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摘 要：建立腐竹中碱性橙Ⅱ、碱性嫩黄O的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定方法。试样用乙酸铵混合溶液提取，经固相萃取小柱净化，氮气吹干后用溶解待测。采用LC-MS/MS测定，色谱柱为C18反相色谱柱，流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，电喷雾正离子模式电离，多反应选择离子检测（MRM），基质曲线外标法定量。结果表明方法可用于腐竹中碱性橙Ⅱ、碱性嫩黄O的同时测定。
关键词：腐竹 液相色谱—串联质谱 碱性橙Ⅱ 碱性嫩黄O 多反应监测 中图分类号：TS214.2 文獻标识码：A
碱性橙Ⅱ、碱性嫩黄O是一种工业染料，主要用于家具、纸张、纺织品等的染色，这些染料都有致癌、致畸、致突变性，严重危害人体健康。根据GB 2760-2007《食品添加剂使用卫生标准》规定[1]，这二种物质严禁作为食品添加剂使用。由于在中性及偏碱性条件下，碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O与蛋白质吸附较牢固，不易褪色，因此有些不法商人就将其用于腐竹的染色，使腐竹的色泽光亮，欺骗消费者，使消费者的身体健康受到严重影响。
本文建立的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）快速准确地测定腐竹中的碱性橙Ⅱ、碱性嫩黄O的方法，可满足检测要求，为食品安全监督检验提供技术依据，对于加强食品监管、保障食品安全具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
Agilent 1200LC/-6410B MS液相色谱/串联四极杆质谱仪（安捷伦科技有限公司）；BS224S电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；HYQ-2110液体混匀器（苏州捷美电子有限公司）；KQ-250DE超声波发生器（昆山市超声仪器有限公司）；Microfuge离心机（美国BECKMAN公司）。
碱性橙Ⅱ标准品，纯度>98%（美国SIGMA公司）；碱性嫩黄O标准品，纯度>98%（美国SIGMA公司）；乙腈、甲酸为色谱纯（Burdick&Jackson公司）；无水乙醇（分析纯，天津市化学试剂有限公司）；样品购自本地超市。
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液的配制
分别精确称取碱性嫩黄O、碱性橙Ⅱ 0.005g于50mL容量瓶中，然后用甲醇溶解并稀释至刻度，于冰箱4℃以下避光保存。用流动相液将碱性嫩黄O、碱性橙Ⅱ储备液液稀释成10μg/mL的工作液。
1.2.2 样品处理和测定
取代表性的样品，经四分法缩减分取25g左右，粉碎并过60目筛，充分混匀后装入磨口瓶中备用。取混合均匀后的空白样品，作为空白试样。
称取混合均匀试样1.0g（精确至0.01g）于50mL离心管中，准确加入10mL50%甲醇、1%甲酸、50mmol/L乙酸铵水溶液，超声提取30min，10000r/min离心10min，上清液，过WAX固相萃取柱，收集洗脱液，氮气吹至近干，用流动相定容至1.0mL，过0.22μm滤膜后液相色谱—串联质谱测定。
1.2.3 基质加标工作曲线的制备
称取1.0g空白样品基质于50mL离心管中，称取6份，分别加入标准储备溶液，按样品制备方法进行操作，制备基质加标标准工作曲线。
1.2.4 仪器参数和测定条件
液相色谱条件：C18反相色谱柱（C18 2.1mm×10.0mm id，3.5μm）；柱温：30℃；流速：0.5mL/min；进样量：5μL；流动相：乙腈-0.2%甲酸水溶液（33+67）。
质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；喷雾压力：35psi；干燥气流速：8mL/min；离子化温度：340℃。
2 结果与分析
2.1 样品提取方法的选择
碱性橙Ⅱ、碱性嫩黄O为离子型化合物，提取溶液的酸、碱性会影响化合物解离状态及与基质的结合力，从而影响提取效率。根据相关文献报道[2-4]，对不同混合溶液的提取效率进行实验，结果表明甲醇水比例在50%～60%时提取效率最高。为了配合提取后的固相萃取净化步骤， 本文确定了样品提取液为含50%甲醇、1%甲酸50mmol/L乙酸铵水溶液。
2.2 色谱条件的优化
不同溶剂对碱性橙Ⅱ、碱性嫩黄O的离子化程度和色谱保留时间有一定的影响。本文选择了100mm高效液相色谱柱。选择100mm色谱柱，当流动相体系为0.1%甲酸水溶液—乙腈梯度洗脱时，碱性橙Ⅱ、碱性嫩黄O很好地分离。
2.3 质谱条件的优化
碱性橙和碱性嫩黄在溶液中以正离子形式存在。根据其结构，选择ESI（+）作为电离方式，将碱性橙和碱性嫩黄分别配制成1.0mg/L的甲醇溶液，通过全扫描方式找出其母离子，采用Product扫描的方式选择特征离子，逐步加大诱导碰撞能量，随着母离子的丰度逐渐减少，子离子的丰度逐渐增加，分别选用丰度最大的两个子离子作为定量和辅助定性离子（见表1），并确定其最佳碰撞能量值，在Product方式中进一步调整碰撞能量，以便获得最大灵敏度。
2.4 线性范围与检出限
基质加标工作曲线的制备。测定结果经线性回归，碱性橙Ⅱ回归方程Y=79.4x+42.7；线性相关系数：0.9963。碱性橙Ⅱ回归方程Y=21.0x-52.6；线性相关系数：0.9984。进空白样，以基线3倍噪声值在标准曲线查得结果计算，碱性橙Ⅱ检出限为10μg/kg；碱性嫩黄O检出限5μg/kg。
2.5 方法的回收率和精密度
根据GB/T 5009.1-2003，我们选取1种空白腐竹粉品，加入2个水平的待测物，按照样品处理方法及相同的色谱条件下，进行回收率的测定，每个样品重复3次，计算出每个添加水平的回收率。
3 结论
本文建立了腐竹中的碱性橙Ⅱ、碱性嫩黄O的高效液相色谱—串联四极杆质谱联用测定方法，该法具有样品处理简单、测定周期短等优点，适用于大量样品的快速筛选、测定。
参考文献
[1] 中国国家标准化管理委员会.GB 2760-2007.食品添加剂使用卫生标准[S].北京：中国标准出版社，2007.
[2] 赵榕，赵海燕，李兵，吴国华，薛颖.建立同时测定调味品中非法添加到4种工业染料的SPE-UPLC-MS/MS[J].中国食品卫生学报，2009（21）：410-414.
[3] 林赛君，屠海云，孙岚，肖海龙，潘向荣，马晓燕.高效液相色谱—串联质谱法同时测定食品中五种黄色化工染料[J].色谱，2011（29）：79-82.
[4] 谢维平，欧阳燕玲，黄盈煜，陈春祝.超高效液相色谱同时测定食品中4种工业染料[J].食品与发酵工业，2012（24）：329-332.
关键词：腐竹 液相色谱—串联质谱 碱性橙Ⅱ 碱性嫩黄O 多反应监测 中图分类号：TS214.2 文獻标识码：A
碱性橙Ⅱ、碱性嫩黄O是一种工业染料，主要用于家具、纸张、纺织品等的染色，这些染料都有致癌、致畸、致突变性，严重危害人体健康。根据GB 2760-2007《食品添加剂使用卫生标准》规定[1]，这二种物质严禁作为食品添加剂使用。由于在中性及偏碱性条件下，碱性橙Ⅱ和碱性嫩黄O与蛋白质吸附较牢固，不易褪色，因此有些不法商人就将其用于腐竹的染色，使腐竹的色泽光亮，欺骗消费者，使消费者的身体健康受到严重影响。
本文建立的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）快速准确地测定腐竹中的碱性橙Ⅱ、碱性嫩黄O的方法，可满足检测要求，为食品安全监督检验提供技术依据，对于加强食品监管、保障食品安全具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
Agilent 1200LC/-6410B MS液相色谱/串联四极杆质谱仪（安捷伦科技有限公司）；BS224S电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；HYQ-2110液体混匀器（苏州捷美电子有限公司）；KQ-250DE超声波发生器（昆山市超声仪器有限公司）；Microfuge离心机（美国BECKMAN公司）。
碱性橙Ⅱ标准品，纯度>98%（美国SIGMA公司）；碱性嫩黄O标准品，纯度>98%（美国SIGMA公司）；乙腈、甲酸为色谱纯（Burdick&Jackson公司）；无水乙醇（分析纯，天津市化学试剂有限公司）；样品购自本地超市。
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液的配制
分别精确称取碱性嫩黄O、碱性橙Ⅱ 0.005g于50mL容量瓶中，然后用甲醇溶解并稀释至刻度，于冰箱4℃以下避光保存。用流动相液将碱性嫩黄O、碱性橙Ⅱ储备液液稀释成10μg/mL的工作液。
1.2.2 样品处理和测定
取代表性的样品，经四分法缩减分取25g左右，粉碎并过60目筛，充分混匀后装入磨口瓶中备用。取混合均匀后的空白样品，作为空白试样。
称取混合均匀试样1.0g（精确至0.01g）于50mL离心管中，准确加入10mL50%甲醇、1%甲酸、50mmol/L乙酸铵水溶液，超声提取30min，10000r/min离心10min，上清液，过WAX固相萃取柱，收集洗脱液，氮气吹至近干，用流动相定容至1.0mL，过0.22μm滤膜后液相色谱—串联质谱测定。
1.2.3 基质加标工作曲线的制备
称取1.0g空白样品基质于50mL离心管中，称取6份，分别加入标准储备溶液，按样品制备方法进行操作，制备基质加标标准工作曲线。
1.2.4 仪器参数和测定条件
液相色谱条件：C18反相色谱柱（C18 2.1mm×10.0mm id，3.5μm）；柱温：30℃；流速：0.5mL/min；进样量：5μL；流动相：乙腈-0.2%甲酸水溶液（33+67）。
质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；喷雾压力：35psi；干燥气流速：8mL/min；离子化温度：340℃。
2 结果与分析
2.1 样品提取方法的选择
碱性橙Ⅱ、碱性嫩黄O为离子型化合物，提取溶液的酸、碱性会影响化合物解离状态及与基质的结合力，从而影响提取效率。根据相关文献报道[2-4]，对不同混合溶液的提取效率进行实验，结果表明甲醇水比例在50%～60%时提取效率最高。为了配合提取后的固相萃取净化步骤， 本文确定了样品提取液为含50%甲醇、1%甲酸50mmol/L乙酸铵水溶液。
2.2 色谱条件的优化
不同溶剂对碱性橙Ⅱ、碱性嫩黄O的离子化程度和色谱保留时间有一定的影响。本文选择了100mm高效液相色谱柱。选择100mm色谱柱，当流动相体系为0.1%甲酸水溶液—乙腈梯度洗脱时，碱性橙Ⅱ、碱性嫩黄O很好地分离。
2.3 质谱条件的优化
碱性橙和碱性嫩黄在溶液中以正离子形式存在。根据其结构，选择ESI（+）作为电离方式，将碱性橙和碱性嫩黄分别配制成1.0mg/L的甲醇溶液，通过全扫描方式找出其母离子，采用Product扫描的方式选择特征离子，逐步加大诱导碰撞能量，随着母离子的丰度逐渐减少，子离子的丰度逐渐增加，分别选用丰度最大的两个子离子作为定量和辅助定性离子（见表1），并确定其最佳碰撞能量值，在Product方式中进一步调整碰撞能量，以便获得最大灵敏度。
2.4 线性范围与检出限
基质加标工作曲线的制备。测定结果经线性回归，碱性橙Ⅱ回归方程Y=79.4x+42.7；线性相关系数：0.9963。碱性橙Ⅱ回归方程Y=21.0x-52.6；线性相关系数：0.9984。进空白样，以基线3倍噪声值在标准曲线查得结果计算，碱性橙Ⅱ检出限为10μg/kg；碱性嫩黄O检出限5μg/kg。
2.5 方法的回收率和精密度
根据GB/T 5009.1-2003，我们选取1种空白腐竹粉品，加入2个水平的待测物，按照样品处理方法及相同的色谱条件下，进行回收率的测定，每个样品重复3次，计算出每个添加水平的回收率。
3 结论
本文建立了腐竹中的碱性橙Ⅱ、碱性嫩黄O的高效液相色谱—串联四极杆质谱联用测定方法，该法具有样品处理简单、测定周期短等优点，适用于大量样品的快速筛选、测定。
参考文献
[1] 中国国家标准化管理委员会.GB 2760-2007.食品添加剂使用卫生标准[S].北京：中国标准出版社，2007.
[2] 赵榕，赵海燕，李兵，吴国华，薛颖.建立同时测定调味品中非法添加到4种工业染料的SPE-UPLC-MS/MS[J].中国食品卫生学报，2009（21）：410-414.
[3] 林赛君，屠海云，孙岚，肖海龙，潘向荣，马晓燕.高效液相色谱—串联质谱法同时测定食品中五种黄色化工染料[J].色谱，2011（29）：79-82.
[4] 谢维平，欧阳燕玲，黄盈煜，陈春祝.超高效液相色谱同时测定食品中4种工业染料[J].食品与发酵工业，2012（24）：329-332.