化合物的靶点进行比较，筛选出共同作用靶点，并绘制Venny图。
1.5 构建“药物-成分-靶点-疾病”网络
利用复杂网络可视化分析和编辑软件Cytoscape（Version3.7.2）构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图。在网络中，节点（Node）代表党参和黄芪、药物活性成分、关键靶基因以及非小细胞肺癌。边（Edge）代表党参、黄芪与对应活性成分、活性成分与靶基因、疾病与靶基因相互作用关系。
1.6 构建蛋白质-蛋白质相互作用（ PPI）网络
利用STRING平台（https：//string-db.org/）构建交集靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并利用R语言绘制相互作用关系最高的前20个靶点蛋白柱状图。以明确参芪扶正注射液中的主要有效成分“党参”“黄芪”对非小细胞肺癌的作用关键靶点。
1.7 通路富集分析
将获取到的交集基因导入至DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov）进行基因本体（GO）生物学功能富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析。并借助Omicshare平台（https：//www.omicshare.com/tools/）及R语言中ggplot2包将富集得到的结果绘制成气泡图和柱状图。最后应用Cytoscape软件构建参芪扶正注射液主要药物成分-靶点-信号通路网络结构图。
1.8 分子对接
从PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）下载PPI网络中相互作用Degree值前4位核心蛋白的3D结构，并从PubChem数据库（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）及ZINC数据库（http：//zinc.docking.org）下载网络图中Degree值最高的前4位活性小分子的3D结构。应用AutoDock Tools 1.5.6对获取的小分子及蛋白3D结构进行去水、加氢、计算电荷等处理后，导入到AutoDock Vina进行对接，计算出药物活性成分与靶蛋白相结合所需的最低结合效能。再利用Pymol2.1.1将对接所获得的相互作用结构进行可视化处理。
2 结果
2.1 药物活性成分获取
在TCMSP数据库中以黨参、黄芪进行检索，共计获得221个化合物（党参134个、黄芪87个），并根据OB≥30%和DL≥0.18筛选后共获得活性成分41个，其中党参21个、黄芪20个，二者无重叠成分。见表1。 2.2 药物靶点的获取
借助TCMSP对41个活性化合物进行靶点筛选，共获得210个靶点，其中黄芪101个，党参189个，80个为共有的重叠靶点。
2.3 非小细胞肺癌的差异基因获取
通过NCBI平台以“NSCLC Normal”为关键词在GEO数据库中进行检索，以样本量>20、人类非小细胞肺癌组织与正常肺组织为标本进行筛选，下载目标表达谱（GSE21933）的平台文件及样本文件。获取非小细胞肺癌差异基因2 861个，并借助R语言绘制出差异基因的热图。见图1。火山图见图2。
2.4 共同靶点的获取
为了进一步明确参芪扶正注射液和NSCLC的共同靶点，经过对获得的非小细胞肺癌相关差异基因2 861个及药物的预测靶点210个进行比较筛选后，筛选出二者共同作用靶点58个。见图3。具体基因名及entrez ID见表2。
2.5 构建PPI网络
将获取到的58个交集靶点蛋白输入String平台，设置置信度为Highest≥0.9，并剔除独立于网络以外的靶点，构建PPI网络。见图4。根据相互作用关系性高低，利用R语言绘制最高的前20项基因的柱状图，获取核心蛋白。见图5。
2.6 药物-成分-靶点-疾病共表达网络构建
制作党参、黄芪与对应药物活性成分、活性成分与关键靶基因、关键靶基因与非小细胞肺癌相互作用关系以及节点属性文件，并导入到Cytoscape构建“药物-成分-靶点-疾病”网络。见图6。使用CentiScape计算药物活性成分Degree值，该值越大说明对应的节点在网络中越重要。其中，根据与非小细胞肺癌的关系度值由高至低排名前5的药物成分：槲皮素（Quercetin）为44、木犀草素（Luteolin）为20、刺芒柄花素（Formononetin）为12、山柰酚（Kaempferol）为12、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇（7-O-methylisomucronulatol）为10。见表3。
2.7 GO富集分析
利用DAVID数据库对相关靶点蛋白进行分子功能、细胞组分和生物过程3个方面的GO分析，综合校正后的P值及富集在该功能区基因数目。见图7。分别选择排名靠前的条目借助Omicshare平台作条形图呈现。见图8。分析结果显示，上述蛋白在生物过程方面主要涉及对类固醇激素、氧化应激反应、多种化学物理因素对细胞的刺激反应等过程的调节;细胞组分方面主要是影响细胞膜的小凹、微区、膜筏以及细胞核染色质体等;在分子功能方面主要是调控类固醇激素及结合、DNA转录激活、多种肽酶活性功能。推测参芪扶正注射液可能通过以上功能过程在NSCLC的治疗中发挥其扶正益气、养精补血的功效。
2.8 KEGG通路富集分析
对58个抗癌关键基因进行KEGG分析。见图9。共富集64条通路，根据校正后P值进行排序，选择前20项通路绘制气泡图展示，主要涉及肿瘤转录失控（Transcriptional Misregulation in Cancer）、癌症中的MicroRNAs（MicroRNAs in Cancer）、多种病毒感染、细胞衰老和细胞周期（Cellular Senescence，Cell cycle）、前列腺癌（Prostate Cancer）、非小细胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer）等信号通路。排除广泛通路后，前15条信号通路见表4，其中肿瘤坏死因子（TNF）通路涉及PTGS2、MMP9、JUN、IL6、ICAM1、SELE等基因;松弛素（Relaxin）信号通路涉及EGFR、VEGFA、MMP9、JUN、MMP1、MMP13等基因;白细胞介素-17（IL-17）通路涉及PTGS2、MMP9、JUN、IL6、MMP1、MMP13等基因;磷脂酰肌醇3-羟激酶-苏氨酸激酶（PI3K-AKT）信号通路涉及EGFR、VEGFA、CDKN1A、IL6、IL2、NOS3等基因;雌激素（Estrogen）信号通路涉及ESR1、EGFR、MMP9、JUN、FOS、NOS3、CTSD基因。
2.9 药物成分-靶基因-信号通路共表达网络构建
应用Cytoscape绘制参芪扶正注射液核心成分-关键靶点-主要信号通路网络结构图。见图10。可见药物活性成分分别作用于单个或多个靶点基因，并通过对应的信号通路发挥调控作用，证明了参芪扶正注射液治疗NSCLC具有多成分、多靶点、多通路的机制。
2.10 分子對接
对网络图中Degree值前4的药物有效成分与PPI网络中相互作用度值最高的前4位核心蛋白进行分子对接，Autodock软件对接结果见表5。配体与蛋白相结合时所需结合效能<0则说明二者可以自发结合，且二者亲和力越强，所需的结合效能越低。对接结果显示，前4位药物有效成分与所选取的核心蛋白之间的结合能均低于-5 kJ/mol，表明具有较好的结合活性，证明参芪扶正注射液主要通过上述活性成分作用于对应的关键蛋白发挥抗NSCLC的治疗作用。最后利用Pymol软件对其进行可视化分析处理，从而进一步研究这些小分子成分与蛋白质的相互作用关系。见图11。
3 讨论
非小细胞肺癌是肺癌分型中占比最大、预后最差的一种类型。中医学将其归于“肺积”“息贲”等范畴，并认为它的发生是由于内因（正气虚损）、外因（癌毒侵袭）等多种因素共同作用的结果[11]。因此，扶正固本，活血化瘀祛痰为NSCLC的重要治疗原则。参芪扶正注射液是以党参、黄芪为组成成分的中药制剂，其中黄芪为君药补中益气、健脾益肺;党参为臣药补气固表、活血化瘀。二者合用使扶正固本、益气健脾肺的功效得到增强，从而与非小细胞肺癌的病机相契合[8]。但为了更全面地研究参芪扶正注射液对NSCLC的治疗作用，本研究采用网络药理学联合分子对接技术对其有效成分、潜在靶点和具体作用机制进行研究。 4 结语
本研究采用网络药理学联合分子对接的方法，对参芪扶正注射液治疗NSCLC的核心有效成分、关键作用靶点蛋白进行获取，并对交集靶标进行GO和KEGG富集分析，阐明了参芪扶正注射液通过多化合物、多靶点、多通路作用于NSCLC，为临床应用提供了科學理论。但由于本研究基于大数据挖掘，具有一定的局限性，故仍需要临床研究及体内外研究以验证我们的发现。
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（2020-12-03收稿 責任编辑：马雪玲，徐颖）
关键词 参芪扶正注射液;非小细胞肺癌;网络药理学;分子对接
Abstract Objective：To explore the active components and mechanism of Shenqi Fuzheng Injection for the treatment of non-small cell lung cancer（NSCLC） by network pharmacology and molecular docking technology，and to provide theoretical basis for clinical application.Methods：TCMSP database was used to obtain the active components and targets of Shenqi Fuzheng Injection.The differential genes between NSCLC and normal lung tissue were obtained by NCBI database.And the visual network of common targets was drawed by STRING database and Cytoscape.The DAVID database was used to perform GO analysis and KEGG pathway analysis.The molecular docking technology was carried out by using AutoDock Vina and PyMOL for further verification.Results：A total of 41 active components of Shenqi Fuzheng Injection，2 861 differential genes of NSCLC and 58 common targets were obtained.GO enrichment analysis showed that the biological process mainly involved in the regulation of steroid hormone，oxidative stress response，and multiple chemical and physical responses; KEGG enrichment showed that anti-cancer effect was mainly through TNF pathway，Relaxin pathway，IL-17 pathway，P13K/AKT pathway and Estrogen pathway.The results of molecular docking showed that the main active components had good binding with key targets，and the effectiveness of Shenqi Fuzheng Injection was verified from the molecular level.Conclusion：The therapeutic effect of Shenqi Fuzheng Injection on NSCLC through multi-components，multi-targets and multi-pathways can be proved by network pharmacology and molecular docking，which provides theoretical support for clinical application.
Keywords Shenqi Fuzheng Injection; Non-small cell lung cancer; Network pharmacology; Molecular docking
中圖分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.001
原发性支气管肺癌简称肺癌，是我国及全球范围内最常见的严重威胁人群生命和健康的恶性肿瘤。2018年全球癌症数据统计显示，肺癌以11.6%的发病率及18.4%的病死率高居所有类型癌症榜首[1]。同时，根据癌症中心提供的数据，我国肺癌患者人数约为78.1万且以2%～3%的增长率逐年增多[2]。其中，非小细胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer，NSCLC）占肺癌患者总数的绝大部分，且由于其癌细胞生长分裂速度慢，扩散转移相对较晚，2/3的患者确诊时已为晚期或发生远处转移从而丧失手术机会[3]。化疗是这部分患者的标准治疗措施，但由于不良反应大，且严重影响患者生命质量。故寻求不良反应小且有疗效的NSCLC替代或辅助支持疗法具有重大的临床意义。 参芪扶正注射液（Shenqi Fuzheng Injection，SFI）是以党参和黄芪为主要成分的中药制剂。中医认为党参益气养精、健脾益肺;而黄芪具有补气固表的功效[4]。现代药理研究证实参芪扶正注射液能够抑制炎症介质产生抗炎作用，通过调控细胞周期促进癌细胞凋亡从而产生抗肿瘤、增强机体免疫力等多种药理作用[5-6]。该中药制剂临床应用多年，常用于肺癌、胃癌等多种癌症的辅助治疗。同时临床研究表明，参芪扶正注射液在改善中晚期肺癌患者生命质量，减轻放化疗不良反应并提高其疗效等方面具有良好的临床疗效[7-8]。但其具体的作用机制和有效活性成分有待进一步研究，以便更好地指导临床用药。
由于中医药治疗疾病具有多种成分、多个靶点、多条通路共同发挥作用的特点，对复方中药治疗疾病的生物学机制研究需兼顾整体性和系统性。网络药理学是一种研究中药活性化合物、作用靶标和疾病之间相互作用的新方法，本质上是基于大数据信息挖掘的系统生物学。该方法对于药物功效的评价、作用机制的研究具有科学性和可视化的特点[9]。分子对接技术将药物小分子作为配体与受体蛋白进行3D结构间的对接，来预测蛋白和药物分子的亲和力及结合模式从而达到药物设计及验证的目的。基于此，本研究运用网络药理学探索参芪扶正注射液核心活性成分和靶点，并结合生物学、通路分析和分子对接技术，预测其干预NSCLC的作用机制，从而为参芪扶正注射液临床运用提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 参芪扶正注射液中化合物收集
将参芪扶正注射液主要成分“党参”“黄芪”作为关键词，输入至中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），检索出成分对应的化合物。
1.2 药物的活性成分和靶蛋白筛选
药物口服生物利用度（OB）是药动学ADME参数中的重要指标之一，指药物中有效活性成分经吸收进入人体血液循环的速度与程度。OB值越低提示药物的治疗效果可能越差。类药性（DL）是指某化合物与已知药物的相似程度，通常DL值越低，该化合物作为药物活性成分的可能性越低[10]。因此，以OB≥30%和DL≥0.18为标准，进一步筛选出具有较高生物学活性的成分。将成分在TCMSP中进行药物靶标的匹配，并将获取的靶标经Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）校正为标准基因名。
1.3 NSCLC差异基因获取
通过NCBI平台（National Center for Biotechnology Information，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的GEO数据库，将物种选择为智人且样本量以>20为选择标准，下载非小细胞肺癌及癌旁正常肺组织DNA测序数据。利用R语言edgR软件包对肺癌差异表达基因做进一步分析，设置logFCfilter≥1，显著性P-value>0.05，并使用R语言gplots软件包绘制差异基因火山图及热图。
1.4 药物和疾病共同靶点获取
利用VENNY 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny），对非小细胞肺癌差异基因和参芪扶正注射液主要化合物的靶点进行比较，筛选出共同作用靶点，并绘制Venny图。
1.5 构建“药物-成分-靶点-疾病”网络
利用复杂网络可视化分析和编辑软件Cytoscape（Version3.7.2）构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图。在网络中，节点（Node）代表党参和黄芪、药物活性成分、关键靶基因以及非小细胞肺癌。边（Edge）代表党参、黄芪与对应活性成分、活性成分与靶基因、疾病与靶基因相互作用关系。
1.6 构建蛋白质-蛋白质相互作用（ PPI）网络
利用STRING平台（https：//string-db.org/）构建交集靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并利用R语言绘制相互作用关系最高的前20个靶点蛋白柱状图。以明确参芪扶正注射液中的主要有效成分“党参”“黄芪”对非小细胞肺癌的作用关键靶点。
1.7 通路富集分析
将获取到的交集基因导入至DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov）进行基因本体（GO）生物学功能富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析。并借助Omicshare平台（https：//www.omicshare.com/tools/）及R语言中ggplot2包将富集得到的结果绘制成气泡图和柱状图。最后应用Cytoscape软件构建参芪扶正注射液主要药物成分-靶点-信号通路网络结构图。
1.8 分子对接
从PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）下载PPI网络中相互作用Degree值前4位核心蛋白的3D结构，并从PubChem数据库（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）及ZINC数据库（http：//zinc.docking.org）下载网络图中Degree值最高的前4位活性小分子的3D结构。应用AutoDock Tools 1.5.6对获取的小分子及蛋白3D结构进行去水、加氢、计算电荷等处理后，导入到AutoDock Vina进行对接，计算出药物活性成分与靶蛋白相结合所需的最低结合效能。再利用Pymol2.1.1将对接所获得的相互作用结构进行可视化处理。
2 结果
2.1 药物活性成分获取
在TCMSP数据库中以黨参、黄芪进行检索，共计获得221个化合物（党参134个、黄芪87个），并根据OB≥30%和DL≥0.18筛选后共获得活性成分41个，其中党参21个、黄芪20个，二者无重叠成分。见表1。 2.2 药物靶点的获取
借助TCMSP对41个活性化合物进行靶点筛选，共获得210个靶点，其中黄芪101个，党参189个，80个为共有的重叠靶点。
2.3 非小细胞肺癌的差异基因获取
通过NCBI平台以“NSCLC Normal”为关键词在GEO数据库中进行检索，以样本量>20、人类非小细胞肺癌组织与正常肺组织为标本进行筛选，下载目标表达谱（GSE21933）的平台文件及样本文件。获取非小细胞肺癌差异基因2 861个，并借助R语言绘制出差异基因的热图。见图1。火山图见图2。
2.4 共同靶点的获取
为了进一步明确参芪扶正注射液和NSCLC的共同靶点，经过对获得的非小细胞肺癌相关差异基因2 861个及药物的预测靶点210个进行比较筛选后，筛选出二者共同作用靶点58个。见图3。具体基因名及entrez ID见表2。
2.5 构建PPI网络
将获取到的58个交集靶点蛋白输入String平台，设置置信度为Highest≥0.9，并剔除独立于网络以外的靶点，构建PPI网络。见图4。根据相互作用关系性高低，利用R语言绘制最高的前20项基因的柱状图，获取核心蛋白。见图5。
2.6 药物-成分-靶点-疾病共表达网络构建
制作党参、黄芪与对应药物活性成分、活性成分与关键靶基因、关键靶基因与非小细胞肺癌相互作用关系以及节点属性文件，并导入到Cytoscape构建“药物-成分-靶点-疾病”网络。见图6。使用CentiScape计算药物活性成分Degree值，该值越大说明对应的节点在网络中越重要。其中，根据与非小细胞肺癌的关系度值由高至低排名前5的药物成分：槲皮素（Quercetin）为44、木犀草素（Luteolin）为20、刺芒柄花素（Formononetin）为12、山柰酚（Kaempferol）为12、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇（7-O-methylisomucronulatol）为10。见表3。
2.7 GO富集分析
利用DAVID数据库对相关靶点蛋白进行分子功能、细胞组分和生物过程3个方面的GO分析，综合校正后的P值及富集在该功能区基因数目。见图7。分别选择排名靠前的条目借助Omicshare平台作条形图呈现。见图8。分析结果显示，上述蛋白在生物过程方面主要涉及对类固醇激素、氧化应激反应、多种化学物理因素对细胞的刺激反应等过程的调节;细胞组分方面主要是影响细胞膜的小凹、微区、膜筏以及细胞核染色质体等;在分子功能方面主要是调控类固醇激素及结合、DNA转录激活、多种肽酶活性功能。推测参芪扶正注射液可能通过以上功能过程在NSCLC的治疗中发挥其扶正益气、养精补血的功效。
2.8 KEGG通路富集分析
对58个抗癌关键基因进行KEGG分析。见图9。共富集64条通路，根据校正后P值进行排序，选择前20项通路绘制气泡图展示，主要涉及肿瘤转录失控（Transcriptional Misregulation in Cancer）、癌症中的MicroRNAs（MicroRNAs in Cancer）、多种病毒感染、细胞衰老和细胞周期（Cellular Senescence，Cell cycle）、前列腺癌（Prostate Cancer）、非小细胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer）等信号通路。排除广泛通路后，前15条信号通路见表4，其中肿瘤坏死因子（TNF）通路涉及PTGS2、MMP9、JUN、IL6、ICAM1、SELE等基因;松弛素（Relaxin）信号通路涉及EGFR、VEGFA、MMP9、JUN、MMP1、MMP13等基因;白细胞介素-17（IL-17）通路涉及PTGS2、MMP9、JUN、IL6、MMP1、MMP13等基因;磷脂酰肌醇3-羟激酶-苏氨酸激酶（PI3K-AKT）信号通路涉及EGFR、VEGFA、CDKN1A、IL6、IL2、NOS3等基因;雌激素（Estrogen）信号通路涉及ESR1、EGFR、MMP9、JUN、FOS、NOS3、CTSD基因。
2.9 药物成分-靶基因-信号通路共表达网络构建
应用Cytoscape绘制参芪扶正注射液核心成分-关键靶点-主要信号通路网络结构图。见图10。可见药物活性成分分别作用于单个或多个靶点基因，并通过对应的信号通路发挥调控作用，证明了参芪扶正注射液治疗NSCLC具有多成分、多靶点、多通路的机制。
2.10 分子對接
对网络图中Degree值前4的药物有效成分与PPI网络中相互作用度值最高的前4位核心蛋白进行分子对接，Autodock软件对接结果见表5。配体与蛋白相结合时所需结合效能<0则说明二者可以自发结合，且二者亲和力越强，所需的结合效能越低。对接结果显示，前4位药物有效成分与所选取的核心蛋白之间的结合能均低于-5 kJ/mol，表明具有较好的结合活性，证明参芪扶正注射液主要通过上述活性成分作用于对应的关键蛋白发挥抗NSCLC的治疗作用。最后利用Pymol软件对其进行可视化分析处理，从而进一步研究这些小分子成分与蛋白质的相互作用关系。见图11。
3 讨论
非小细胞肺癌是肺癌分型中占比最大、预后最差的一种类型。中医学将其归于“肺积”“息贲”等范畴，并认为它的发生是由于内因（正气虚损）、外因（癌毒侵袭）等多种因素共同作用的结果[11]。因此，扶正固本，活血化瘀祛痰为NSCLC的重要治疗原则。参芪扶正注射液是以党参、黄芪为组成成分的中药制剂，其中黄芪为君药补中益气、健脾益肺;党参为臣药补气固表、活血化瘀。二者合用使扶正固本、益气健脾肺的功效得到增强，从而与非小细胞肺癌的病机相契合[8]。但为了更全面地研究参芪扶正注射液对NSCLC的治疗作用，本研究采用网络药理学联合分子对接技术对其有效成分、潜在靶点和具体作用机制进行研究。 4 结语
本研究采用网络药理学联合分子对接的方法，对参芪扶正注射液治疗NSCLC的核心有效成分、关键作用靶点蛋白进行获取，并对交集靶标进行GO和KEGG富集分析，阐明了参芪扶正注射液通过多化合物、多靶点、多通路作用于NSCLC，为临床应用提供了科學理论。但由于本研究基于大数据挖掘，具有一定的局限性，故仍需要临床研究及体内外研究以验证我们的发现。
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（2020-12-03收稿 責任编辑：马雪玲，徐颖）