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【摘要】目的：探索肝癌患者凝血差异表达基因和其对肝癌患者预后的影响。方法：从癌症和肿瘤基因图谱（TCGA）中下载肝癌相关基因表达谱并用R语言筛选凝血差异表达基因，并进行单因素Kaplan-Meier生存分析，通过多因素Cox回归进行均一化校正;最后进行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis， GSEA）潜在信号通路。结果：筛选出28个凝血相关差异表达基因。其中ITGA2和GP6的表达影响了患者的总生存期和无进展生存期。GSEA结果显示，高风险组患者能显著富集到上皮间质转化（Epithelial to Mesenchymal Transition， EMT）相关的信号通路。结论：凝血相关基因ITGA2和GP6的表达对肝癌患者的预后有影响，可能与EMT相关通路的激活有关。
【关键词】凝血相关基因;预后;上皮间质转化
【中图分类号】R735.7 【文献标识码】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2020.12.237
Bioinformatics and Prognostic Analysis of Differentially Expressed Genes Related to Coagulation in Liver Cancer
[Abstract]Objective： To explore the differentially expressed genes of coagulation in patients with liver cancer and their influence on the prognosis of patients with liver cancer. Method： Download liver cancer-related genes from the Cancer and Tumor Gene Atlas （TCGA） Expression profile and use R language to screen differentially expressed genes in blood coagulation， and perform single-factor Kaplan-Meier survival analysis， and perform homogenization correction through multi-factor Cox regression; finally， perform Gene Set Enrichment Analysis （GSEA） potential signal pathways. Results： 28 differentially expressed genes related to coagulation were screened out. The expression of ITGA2 and GP6 affects the overall survival and progression-free survival of patients. GSEA results show that patients in the high-risk group can be significantly enriched in signaling pathways related to Epithelial to Mesenchymal Transition （EMT）. Conclusion： The expression of coagulation-related genes ITGA2 and GP6 has an impact on the prognosis of patients with liver cancer， which may be related to the activation of EMT-related pathways.
[Keywords] coagulation-related genes; prognosis; epithelial-mesenchymal transition
肝癌每年大約有80万的死亡患者，死亡率在世界范围内位居第二[1， 2]。随着医学的进步，虽然肝癌的病理特征被很好的阐述，但是应用于肝癌的临床治疗方式仍较为有限[2， 3]，患者的生存率较低。许多研究报道了凝血相关基因对于肿瘤发生进展的作用，提示其辅助诊断和预后的潜力。本研究凝血相关基因对肝癌发病和预后的影响，以更好的辅助临床对肝癌患者进行早期诊断和预后判断。
1 材料与方法
1.1资料来源
94个凝血相关的基因来源于已发表的一项研究[4]。肝癌患者的基因表达谱，临床信息和随访数据下载于癌症和肿瘤基因图谱（The Cancer Genome Atlas， TCGA）。
1.2研究方法
R软件DESeq2[5]用于肝癌和癌旁组织基因表达的差异分析;Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank检验进行比较，校正年龄、性别等多因素Cox回归通过forestmodel包完成，fgsea包进行通路分析。
1.3 统计学分析
应用R 3.6.1软件进行相关统计学分析。P < 0.05被认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 筛选差异基因
通过对94个凝血相关基因在50对肝癌跟癌旁组织的差异表达分析显示，28个凝血基因的表达存在显著差异。相对于癌旁组织，9个基因在肝癌组织的表达显著上调，19个基因表达显著下调（|FC| > 2， FDR < 0.05）（图1）。 2.2 生存分析
28个凝血基因预后分析显示：8个基因对肝癌患者的总生存期有影响（P < 0.05），多因素Cox回归校正混杂因素后，5个基因（ITGA2， GATA4， GP6， PROZ， MMRN1）对总生存期仍具有统计学差异（P < 0.05）（图2A）;6个基因对肝癌患者的无进展生存期有影响（P < 0.05），多因素Cox回归校正混杂因素后，4个基因（ITGA2， GP6， FGL2， VKORC1）对无进展生存期仍具有统计学差异（P < 0.05）（图2B）。综上，ITGA2和GP6对肝癌患者的总生存和无进展生存期均有影响，其中ITGA2具有促进肝癌进展的作用，GP6具有抑制肿瘤进展的作用。
2.3富集分析
基于ITGA2和GP6的生存分析，将患者分为高低风险组，GSEA通路分析显示，高风险组能够显著富集到上皮间质转化（Epithetial to Mesenchymal Transition， EMT）相关的信号通路（图3A）。进一步分析显示，EMT促进因子（CDH2， VIM， SNAIL1， TWIST2等）在高风险组表达显著上调（P < 0.05）（图3B），EMT抑制因子（CDH1， CEACAM1等）在高风险组表达显著下调（P < 0.05）（图3C）。
（A）高风险组的GSEA分析结果;（B）EMT激活相关基因的差异表达;（C）EMT抑制相关基因的差异表达
3 讨论
大量研究表明，凝血相关因子在肿瘤的发生发展中起到了重要作用，因此在本研究中我们全面的分析了凝血因子对于肝癌患者生存结局的影响
ITGA2与肿瘤的增殖和转移有重要的相关性。Chuang等人的研究指出，TCGA胃癌队列中，ITGA2在胃癌组织的mRNA表达水平要显著高于癌旁正常组织。此外，ITGA2的表达下调也降低了细胞的迁移能力[6]。研究报道，相对正常组织，ITGA2在恶性胶质瘤组织中也具有更高的表达水平，降表达ITGA2之后，细胞的迁移能力显著下调，并且ITGA2表达量的降低导致了阿霉素耐药的降低和化疗效果的提高[7]。本研究分析表明ITGA2在肝癌中促进了患者的总生存期和无进展生存期，发现GP6的高表达与肝癌患者较好的生存期显著相关。
GSEA的分析结果表明，高风险组患者能显著富集到EMT激活相关的信号通路上，提示患者预后较差可能与EMT的激活相关。通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡等间质表型[8]。EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程，对于肿瘤的进展影响重大[9-11]。
本研究通过分析凝血相关因子对于肝癌患者生存结局的影响，鉴定了预后相关的两个基因ITGA2和GP6，并通过通路分析，患者预后较差可能与EMT通路激活相关。本文通过肝癌患者凝血相关基因研究，可能对临床治疗提供一定的理论和依据。
参考文献：
[1]Murray CJ， Vos T， Lozano R et al. Disability-adjusted life years （DALYs） for 291 diseases and injuries in 21 regions， 1990-2010： a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet 2012; 380： 2197-2223.
[2]Llovet JM， Zucman-Rossi J， Pikarsky E et al. Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primers 2016; 2： 16018.
[3]Zucman-Rossi J， Villanueva A， Nault JC， Llovet JM. Genetic Landscape and Biomarkers of Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology 2015; 149： 1226-1239 e1224.
[4]Giuliani S， Tan YW， Zheng D et al. Coagulation Gene Expression Profiling in Infants With Necrotizing Enterocolitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2016; 63： e169-e175.
[5]Love MI， Huber W， Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol 2014; 15： 550.
[6]Chuang YC， Wu HY， Lin YL et al. Blockade of ITGA2 Induces Apoptosis and Inhibits Cell Migration in Gastric Cancer. Biol Proced Online 2018; 20： 10.
[7]Guo P， Moses-Gardner A， Huang J et al. ITGA2 as a potential nanotherapeutic target for glioblastoma. Sci Rep 2019; 9： 6195.
[8]Du B， Shim JS. Targeting Epithelial-Mesenchymal Transition （EMT） to Overcome Drug Resistance in Cancer. Molecules 2016; 21.
[9]Weng J， Li S， Lin H et al. PCDHGA9 represses epithelial-mesenchymal transition and metastatic potential in gastric cancer cells by reducing beta-catenin transcriptional activity. Cell Death Dis 2020; 11： 206.
[10]Saitoh M. Involvement of partial EMT in cancer progression. J Biochem 2018; 164： 257-264.
[11]Goossens S， Vandamme N， Van Vlierberghe P， Berx G. EMT transcription factors in cancer development re-evaluated： Beyond EMT and MET. Biochim Biophys Acta Rev Cancer 2017; 1868： 584-591.
基金項目：
教育部归国留学基金（编号：[2015]No.311）河北省慢性病重点实验室。
*通讯作者：
郭志义，华北理工大学·基础医学院、华北理工大学·公共卫生学院。
【关键词】凝血相关基因;预后;上皮间质转化
【中图分类号】R735.7 【文献标识码】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2020.12.237
Bioinformatics and Prognostic Analysis of Differentially Expressed Genes Related to Coagulation in Liver Cancer
[Abstract]Objective： To explore the differentially expressed genes of coagulation in patients with liver cancer and their influence on the prognosis of patients with liver cancer. Method： Download liver cancer-related genes from the Cancer and Tumor Gene Atlas （TCGA） Expression profile and use R language to screen differentially expressed genes in blood coagulation， and perform single-factor Kaplan-Meier survival analysis， and perform homogenization correction through multi-factor Cox regression; finally， perform Gene Set Enrichment Analysis （GSEA） potential signal pathways. Results： 28 differentially expressed genes related to coagulation were screened out. The expression of ITGA2 and GP6 affects the overall survival and progression-free survival of patients. GSEA results show that patients in the high-risk group can be significantly enriched in signaling pathways related to Epithelial to Mesenchymal Transition （EMT）. Conclusion： The expression of coagulation-related genes ITGA2 and GP6 has an impact on the prognosis of patients with liver cancer， which may be related to the activation of EMT-related pathways.
[Keywords] coagulation-related genes; prognosis; epithelial-mesenchymal transition
肝癌每年大約有80万的死亡患者，死亡率在世界范围内位居第二[1， 2]。随着医学的进步，虽然肝癌的病理特征被很好的阐述，但是应用于肝癌的临床治疗方式仍较为有限[2， 3]，患者的生存率较低。许多研究报道了凝血相关基因对于肿瘤发生进展的作用，提示其辅助诊断和预后的潜力。本研究凝血相关基因对肝癌发病和预后的影响，以更好的辅助临床对肝癌患者进行早期诊断和预后判断。
1 材料与方法
1.1资料来源
94个凝血相关的基因来源于已发表的一项研究[4]。肝癌患者的基因表达谱，临床信息和随访数据下载于癌症和肿瘤基因图谱（The Cancer Genome Atlas， TCGA）。
1.2研究方法
R软件DESeq2[5]用于肝癌和癌旁组织基因表达的差异分析;Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank检验进行比较，校正年龄、性别等多因素Cox回归通过forestmodel包完成，fgsea包进行通路分析。
1.3 统计学分析
应用R 3.6.1软件进行相关统计学分析。P < 0.05被认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 筛选差异基因
通过对94个凝血相关基因在50对肝癌跟癌旁组织的差异表达分析显示，28个凝血基因的表达存在显著差异。相对于癌旁组织，9个基因在肝癌组织的表达显著上调，19个基因表达显著下调（|FC| > 2， FDR < 0.05）（图1）。 2.2 生存分析
28个凝血基因预后分析显示：8个基因对肝癌患者的总生存期有影响（P < 0.05），多因素Cox回归校正混杂因素后，5个基因（ITGA2， GATA4， GP6， PROZ， MMRN1）对总生存期仍具有统计学差异（P < 0.05）（图2A）;6个基因对肝癌患者的无进展生存期有影响（P < 0.05），多因素Cox回归校正混杂因素后，4个基因（ITGA2， GP6， FGL2， VKORC1）对无进展生存期仍具有统计学差异（P < 0.05）（图2B）。综上，ITGA2和GP6对肝癌患者的总生存和无进展生存期均有影响，其中ITGA2具有促进肝癌进展的作用，GP6具有抑制肿瘤进展的作用。
2.3富集分析
基于ITGA2和GP6的生存分析，将患者分为高低风险组，GSEA通路分析显示，高风险组能够显著富集到上皮间质转化（Epithetial to Mesenchymal Transition， EMT）相关的信号通路（图3A）。进一步分析显示，EMT促进因子（CDH2， VIM， SNAIL1， TWIST2等）在高风险组表达显著上调（P < 0.05）（图3B），EMT抑制因子（CDH1， CEACAM1等）在高风险组表达显著下调（P < 0.05）（图3C）。
（A）高风险组的GSEA分析结果;（B）EMT激活相关基因的差异表达;（C）EMT抑制相关基因的差异表达
3 讨论
大量研究表明，凝血相关因子在肿瘤的发生发展中起到了重要作用，因此在本研究中我们全面的分析了凝血因子对于肝癌患者生存结局的影响
ITGA2与肿瘤的增殖和转移有重要的相关性。Chuang等人的研究指出，TCGA胃癌队列中，ITGA2在胃癌组织的mRNA表达水平要显著高于癌旁正常组织。此外，ITGA2的表达下调也降低了细胞的迁移能力[6]。研究报道，相对正常组织，ITGA2在恶性胶质瘤组织中也具有更高的表达水平，降表达ITGA2之后，细胞的迁移能力显著下调，并且ITGA2表达量的降低导致了阿霉素耐药的降低和化疗效果的提高[7]。本研究分析表明ITGA2在肝癌中促进了患者的总生存期和无进展生存期，发现GP6的高表达与肝癌患者较好的生存期显著相关。
GSEA的分析结果表明，高风险组患者能显著富集到EMT激活相关的信号通路上，提示患者预后较差可能与EMT的激活相关。通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡等间质表型[8]。EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程，对于肿瘤的进展影响重大[9-11]。
本研究通过分析凝血相关因子对于肝癌患者生存结局的影响，鉴定了预后相关的两个基因ITGA2和GP6，并通过通路分析，患者预后较差可能与EMT通路激活相关。本文通过肝癌患者凝血相关基因研究，可能对临床治疗提供一定的理论和依据。
参考文献：
[1]Murray CJ， Vos T， Lozano R et al. Disability-adjusted life years （DALYs） for 291 diseases and injuries in 21 regions， 1990-2010： a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet 2012; 380： 2197-2223.
[2]Llovet JM， Zucman-Rossi J， Pikarsky E et al. Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primers 2016; 2： 16018.
[3]Zucman-Rossi J， Villanueva A， Nault JC， Llovet JM. Genetic Landscape and Biomarkers of Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology 2015; 149： 1226-1239 e1224.
[4]Giuliani S， Tan YW， Zheng D et al. Coagulation Gene Expression Profiling in Infants With Necrotizing Enterocolitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2016; 63： e169-e175.
[5]Love MI， Huber W， Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol 2014; 15： 550.
[6]Chuang YC， Wu HY， Lin YL et al. Blockade of ITGA2 Induces Apoptosis and Inhibits Cell Migration in Gastric Cancer. Biol Proced Online 2018; 20： 10.
[7]Guo P， Moses-Gardner A， Huang J et al. ITGA2 as a potential nanotherapeutic target for glioblastoma. Sci Rep 2019; 9： 6195.
[8]Du B， Shim JS. Targeting Epithelial-Mesenchymal Transition （EMT） to Overcome Drug Resistance in Cancer. Molecules 2016; 21.
[9]Weng J， Li S， Lin H et al. PCDHGA9 represses epithelial-mesenchymal transition and metastatic potential in gastric cancer cells by reducing beta-catenin transcriptional activity. Cell Death Dis 2020; 11： 206.
[10]Saitoh M. Involvement of partial EMT in cancer progression. J Biochem 2018; 164： 257-264.
[11]Goossens S， Vandamme N， Van Vlierberghe P， Berx G. EMT transcription factors in cancer development re-evaluated： Beyond EMT and MET. Biochim Biophys Acta Rev Cancer 2017; 1868： 584-591.
基金項目：
教育部归国留学基金（编号：[2015]No.311）河北省慢性病重点实验室。
*通讯作者：
郭志义，华北理工大学·基础医学院、华北理工大学·公共卫生学院。