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摘要近些年来，固定化酶技术以其操作简单、无二次污染和对底物特异性高等优点在环境领域的应用受到越来越多的关注。在此综述了固定化酶在环境领域中的众多应用，如高浓度有机废水和低浓度含农药废水处理、污染土壤修复及环境监测等方面。
关键词固定化酶；环境领域；污水处理；环境监测；清洁生产
中图分类号S181.3文献标识码A文章编号0517-6611（2014）21-07171-04
Applications of the Immobilized Enzyme in Environmental Fields
LIU Xiuhong， CHANG Yanhong et al （Department of Environmental Science and Engineering， University of Science and Technology Beijing， Beijing 100083）
AbstractIn recent years， more and more attention is paid to the immobilized enzyme technology and its applications in environmental fields since it has advantages of simple operation， no secondary pollution， the high substrate specificity， etc. In this article， many applications of immobilized enzyme such as treatment of highconcentration organic wastewater and lowconcentration wastewater containing pesticides， soil remediation and environmental monitoring， were reviewed.
Key words Immobilized enzyme； Environmental fields； Sewage treatment； Environmental monitoring； Cleaner production
固定化酶技术是一种通过物理或化学手段，将游离酶定位于限定的空间区域内，并使其保持活性及可反复使用的技术手段，其在食品工业、医药和环境分析等领域中有广泛的应用。因固定化酶具有较好的稳定性、专一性高、反应条件温和、无污染、操作简便及绿色环保等特性[1]，在环境领域中有很好的应用前景。
随着环境污染日益严重，人们迫切需要开发出一种高效、快速、能连续处理污染物且无二次污染的技术。而利用固定化酶技术来治理环境则在这些方面显示出巨大的优越性，不仅因其是一种在其他领域已经被证明为高效的新技术，且相比很多在环境治理中使用的常规化学处理方法，固定化酶的使用可以防止产生新的污染。经过多年的发展，固定化酶技术在有毒有害的有机废水处理、环境监测和清洁生产等环境领域得到了广泛的关注和应用[2]。在此，笔者综述了固定化酶在环境领域中的众多应用。
1固定化酶技术的研究和发展
为了克服游离酶的不稳定、易失活、不易分离等缺点，固定化酶技术在20世纪60年代发展起来的，且得到了非常快速的发展。在1971年第一届国际酶工程会议上，正式提出固定化酶（immobilized enzyme）的名称。目前，固定化酶已经受到许多学者的关注，无论在理论方面还是在应用研究方面均取得了众多令人瞩目的成果。
2 酶固定化的方法
传统的制备固定化酶的方法主要有吸附法、交联法、共价结合法和包埋法4种。最早出现的酶固定化方法为吸附法，而共价结合法却是目前研究较多的一种固定化方法。随着人们对固定化酶的研究，开发出许多新型的固定化方法及性能优良的新型或改性的固定化载体，如新型介孔二氧化硅载体、纳米材料载体及复合修饰后的纳米材料载体等[3-5]。
3固定化酶技术在环境领域的应用
3.1在污水处理中的应用高浓度有机废水的处理方法分为物理化学法与生物法。由于物理化学法较生物法具有处理难度大、成本高且用到的药剂可能会对环境造成二次污染等缺陷，生物法在高浓度有机废水处理中的应用日益增加。而作为生物法中重要组成部分固定化酶技术以其显著的优势成为废水处理方法研究领域的热点。相较传统的污水处理方法，固定化酶技术具有以下优点：①可以有效去除用其他方法难以去除的有机物质及其毒性；②反应速度快，酶比一般的化学催化剂催化效率高，能显著地缩短处理时间且达到较好的去除效果；③污水处理的整个过程操作简单易控制等。此外，某些有机化合物称为微污染物，以很低的浓度存在于水中，以致于已经建立的很多方法均无法将其去除。这些微污染物中一些已知或被怀疑是内分泌干扰化学物质（EDCs），破坏生物的内分泌系统[6-7]。在过去的几十年里，微污染物的去除已经成为发展中国家的主要环境问题之一。由于酶具有较好的专一性和对底物特异性高，在处理废水中这些低浓度微污染物方面具有突出的优势，如废水中的低浓度难降解农药成分。
污水处理中常用到的酶有辣根过氧化物酶、漆酶以及酪氨酸酶等。固定化辣根过氧化物酶对含酚类和苯胺类化合物的废水具有良好的催化氧化作用，且辣根过氧化物酶具有价格便宜、易制备、比活性高及能适应较宽的污染物浓度、温度和pH等优点，因而在含酚废水处理过程中倍受青睐。鲍腾等将辣根过氧化物酶固定在由凹凸棒石粘土、可溶性淀粉及工业水玻璃为原材料制备的凹凸棒石粘土基颗粒上，并将该固定化酶应用于含苯酚的废水处理中，一定条件下循环使用6次后，苯酚的处理效果仍可达62.3%；其降解污水中的五氯酚（PCP），取得较好的催化效果[8]。王翠等利用聚乙烯亚胺诱导生成的纳米氧化硅来固定辣根过氧化物酶来降解处理含苯酚废水，去除率可达73.1%[9]。 固定化漆酶作为一种高效绿色的催化剂，即延长了漆酶的使用寿命，提高了酶的稳定性和耐受性，降低了处理成本，使其在造纸废水、含有毒的酚类废水及农药废水等方面较传统的物理化学方法有很大的优势，因而具有广阔的应用前景。漆酶可以在温和的条件下有选择性地催化降解木质素而不产生其他有毒物质，同时可用于漂白废水中的有机氯、COD、BOD及色度的去除，因而在降解造纸废水方面有巨大的应用前景。赵鑫锐等以尼龙网为载体和戊二醛作为交联剂，固定化真菌漆酶并应用于反应器中降解低浓度造纸废水，当废水COD 的浓度控制在3 000 mg/L 左右，降解26 h后COD 去除率可达35%[10]。Liu 等将漆酶固定在双峰碳基介孔磁性复合材料上，该固定化漆酶在1 h内可以去除78%的苯酚和84%的对氯苯酚[11]。Nair等将漆酶固定在介孔二氧化硅球上，研究发现该固定化酶对双酚A（BPA）、双氯芬酸（DF）和甾体类激素等微污染物有较好的降解效果[12]。尤其等以戊二醛为交联剂，将真菌漆酶固定在壳聚糖载体上，并用该固定化酶降解微量农药氯苯嘧啶醇，结果表明固定化漆酶在酸性条件下对氯苯嘧啶醇降解率可达30%，且载体也对农药中的氯苯嘧啶醇具有一定的吸附作用[13]。酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）广泛存在于哺乳运动、植物和微生物体内。酪氨酸酶可以催化单酚化合物经一系列转化为醌类化合物，最终自身聚合或与其他物质聚合形成不溶于水的大分子物质而沉淀。利用海藻酸钠/二氧化硅（ALG/SiO2）杂化凝胶固定化酪氨酸酶（ALG/SiO2-TYR）对苯酚的去除率达89.5%。反应后固定化酪氨酸酶可以很方便地从体系中取出，用水冲淋，直接进行下一批次反应，重复多次使用后酶的活性降低较小，进而降低处理成本，这就为固定化酪氨酸酶在处理含酚废水方面应用奠定坚实的基础[14-15]。
随着对固定化酶技术的深入研究，许多其他种类的固定化酶及固定化方法在废水处理中受到越来越多的关注。张庆庆等以聚丙烯负载二氧化钛膜为载体固定农药降解酶，并用其降解农药甲基对硫磷，研究发现甲基对硫磷在30 min内降解了70%以上[16]。以海藻酸钠为载体固定化黑曲霉J6 有机磷农药降解酶，能够有效地去除污水中的有机磷农药[17]。聚乙烯醇-海藻酸钠（PVASA）直接固定含一些胞外氧化酶（如锰过氧化氢酶及木质素过氧化氢酶）的白腐菌培养液，该共固定化酶能够有效地去除造纸废水的COD且可用于有色废水脱色，这种方法不仅不需要进行酶的分离提纯，且在多种不同特点的酶的协同作用下，减少反应时间和步骤，实现连续生产，提高处理效果[18]。
42卷21期刘秀红等环境领域中固定化酶的应用3.5在污染土壤修复中的应用固定化酶应用于污染土壤修复也受到广泛的关注。以可生物降解的高分子外消旋聚乳酸（PDLLA）为原料，采用乳液电纺技术将漆酶包埋固定在纳米纤维中，可去除土壤中的持久性有机污染物多环芳烃（PAHs）菲、荧蒽、苯并[a]蒽和苯并[a]芘[38]。以海藻酸钠和聚阴离子纤维素为载体，对阿特拉津降解酶进行固定化并用该固定化酶对阿特拉津污染土壤进行修复，研究结果表明具有较好的修复效果[39]。
3.6在合成生物柴油方面的应用生物柴油作为一种绿色环保、可再生并可替代化石柴油的新能源， 在石油能源替代战略和城市空气污染治理中具有十分重要的地位。酶法生产生物柴油较目前工业生产所采用的化学法具有很多优势，如条件温和、对原料要求低、产物易分离、无污染物排放等，因而日益受到人们的青睐[40-42]。Li等以大孔树脂和阴离子交换树脂固定化脂肪酶，并用其催化黄连木黄连籽油转化为脂肪酸甲酯（即生物柴油），生物柴油的最高产率可以达94%[43]。固定化脂肪酶Candida sp. 99125可以用于高酸值油和脂肪酸的催化转化为生物柴油[44-45]。Li等使用固定化扩展青霉脂肪酶将游离脂肪酸含量较高的废油脂催化转化为甲基酯，当反应进行7 h时，转化率可达92.8%[46]。自然界的众多微生物提供了多种多样的脂肪酶及其他可催化制备生物柴油的酶[47-48]，这就为开发高效、稳定和绿色环保的固定化酶合成生物柴油的工艺打下坚实的基础，进而推动生物柴油代替环境污染严重的化石燃料的进程。
3.7 其他应用李淑展等在城市污水厂的脱水污泥中加入高岭土和土壤固化酶，制得垃圾填埋场的防渗材料，抗渗试验结果表明，添加土壤固化酶能够显著改善抗渗透性能[49]。现有的剩余污泥处理技术处理周期长且成本高，因此开发高效、经济的污泥处理方法已成为亟待解决的问题。应用不同的溶菌酶溶解污泥，不仅可以提高消化效率且可以大大减少剩余污泥的量，因而固定化溶菌酶以其特有的性质在环境领域中极具应用潜力[50-51]。固定化酶技术还应用于污水生物处理工艺。于宏兵等开发了一套新型两相厌氧处理系统，其酸化相是采用大孔树脂固定化酶作生物载体的水解酸化反应器，产甲烷相则是接种了经长期驯化培养的高温厌氧污泥，该反应器对黄浆废水有良好的处理效果[52]。
4 固定化酶技术在环境领域应用的展望
近年来对固定化酶技术的研究非常活跃，发展较快，其应用前景不可估量。其主要优势为：①固定化酶因具有种类多样性和对底物的特异性，可应用于其他方法难以去除的有毒物质及微量的污染物的去除；②固定化酶反应快速、高效、灵敏且具有专一性，可广泛地应用于环境监测或传感器等方面；③固定化酶易于与底物分离，获得高纯度生成物，简化了提纯工艺，减少反应过程中有毒有害试剂的使用；④固定化酶技术使酶可回收重复使用，可有效地降低成本；⑤酶的催化反应过程更易控制且无二次污染；⑥固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌方式应用于反应器中，使反应过程能够高效连续地进行。
在众多学者的关注下，一些新的固定化方法不断地被开发采用。为了处理某些含复杂难降解污染物的废水，向生物反应器中投加一定量的特种微生物的生物强化技术成为有效手段。将生物强化技术有效地结合传统的生物修复方法和分析化学提供的新方法进行监测、评价，已经逐渐成为污染土壤、地下水等生物修复发展的一种趋势。将不同特点来源的酶共同固定化或将酶和细胞进行共同固定化，充分利用协同作用，发挥各自优势，提高其催化效率。能够缩短反应时间简化操作步骤，实现连续生产。随着固定化技术应用范围越来越广，有待开发研究的内容仍然很多，如固定化技术进行创新、开发合成性能优良的新型固定化载体、固定化载体对酶活性、传质阻力的影响研究以及固定化酶半衰期的延长和成本的降低等方面。 在人类面临资源短缺、环境污染日益严重的情况下，加大固定化酶技术的研究与开发力度，充分利用固定化酶技术的优点并结合其他技术，开发高效能、低消耗、低成本、简单、安全、自动、无污染及废物综合利用工艺具有深远的意义。 参考文献
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关键词固定化酶；环境领域；污水处理；环境监测；清洁生产
中图分类号S181.3文献标识码A文章编号0517-6611（2014）21-07171-04
Applications of the Immobilized Enzyme in Environmental Fields
LIU Xiuhong， CHANG Yanhong et al （Department of Environmental Science and Engineering， University of Science and Technology Beijing， Beijing 100083）
AbstractIn recent years， more and more attention is paid to the immobilized enzyme technology and its applications in environmental fields since it has advantages of simple operation， no secondary pollution， the high substrate specificity， etc. In this article， many applications of immobilized enzyme such as treatment of highconcentration organic wastewater and lowconcentration wastewater containing pesticides， soil remediation and environmental monitoring， were reviewed.
Key words Immobilized enzyme； Environmental fields； Sewage treatment； Environmental monitoring； Cleaner production
固定化酶技术是一种通过物理或化学手段，将游离酶定位于限定的空间区域内，并使其保持活性及可反复使用的技术手段，其在食品工业、医药和环境分析等领域中有广泛的应用。因固定化酶具有较好的稳定性、专一性高、反应条件温和、无污染、操作简便及绿色环保等特性[1]，在环境领域中有很好的应用前景。
随着环境污染日益严重，人们迫切需要开发出一种高效、快速、能连续处理污染物且无二次污染的技术。而利用固定化酶技术来治理环境则在这些方面显示出巨大的优越性，不仅因其是一种在其他领域已经被证明为高效的新技术，且相比很多在环境治理中使用的常规化学处理方法，固定化酶的使用可以防止产生新的污染。经过多年的发展，固定化酶技术在有毒有害的有机废水处理、环境监测和清洁生产等环境领域得到了广泛的关注和应用[2]。在此，笔者综述了固定化酶在环境领域中的众多应用。
1固定化酶技术的研究和发展
为了克服游离酶的不稳定、易失活、不易分离等缺点，固定化酶技术在20世纪60年代发展起来的，且得到了非常快速的发展。在1971年第一届国际酶工程会议上，正式提出固定化酶（immobilized enzyme）的名称。目前，固定化酶已经受到许多学者的关注，无论在理论方面还是在应用研究方面均取得了众多令人瞩目的成果。
2 酶固定化的方法
传统的制备固定化酶的方法主要有吸附法、交联法、共价结合法和包埋法4种。最早出现的酶固定化方法为吸附法，而共价结合法却是目前研究较多的一种固定化方法。随着人们对固定化酶的研究，开发出许多新型的固定化方法及性能优良的新型或改性的固定化载体，如新型介孔二氧化硅载体、纳米材料载体及复合修饰后的纳米材料载体等[3-5]。
3固定化酶技术在环境领域的应用
3.1在污水处理中的应用高浓度有机废水的处理方法分为物理化学法与生物法。由于物理化学法较生物法具有处理难度大、成本高且用到的药剂可能会对环境造成二次污染等缺陷，生物法在高浓度有机废水处理中的应用日益增加。而作为生物法中重要组成部分固定化酶技术以其显著的优势成为废水处理方法研究领域的热点。相较传统的污水处理方法，固定化酶技术具有以下优点：①可以有效去除用其他方法难以去除的有机物质及其毒性；②反应速度快，酶比一般的化学催化剂催化效率高，能显著地缩短处理时间且达到较好的去除效果；③污水处理的整个过程操作简单易控制等。此外，某些有机化合物称为微污染物，以很低的浓度存在于水中，以致于已经建立的很多方法均无法将其去除。这些微污染物中一些已知或被怀疑是内分泌干扰化学物质（EDCs），破坏生物的内分泌系统[6-7]。在过去的几十年里，微污染物的去除已经成为发展中国家的主要环境问题之一。由于酶具有较好的专一性和对底物特异性高，在处理废水中这些低浓度微污染物方面具有突出的优势，如废水中的低浓度难降解农药成分。
污水处理中常用到的酶有辣根过氧化物酶、漆酶以及酪氨酸酶等。固定化辣根过氧化物酶对含酚类和苯胺类化合物的废水具有良好的催化氧化作用，且辣根过氧化物酶具有价格便宜、易制备、比活性高及能适应较宽的污染物浓度、温度和pH等优点，因而在含酚废水处理过程中倍受青睐。鲍腾等将辣根过氧化物酶固定在由凹凸棒石粘土、可溶性淀粉及工业水玻璃为原材料制备的凹凸棒石粘土基颗粒上，并将该固定化酶应用于含苯酚的废水处理中，一定条件下循环使用6次后，苯酚的处理效果仍可达62.3%；其降解污水中的五氯酚（PCP），取得较好的催化效果[8]。王翠等利用聚乙烯亚胺诱导生成的纳米氧化硅来固定辣根过氧化物酶来降解处理含苯酚废水，去除率可达73.1%[9]。 固定化漆酶作为一种高效绿色的催化剂，即延长了漆酶的使用寿命，提高了酶的稳定性和耐受性，降低了处理成本，使其在造纸废水、含有毒的酚类废水及农药废水等方面较传统的物理化学方法有很大的优势，因而具有广阔的应用前景。漆酶可以在温和的条件下有选择性地催化降解木质素而不产生其他有毒物质，同时可用于漂白废水中的有机氯、COD、BOD及色度的去除，因而在降解造纸废水方面有巨大的应用前景。赵鑫锐等以尼龙网为载体和戊二醛作为交联剂，固定化真菌漆酶并应用于反应器中降解低浓度造纸废水，当废水COD 的浓度控制在3 000 mg/L 左右，降解26 h后COD 去除率可达35%[10]。Liu 等将漆酶固定在双峰碳基介孔磁性复合材料上，该固定化漆酶在1 h内可以去除78%的苯酚和84%的对氯苯酚[11]。Nair等将漆酶固定在介孔二氧化硅球上，研究发现该固定化酶对双酚A（BPA）、双氯芬酸（DF）和甾体类激素等微污染物有较好的降解效果[12]。尤其等以戊二醛为交联剂，将真菌漆酶固定在壳聚糖载体上，并用该固定化酶降解微量农药氯苯嘧啶醇，结果表明固定化漆酶在酸性条件下对氯苯嘧啶醇降解率可达30%，且载体也对农药中的氯苯嘧啶醇具有一定的吸附作用[13]。酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）广泛存在于哺乳运动、植物和微生物体内。酪氨酸酶可以催化单酚化合物经一系列转化为醌类化合物，最终自身聚合或与其他物质聚合形成不溶于水的大分子物质而沉淀。利用海藻酸钠/二氧化硅（ALG/SiO2）杂化凝胶固定化酪氨酸酶（ALG/SiO2-TYR）对苯酚的去除率达89.5%。反应后固定化酪氨酸酶可以很方便地从体系中取出，用水冲淋，直接进行下一批次反应，重复多次使用后酶的活性降低较小，进而降低处理成本，这就为固定化酪氨酸酶在处理含酚废水方面应用奠定坚实的基础[14-15]。
随着对固定化酶技术的深入研究，许多其他种类的固定化酶及固定化方法在废水处理中受到越来越多的关注。张庆庆等以聚丙烯负载二氧化钛膜为载体固定农药降解酶，并用其降解农药甲基对硫磷，研究发现甲基对硫磷在30 min内降解了70%以上[16]。以海藻酸钠为载体固定化黑曲霉J6 有机磷农药降解酶，能够有效地去除污水中的有机磷农药[17]。聚乙烯醇-海藻酸钠（PVASA）直接固定含一些胞外氧化酶（如锰过氧化氢酶及木质素过氧化氢酶）的白腐菌培养液，该共固定化酶能够有效地去除造纸废水的COD且可用于有色废水脱色，这种方法不仅不需要进行酶的分离提纯，且在多种不同特点的酶的协同作用下，减少反应时间和步骤，实现连续生产，提高处理效果[18]。
42卷21期刘秀红等环境领域中固定化酶的应用3.5在污染土壤修复中的应用固定化酶应用于污染土壤修复也受到广泛的关注。以可生物降解的高分子外消旋聚乳酸（PDLLA）为原料，采用乳液电纺技术将漆酶包埋固定在纳米纤维中，可去除土壤中的持久性有机污染物多环芳烃（PAHs）菲、荧蒽、苯并[a]蒽和苯并[a]芘[38]。以海藻酸钠和聚阴离子纤维素为载体，对阿特拉津降解酶进行固定化并用该固定化酶对阿特拉津污染土壤进行修复，研究结果表明具有较好的修复效果[39]。
3.6在合成生物柴油方面的应用生物柴油作为一种绿色环保、可再生并可替代化石柴油的新能源， 在石油能源替代战略和城市空气污染治理中具有十分重要的地位。酶法生产生物柴油较目前工业生产所采用的化学法具有很多优势，如条件温和、对原料要求低、产物易分离、无污染物排放等，因而日益受到人们的青睐[40-42]。Li等以大孔树脂和阴离子交换树脂固定化脂肪酶，并用其催化黄连木黄连籽油转化为脂肪酸甲酯（即生物柴油），生物柴油的最高产率可以达94%[43]。固定化脂肪酶Candida sp. 99125可以用于高酸值油和脂肪酸的催化转化为生物柴油[44-45]。Li等使用固定化扩展青霉脂肪酶将游离脂肪酸含量较高的废油脂催化转化为甲基酯，当反应进行7 h时，转化率可达92.8%[46]。自然界的众多微生物提供了多种多样的脂肪酶及其他可催化制备生物柴油的酶[47-48]，这就为开发高效、稳定和绿色环保的固定化酶合成生物柴油的工艺打下坚实的基础，进而推动生物柴油代替环境污染严重的化石燃料的进程。
3.7 其他应用李淑展等在城市污水厂的脱水污泥中加入高岭土和土壤固化酶，制得垃圾填埋场的防渗材料，抗渗试验结果表明，添加土壤固化酶能够显著改善抗渗透性能[49]。现有的剩余污泥处理技术处理周期长且成本高，因此开发高效、经济的污泥处理方法已成为亟待解决的问题。应用不同的溶菌酶溶解污泥，不仅可以提高消化效率且可以大大减少剩余污泥的量，因而固定化溶菌酶以其特有的性质在环境领域中极具应用潜力[50-51]。固定化酶技术还应用于污水生物处理工艺。于宏兵等开发了一套新型两相厌氧处理系统，其酸化相是采用大孔树脂固定化酶作生物载体的水解酸化反应器，产甲烷相则是接种了经长期驯化培养的高温厌氧污泥，该反应器对黄浆废水有良好的处理效果[52]。
4 固定化酶技术在环境领域应用的展望
近年来对固定化酶技术的研究非常活跃，发展较快，其应用前景不可估量。其主要优势为：①固定化酶因具有种类多样性和对底物的特异性，可应用于其他方法难以去除的有毒物质及微量的污染物的去除；②固定化酶反应快速、高效、灵敏且具有专一性，可广泛地应用于环境监测或传感器等方面；③固定化酶易于与底物分离，获得高纯度生成物，简化了提纯工艺，减少反应过程中有毒有害试剂的使用；④固定化酶技术使酶可回收重复使用，可有效地降低成本；⑤酶的催化反应过程更易控制且无二次污染；⑥固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌方式应用于反应器中，使反应过程能够高效连续地进行。
在众多学者的关注下，一些新的固定化方法不断地被开发采用。为了处理某些含复杂难降解污染物的废水，向生物反应器中投加一定量的特种微生物的生物强化技术成为有效手段。将生物强化技术有效地结合传统的生物修复方法和分析化学提供的新方法进行监测、评价，已经逐渐成为污染土壤、地下水等生物修复发展的一种趋势。将不同特点来源的酶共同固定化或将酶和细胞进行共同固定化，充分利用协同作用，发挥各自优势，提高其催化效率。能够缩短反应时间简化操作步骤，实现连续生产。随着固定化技术应用范围越来越广，有待开发研究的内容仍然很多，如固定化技术进行创新、开发合成性能优良的新型固定化载体、固定化载体对酶活性、传质阻力的影响研究以及固定化酶半衰期的延长和成本的降低等方面。 在人类面临资源短缺、环境污染日益严重的情况下，加大固定化酶技术的研究与开发力度，充分利用固定化酶技术的优点并结合其他技术，开发高效能、低消耗、低成本、简单、安全、自动、无污染及废物综合利用工艺具有深远的意义。 参考文献
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