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【摘要】作为对超微结构进行研究的一种重要手段，扫描电子显微镜在生命科学领域的应用受到高度重视。作者以“突出应用，简化原理、立足平台仪器”为原则，从课程目标、课程内容、课程完成的情况等方面，探索为生命科学学院研究生开设扫描电镜课程的创新方法。
【关键词】扫描电子显微镜 生命科学 研究生课程 创新方法
【基金项目】由“中央高校基本科研业务费专项资金”重点研究基地团队建设项目资助的，项目编号：lzujbky-2014-bt05。
【中图分类号】G64 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2016）06-0016-02
生命科学的理论和应用归根到底来自实验，并由实验检验。近30年来，生命科学的发展极其迅速，取得了一系列令人瞩目的成就。其中，大型精密仪器的作用功不可没。大型仪器为研究生命物质的作用和功能提供了定位、定性、定量，甚至实时的数据和图片，为生命科学的重大发现提供着强有力的实验证据，决定性地引导着相关研究领域的发展方向。扫描电子显微镜是一种用电子束扫描样品表面，通过电子束与样品的相互作用产生多种效应，从而获取样品表面放大的形貌像。这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的，其放大倍率从几倍到几十万倍连续可调，景深大，分辨率高，保真度好。在立体、清晰、多观察角度等方面均较普通光学显微镜有不可比拟的优越性。作为对超微结构进行研究的一种重要手段，在生命科学研究领域的应用受到高度重视。因此，为研究生设置扫描电镜课的重要意义不言而喻。
1.课程内容的设置
本门课程是以兰州大学研究型生命科学大型仪器共享平台为依托，授课所使用的Hitachi 3400N型扫描电镜隶属于该平台，授课团队的各成员均来自于该平台，且具有较丰富的生命科学的教育和科研背景，授课的对象也是生命科学各专业的研究生。基于此，并针对将经常到平台使用扫描电镜的各专业研究生的学习特点和科研任务，本课程内容的设置原则是：突出应用，简化原理、立足平台仪器。课程内容强调扫描电镜的功能及其各项性能指标在生物体系内的科学意义，简化仪器本身复杂的物理化学原理。这种将仪器功能和生物学特征直接联系的课程，拉近了扫描电镜和学生之间的距离。
1.1 课程目标
对授课对象而言，本课程的目标主要分三个方面：理论知识目标、能力目标和素质目标。理论知识目标是让学生了解Hitachi 3400N型扫描电镜的工作原理、仪器构造，掌握重要的仪器性能指标和相关的仪器术语；掌握基本的样品制备方法；掌握获取优质扫描电子像的方法。能力目标是让学生能够正确地使用和操作仪器，能够简单排除故障，学会知识迁移的能力，从而多角度、多参数、多指标的去验证实验中所得到的相同的理论结果。素质目标是培养学生的安全意识；培养学生精益求精、实事求是、一丝不苟的科研素质；培养学生的创新素质。对授课者及所属仪器共享平台而言，其目标是增强管理人员的业务素质，缓解平台技术力量不足，提高扫描电镜的利用效率等。
1.2 课程内容的设置
本课程的内容见图1。课程内容分课堂讲授理论知识和上机实训两个部分。本门课程总学时为18个学时，理论知识占6个学时，上机实训占12个学时。理论知识采取集中授课的方式进行，上机实训按专业特点和研究方向分为植物组、动物组、微生物组和细胞组，各组独立制样，上机实训；按实验目的、实验步骤、实验结果和讨论的内容完成并提交实验报告；最后分组讨论。
2.课程的完成情况及结果
2.1 课程完成情况
顺利完成了理论知识讲授部分。因授课人员和扫描电镜资源的缺乏，选课人数控制在15人以内，实际选课人数为15人。把15人按研究方向分为四组，分组情况及各组的实验目的见表1。按组进行上机实训，以下将对上机实训的情况做相关陈述。
（1） 样品制备方法的探索
探索样品的制备方法，该任务由微生物组和植物组来完成。微生物组所用材料为柠檬酸杆菌，样品制备实验共分四组，考察固定次数、固定时间和脱水剂浓度梯度、脱水时间对扫描图像的影响，各组的实验步骤和所用材料、试剂见表2。植物组所用材料为拟南芥叶片和紫萍叶片，样品制备共分三组，考察三种不同的样品处理方式对扫描图像的影响，各组的实验步骤和所用材料、试剂见表3。
动物组所用材料为阿拉善双峰驼的头部皮肤，样品处理不分组，该实验步骤和所用材料、试剂见表4。动物细胞组因材料不同样品制备被分为两组，第一组的材料是小鼠神经瘤母细胞，为贴壁培养的细胞，其样品制备的方法与植物组中的化学试剂处理组相同；第二组的材料是白血病细胞系（HL-60），为悬浮培养的细胞，其样品制备的方法与微生物组中的常规组相同。
以上各种样品制备过程中用到的化学试剂均为分析纯，干燥所用的仪器为日立冷冻真空干燥仪（ES-2030），喷金所用的仪器为日立离子溅射仪（E-1010）。
（2）体会SEM各仪器参数的改变对图像质量的影响
影响扫描电镜图像质量的因素主要有三部分：第一部分是仪器的工作状态。获取图像时要使仪器处于正常的工作状态，所谓仪器的正常工作状态是指：镜筒足够清洁、电子系统的安装和调节无误、准确合轴对称，能进行高倍聚焦、电噪音足够小。第二部分是样品材料要无水无挥发性物质，具有一定的机械轻度，能耐受电子束的轰击，具有导电性，能产生足够的信号。
扫描电镜图像质量的高低除了仪器本身的状态和样品材料的状态问题外，更主要的是操作条件，也就是仪器参数的设置决定的。应根据不同的样品选择最佳的扫描参数，才能得到高质量的图像。这些仪器参数主要有：加速电压、扫描速度、工作距离、探针电流、物镜光阑孔径、信噪比和象散校正。
上机实训的主要目的就是体会SEM各仪器参数的改变对图像质量的影响，并学会如何设置各个参数。
2.2结果
（1）样品制备的探索结果
丰岛等人的研究表明，样品经戊二醛固定后乙醇梯度脱水，样品的收缩率与脱水时间有很大的关系，脱水时间越长，收缩越大，反之则越小。特别是样品直接进行70%-90%-100%的乙醇梯度脱水，每步的脱水时间控制在5min以内几乎没有收缩。娇弱样品的扫描电镜制样中，常规的固定方法是采用戊二醛和锇酸双固定，固定程序操作复杂且耗时，此外，锇酸昂贵且需要进口。徐柏森等人使用戊二醛一种固定剂，缩短固定时间至30min，在固定后直接进行70%-90%-100%的乙醇梯度脱水，每个浓度脫水1次，每次5min，获得了良好的扫描电镜图片。在上述研究结果的基础上，本次课程让微生物组把样品制备实验分为了四组，第三组、第四组都使用戊二醛一种固定剂，固定时间缩短至20min，在固定后直接进行70%-90%-100%的乙醇梯度脱水，每个浓度脱水1次，第三组每次5min，第四组每次2min。也均获得了良好的扫描电镜图片。
（2）体会改变SEM各仪器参数对电镜图像的影响
各组根据自己材料的不同，均能找到适合自己材料的各仪器参数，达到了上机实训的目的。
3.结语
综上所述，通过课前制定科学详细的课程规划，这种“突出应用，简化原理，立足平台仪器”的理论体系和具有专业及实际特色的上机实训体系，使扫描电镜课程深受学生的欢迎，收到了良好的效果，同时也最大程度地发挥了现有仪器的资源优势和师资特长。
在以后的课程中，我们将对生命科学各种材料的制样方法分阶段进行更高层次的探索，从而简化制样步骤和创建新的制样方法，为获取优质扫描电镜图像提供最基本的保证，为本院研究生的科研竞争力提供更优秀的技术平台。
参考文献：
[1]章晓中. 电子显微分析[M]. 北京：清华大学出版社，2006. [2]徐柏森，冯汀，刘刚. 扫描电镜生物样品的快速制备方法研究，中国野生植物资源，2000，19（6）：47-49.
[3]丰岛良太等。第五回医学生物学走查电显シソボジウム记录1976： 17.
【关键词】扫描电子显微镜 生命科学 研究生课程 创新方法
【基金项目】由“中央高校基本科研业务费专项资金”重点研究基地团队建设项目资助的，项目编号：lzujbky-2014-bt05。
【中图分类号】G64 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2016）06-0016-02
生命科学的理论和应用归根到底来自实验，并由实验检验。近30年来，生命科学的发展极其迅速，取得了一系列令人瞩目的成就。其中，大型精密仪器的作用功不可没。大型仪器为研究生命物质的作用和功能提供了定位、定性、定量，甚至实时的数据和图片，为生命科学的重大发现提供着强有力的实验证据，决定性地引导着相关研究领域的发展方向。扫描电子显微镜是一种用电子束扫描样品表面，通过电子束与样品的相互作用产生多种效应，从而获取样品表面放大的形貌像。这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的，其放大倍率从几倍到几十万倍连续可调，景深大，分辨率高，保真度好。在立体、清晰、多观察角度等方面均较普通光学显微镜有不可比拟的优越性。作为对超微结构进行研究的一种重要手段，在生命科学研究领域的应用受到高度重视。因此，为研究生设置扫描电镜课的重要意义不言而喻。
1.课程内容的设置
本门课程是以兰州大学研究型生命科学大型仪器共享平台为依托，授课所使用的Hitachi 3400N型扫描电镜隶属于该平台，授课团队的各成员均来自于该平台，且具有较丰富的生命科学的教育和科研背景，授课的对象也是生命科学各专业的研究生。基于此，并针对将经常到平台使用扫描电镜的各专业研究生的学习特点和科研任务，本课程内容的设置原则是：突出应用，简化原理、立足平台仪器。课程内容强调扫描电镜的功能及其各项性能指标在生物体系内的科学意义，简化仪器本身复杂的物理化学原理。这种将仪器功能和生物学特征直接联系的课程，拉近了扫描电镜和学生之间的距离。
1.1 课程目标
对授课对象而言，本课程的目标主要分三个方面：理论知识目标、能力目标和素质目标。理论知识目标是让学生了解Hitachi 3400N型扫描电镜的工作原理、仪器构造，掌握重要的仪器性能指标和相关的仪器术语；掌握基本的样品制备方法；掌握获取优质扫描电子像的方法。能力目标是让学生能够正确地使用和操作仪器，能够简单排除故障，学会知识迁移的能力，从而多角度、多参数、多指标的去验证实验中所得到的相同的理论结果。素质目标是培养学生的安全意识；培养学生精益求精、实事求是、一丝不苟的科研素质；培养学生的创新素质。对授课者及所属仪器共享平台而言，其目标是增强管理人员的业务素质，缓解平台技术力量不足，提高扫描电镜的利用效率等。
1.2 课程内容的设置
本课程的内容见图1。课程内容分课堂讲授理论知识和上机实训两个部分。本门课程总学时为18个学时，理论知识占6个学时，上机实训占12个学时。理论知识采取集中授课的方式进行，上机实训按专业特点和研究方向分为植物组、动物组、微生物组和细胞组，各组独立制样，上机实训；按实验目的、实验步骤、实验结果和讨论的内容完成并提交实验报告；最后分组讨论。
2.课程的完成情况及结果
2.1 课程完成情况
顺利完成了理论知识讲授部分。因授课人员和扫描电镜资源的缺乏，选课人数控制在15人以内，实际选课人数为15人。把15人按研究方向分为四组，分组情况及各组的实验目的见表1。按组进行上机实训，以下将对上机实训的情况做相关陈述。
（1） 样品制备方法的探索
探索样品的制备方法，该任务由微生物组和植物组来完成。微生物组所用材料为柠檬酸杆菌，样品制备实验共分四组，考察固定次数、固定时间和脱水剂浓度梯度、脱水时间对扫描图像的影响，各组的实验步骤和所用材料、试剂见表2。植物组所用材料为拟南芥叶片和紫萍叶片，样品制备共分三组，考察三种不同的样品处理方式对扫描图像的影响，各组的实验步骤和所用材料、试剂见表3。
动物组所用材料为阿拉善双峰驼的头部皮肤，样品处理不分组，该实验步骤和所用材料、试剂见表4。动物细胞组因材料不同样品制备被分为两组，第一组的材料是小鼠神经瘤母细胞，为贴壁培养的细胞，其样品制备的方法与植物组中的化学试剂处理组相同；第二组的材料是白血病细胞系（HL-60），为悬浮培养的细胞，其样品制备的方法与微生物组中的常规组相同。
以上各种样品制备过程中用到的化学试剂均为分析纯，干燥所用的仪器为日立冷冻真空干燥仪（ES-2030），喷金所用的仪器为日立离子溅射仪（E-1010）。
（2）体会SEM各仪器参数的改变对图像质量的影响
影响扫描电镜图像质量的因素主要有三部分：第一部分是仪器的工作状态。获取图像时要使仪器处于正常的工作状态，所谓仪器的正常工作状态是指：镜筒足够清洁、电子系统的安装和调节无误、准确合轴对称，能进行高倍聚焦、电噪音足够小。第二部分是样品材料要无水无挥发性物质，具有一定的机械轻度，能耐受电子束的轰击，具有导电性，能产生足够的信号。
扫描电镜图像质量的高低除了仪器本身的状态和样品材料的状态问题外，更主要的是操作条件，也就是仪器参数的设置决定的。应根据不同的样品选择最佳的扫描参数，才能得到高质量的图像。这些仪器参数主要有：加速电压、扫描速度、工作距离、探针电流、物镜光阑孔径、信噪比和象散校正。
上机实训的主要目的就是体会SEM各仪器参数的改变对图像质量的影响，并学会如何设置各个参数。
2.2结果
（1）样品制备的探索结果
丰岛等人的研究表明，样品经戊二醛固定后乙醇梯度脱水，样品的收缩率与脱水时间有很大的关系，脱水时间越长，收缩越大，反之则越小。特别是样品直接进行70%-90%-100%的乙醇梯度脱水，每步的脱水时间控制在5min以内几乎没有收缩。娇弱样品的扫描电镜制样中，常规的固定方法是采用戊二醛和锇酸双固定，固定程序操作复杂且耗时，此外，锇酸昂贵且需要进口。徐柏森等人使用戊二醛一种固定剂，缩短固定时间至30min，在固定后直接进行70%-90%-100%的乙醇梯度脱水，每个浓度脫水1次，每次5min，获得了良好的扫描电镜图片。在上述研究结果的基础上，本次课程让微生物组把样品制备实验分为了四组，第三组、第四组都使用戊二醛一种固定剂，固定时间缩短至20min，在固定后直接进行70%-90%-100%的乙醇梯度脱水，每个浓度脱水1次，第三组每次5min，第四组每次2min。也均获得了良好的扫描电镜图片。
（2）体会改变SEM各仪器参数对电镜图像的影响
各组根据自己材料的不同，均能找到适合自己材料的各仪器参数，达到了上机实训的目的。
3.结语
综上所述，通过课前制定科学详细的课程规划，这种“突出应用，简化原理，立足平台仪器”的理论体系和具有专业及实际特色的上机实训体系，使扫描电镜课程深受学生的欢迎，收到了良好的效果，同时也最大程度地发挥了现有仪器的资源优势和师资特长。
在以后的课程中，我们将对生命科学各种材料的制样方法分阶段进行更高层次的探索，从而简化制样步骤和创建新的制样方法，为获取优质扫描电镜图像提供最基本的保证，为本院研究生的科研竞争力提供更优秀的技术平台。
参考文献：
[1]章晓中. 电子显微分析[M]. 北京：清华大学出版社，2006. [2]徐柏森，冯汀，刘刚. 扫描电镜生物样品的快速制备方法研究，中国野生植物资源，2000，19（6）：47-49.
[3]丰岛良太等。第五回医学生物学走查电显シソボジウム记录1976： 17.