论文部分内容阅读
摘要：[目的]明确香蕉棒孢霉叶斑病病原菌多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（Berk&Curt）Wei]的生物学特性，为香蕉棒孢霉叶斑病的综合防治提供科学依据。[方法]以采集自云南省香蕉种植区的香蕉棒孢霉叶斑病病叶片为材料，采用常规组织分离法进行病原菌单孢分离，并对病原菌进行形态特征观察及致病性测定；应用平板培养法进行病原菌生物学特性测定。[结果]香蕉棒孢霉叶斑病病原菌菌丝生长的最适培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）；最适碳源为乳糖和甘露醇，最适氮源为蛋白胨；适宜温度为25-35℃，最适温度为28℃；病原菌仅能在pH 6-8内生长，最适pH为7；光照处理对菌丝生长有一定影响，以全黑暗条件下病原菌菌丝生长最快。在玉米粉培养基（CMA）上病原菌产孢量最高，光照与黑暗交替有利于产孢。病原菌菌丝致死温度和时间为58℃处理15 min，分生孢子的致死温度和时间为51℃处理5 min。[结论]香蕉棒孢霉叶斑病病原菌菌丝生长温度范围较宽，偏好高温，但适应的pH较窄；病原菌产孢的关键因子是培养基营养成分和光照条件。
关键词：香蕉叶斑病；多主棒孢菌；生物学特性；云南省
中图分類号：S432.4 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）03-0481-07
0引言
[研究意义]香蕉棒孢霉叶斑病是云南香蕉产区的主要叶斑病害之一，该病病原菌为多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（Berk&Curt）Wei]（桑利伟，2007），以温度高、湿度大的7-9月发生较严重，受害严重的蕉园病叶发生率在75%以上，且病害有逐年加重的趋势，严重影响了香蕉的产量和品质。香蕉棒孢霉叶斑病病害症状主要表现为：发病初期，在叶片上形成黄褐色的水浸状斑点，病斑稍凹陷，后期中央为灰白色的褐色病斑，呈半透明，产生黄色晕圈，叶面上有灰褐色霉层，病斑形状为椭圆形至圆形，或呈不规则状，最后整张叶片干枯、死亡。目前，对香蕉棒孢霉叶斑病的研究主要集中在病害发生及病原鉴定等方面，尚缺乏针对其病原菌生物学特性的系统研究。因此，明确香蕉棒孢霉叶斑病病原菌的生物学特性，对有针对性地开展病害防治具有重要意义。[前人研究进展]多主棒孢菌最早由魏景超（1982）报道定名。张贺等（2007）报道，多主棒孢菌是一个复杂的病原菌群体，来源于不同区域或同一区域不同寄主间的多主棒孢菌生物学特性存在差异。该病原菌侵染范围较广，侵染力强，能侵染70多种作物（关国经等，2000；李明远等，2001；邹庆道等，2002；张贺等，2007；张丽丽等，2008；罗霓等，2009；陈旭玉等，2012），引起叶斑、茎秆、果实腐烂等病害症状。Blazaquez于1969年报道该病原菌在香蕉上发生危害；桑利伟（2007）对海南岛的香蕉真菌病害进行调查与鉴定时发现，在海南岛有香蕉棒孢霉叶斑病发生；林善海等（2011）报道在广西香蕉主产区有香蕉棒孢霉叶斑病发生，并对香蕉棒孢霉叶斑病菌进行了分离鉴定。[本研究切入点]目前，关于香蕉棒孢霉叶斑病病原菌的生物学特性研究尚无文献报道。[拟解决的关键问题]在对云南省香蕉棒孢霉叶斑病病原菌进行单孢分离、形态特征观察及致病性测定的基础上，研究在不同培养基、碳源、氮源、温度、pH和光照条件下病原菌的生物学特性，旨在为香蕉棒孢霉叶斑病的综合防治提供科学依据。
1材料与方法
1.1标样采集及病原菌菌株分离
从云南省香蕉种植区西双版纳州打洛县采集发病巴西蕉叶片，取病斑病健交界处组织作为分离材料，采用常规组织分离法分离病原菌（方中达，2001），置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，28℃生化培养箱恒温培养2 d，纯化菌丝2次，待菌丝产孢后用单孢分离法挑取单孢至PDA斜面培养基上于4℃冰箱保存，供鉴定和生物学特性测定。
1.2病原菌形态特征观察
单孢菌株转接至PDA培养基上于28℃生化培养箱恒温培养7 d后，观察病原菌菌落形状、颜色、菌丝疏密程度等。培养15 d后，光学显微镜下观察病原菌形态特征，并测量计算分生孢子大小。
1.3病原菌致病性测定
采用针刺接种法，将病原菌菌丝块接种于温室内种植的健康巴西蕉叶片（接种7-8张叶片）上，以纯PDA培养基接种为对照，重复4次。接种叶片先用70%酒精进行表面消毒，然后用灭菌大头针将接种部位刺伤，再把PDA培养基上培养15 d的病原菌菌饼（直径为5 mm）接种于刺伤部位，用灭菌湿棉球保湿接种部位48 h，定期观察病害发生情况，发病后，取病健交界处叶片组织分离病原菌，对分离获得的病原菌进行形态特征观察。
1.4病原菌生物学特性测定
1.4.1不同营养成分培养基对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 参照刘秀娟等（1996）、方中达（2001）的方法配制黑麦琼脂培养基（MAS）、燕麦琼脂培养基（OA）、PDA培养基、玉米琼脂培养基（CMA）、胡萝卜琼脂培养基（cA）和马铃薯蔗糖培养基（PSA）等6种供试培养基。接种方法：病原菌在PDA培养基上培养7 d后，用直径为5mm的灭菌打孔器打取菌龄大小一致的菌丝块，菌丝块面向下接种于备用的6种培养基中间，每处理重复4次。置28℃恒温培养箱培养7和1 5 d后，分别用十字交叉法测量计算菌落大小，显微镜检测10×10倍下的孢子数，每处理检测10个显微镜视野，每处理重复4次。
1.4.2不同温度对病原菌菌丝生长的影响 参照肖仲久和李小霞（2013）的方法，测定病原菌菌丝在5、10、15、20、25、28、30、35和40℃等9个温度下的生长情况，每处理重复4次，方法同1.4.1。
1.4.3不同pH对病原菌菌丝生长的影响 采用PDA培养基，测定病原菌菌丝在培养基pH 5、6、7、8、9和10等6个梯度（PDA培养基灭菌后冷却至60℃左右时，用1 mol/L 0.1%NaOH和HCl溶液调配灭菌培养基pH）下的生长情况（唐爽爽等，2014），每处理重复4次，方法同1.4.1。 1.4.4不同碳源对病原菌菌丝生长的影响 以剔除碳源后的查氏（Czapek）培养基为基础培养基，分别配制成含蔗糖、D一麦芽糖、葡萄糖、甘露醇和乳糖等5种碳源的固体培养基，对照为不加碳源查氏培养基。测定不同碳源对菌丝生长的影响，每处理重复4次，方法同1.4.1。
1.4.5不同氮源对病原菌菌丝生长的影响 以剔除氮源后的查氏（czapek）培养基为基础培养基，分别配制成含蛋白胨、酵母浸粉、硝酸钠、磷酸氢二铵和脲等5种氮源的固体培养基，对照为不加氮源查氏培养基。测定不同氮源对病原菌菌丝生长的影响，每处理重复4次，方法同1.4.1。
1.4.6不同光照条件对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 设24 h黑暗、24 h光照和12 h黑暗+12 h光照交替等3种光照条件处理，测定不同光照条件对病原菌菌丝生长的影响，每处理重复4次，方法同1.4.1。
1.4.7病原菌菌丝致死温度和时间测定 综合参照张贺等（2007）、孙志峰等（2008）、杨永利等（2015）的方法，病原菌在PDA培养基上培养7 d后，无菌环境下分别用100 mL无菌水将每个培养基中的菌丝制成菌悬液，各取10 mL菌悬液装入灭菌试管并塞上试管塞，在40、45、50、55、60、65和70℃的恒温水浴锅中分别水浴处理5、10和15 min，水浴过程中缓慢摇动试管。处理结束后降至室温，用移液枪取0.2 mL不同处理的菌悬液涂布于PDA培养基上，于28℃生化培养箱中恒温培养72 h后，观察培养基上有无菌落生长，以未经过温度处理的菌悬液为对照，每处理重复4次。
1.4.8病原菌分生孢子致死温度和时间测定 病原菌在PDA培养基上培养15 d后，于10×10倍显微镜下配制浓度为每个视野10～15个孢子的悬浮液，取10 mL分生孢子悬浮液装入灭菌试管并塞上试管塞，在40、45、50、55、60、65和70℃的恒温水浴锅中分别处理5、10和15 min，水浴过程中缓慢摇动试管，浴后立即取出降至室温（张贺等，2007；孙志峰等，2008；杨永利等，2015），用移液枪取0.2 mL不同处理的菌悬液涂布于PDA培养基上，于28℃生化培养箱中恒温培养72 h后，观察培养基上有无菌落生长，以未经过温度处理的孢子悬浮液为对照，每处理重复4次。
1.5统计分析
采用Excel 2003进行数据分析和多重比较。
2结果与分析
2.1病原菌形态特征描述
在PDA培养基上，病原菌菌落疏展，灰色至灰褐色，呈毛发状或细绒毛状，气生菌丝茂盛，菌落中央颜色较边缘深并隆起（图1-A），菌落背面中央呈黑褐色（图1-B）。分生孢子梗单生或数根丛生，直立或弯曲，不分枝，褐色，光滑，具1-7个隔膜。菌丝有分隔，浅褐色，有隔膜。分生孢子顶生、单生，浅褐色，棍棒状至圆筒形，直或稍弯，顶端渐尖细，基部平切具孢脐，大小（30-220）gmx（10-20）um（图1-C）。结合其菌落特征及戚佩坤（2000）、林善海等（2011）关于该菌的特征描述，鉴定该菌为多主棒孢菌[C. cas-siicola（Berk&Curt）Wei]。
2.2病原菌致病性测定结果
接种病原菌3 d后开始巴西蕉叶片表现发病症状，接种部位呈黄褐色水浸状斑点，后期逐渐扩展成圆形至椭圆形褐色病斑，周围有黄色晕圈，中央灰白色、半透明，后期病部可见灰黑色霉层（图2-A）。接种病原菌后的表现症状与大田自然发生症状（图2-B）相似，并从接种发病病斑组织病健交界处能再次分离到与供试病原菌菌落形态、分生孢子形态一致的菌株，对照叶片无发病症状。
2.3病原菌生物学特性测定结果
2.3.1不同营养成分培养基对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 由图3可知，病原菌在供试6种培养基上均能较好地生长，其中最适培养基为PDA培养基，其次是MAS培养基，二者的菌落直径显著大于其他培养基上的菌落直径（P<0.05，下同），随后是OA和PSA培养基，但在OA培养基上病原菌菌丝稀疏、颜色浅，在CMA和CA培养基上病原菌生长速度稍慢。培养基对病原菌产孢量影响亦较大，其中产孢最适培养基为CMA培养基，其产孢量显著多于其他培养基的产孢量，其次为CA培养基，在OA、MAS、PSA和PDA培养基上产孢均较少。
2.3.2不同温度对病原菌菌丝生长的影响 试验结果（图4）表明，温度对病原菌菌丝生长有显著影响，10～40℃下病原菌均能长出菌丝，但生长差异明显，25～35℃时病原菌菌丝生长良好，其中在28℃下菌落直径最大，显著大于其他温度（30℃除外）条件下的菌落直径，28℃为菌丝的最适生长温度。
2.3.3不同pH对病原菌菌丝生长的影响 试验结果（图5）表明，不同pH对病原菌菌丝生长影响较大，菌丝仅在pH 6～8能生长，最适为pH 7。
2.3.4不同碳源对病原菌菌丝生长的影响 试验结果（图6）表明，病原菌菌丝在乳糖和甘露醇培养基上生长最快，二者的菌落直径显著大于其他碳源培养基上的菌落直徑，其次为D一麦芽糖、蔗糖和葡萄糖，在无碳源的培养基上病原菌虽然可以生长，但菌丝较稀疏、颜色较浅。
2.3.5不同氮源对病原菌菌丝生长的影响 试验结果（图7）表明，病原菌菌丝在蛋白胨培养基上生长最快，其菌落直径显著大于其他氮源培养基上的菌落直径，其次为酵母浸粉、磷酸氢二铵和硝酸钠，在无氮源的培养基上病原菌虽然可以生长，但菌丝较稀疏、颜色较浅。
2.3.6不同光照条件对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 3种光照条件对病原菌菌丝生长有一定影响，以全黑暗条件下病原菌菌丝生长最快，其菌落直径显著大于其他2种光照条件下的菌落直径；全光照和12 h光暗交替处理对病原菌菌丝生长的影响不明显。不同光照处理对病原菌产孢有显著影响，12 h黑暗+12 h光照交替条件下有利于病原菌产孢，在此光照条件下的产孢量显著多于其他2种光照条件下的产孢量，全黑暗和全光照条件下的产孢量较少。 2.3.7病原菌菌丝的致死温度和时间 病原菌菌丝在7个不同温度梯度（40、45、50、55、60、65和70℃）下分别处理5、10和15 min后，发现40～55℃各处理的病原菌菌丝均能生长，60～70℃各处理的病原菌菌丝均不能生长；经过56、57、58和59℃等4个温度下分别处理5、10和15 min后，56和57℃各处理的病原菌菌丝均能生长，58℃处理15 min及59℃各处理的病原菌菌丝均不能生长，表明病原菌菌丝的致死温度和时间为58℃处理15 min。
2.3.8病原菌分生孢子的致死温度和时间 病原菌分生孢子悬浮液在7个不同温度梯度（40、45、50、55、60、65和70℃）下分别处理5、10和15 min）～，发现40～50℃各处理的病原菌分生孢子悬浮液在PDA培养基上均能形成新的菌落，55～70℃各处理的病原菌分生孢子悬浮液在PDA培养基上均不能形成新的菌落；经过51、52、53和54℃等4个温度下分别处理5、10和15 min后，各处理在PDA培养基上均不能形成新的菌落，表明病原菌分生孢子的致死温度和时间为51℃处理5 min。
3讨论
本研究中，香蕉多主棒孢菌菌丝在10～40℃均能生长，适宜温度为25～35℃，最适温度为28℃，与云南香蕉棒孢霉叶斑病于7～9月温度高、湿度大的季节集中发生流行的规律一致。与黄瓜（刘鸣滔，2005；吴桥，2017）、橡胶树（张贺等，2007；张春霞等，2010）、番木瓜（罗霓等，2009）、广藿香（陈旭玉等，2012）、甜瓜（王爽等，2013）和蔬菜（杨苗，2013）等来源不同或相同地区的不同寄主的多主棒孢菌相比，香蕉多主棒孢菌适应生长的温度范围广，适宜生长的温度高，与杨苗（2013）发现的多主棒孢菌对不同温度的敏感性与寄主来源密切相关、与地理来源不相关的结果一致。本研究结果表明，病原菌菌丝的致死温度和时间为58℃处理15 min，分生孢子的致死温度和时间为51℃处理5 min，与张贺等（2007）报道的橡胶多主棒孢菌菌丝致死温度和时间为60℃处理15 min，分生孢子致死温度和时间为55℃处理5 min，以及关国经等（2006）报道的烤烟多主棒孢菌分生孢子致死温度和时间为55℃处理10 min均有差异，可能与不同的寄主及来源有关。
在3种光照条件下香蕉多主棒孢菌菌丝生长均良好，全黑暗条件下病原菌菌丝生长最快，全光照和12 h光暗交替处理对菌丝生长无显著影响，12 h光暗交替有利于病原菌产孢，说明该病原菌产孢量对光照敏感，与邹庆道等（2002）、张贺等（2007）的报道一致，但与罗霓等（2009）、陈旭玉等（2012）的研究结果存在差异。
香蕉多主棒孢菌对pH较敏感，菌丝仅在接近中性（pH 6-8）的条件下生长，最适pH为7。而黄瓜（刘鸣滔，2005）、橡胶树（张贺等，2007；张春霞等，2010）、番木瓜（罗霓等，2009）和广藿香（陈旭玉等，2012）的多主棒孢菌对pH适应范围较广，在pH 3-11范围内均能生长。本研究中的多主棒孢菌系首次分离自云南蕉园中，通过研究发现，香蕉棒孢霉叶斑病病原菌与不同寄主作物来源的多主棒孢菌菌株问的生物学特性存在明显差異，可能与菌株遗传或生理性差异等有关，具体原因需对病原菌开展进一步研究。香蕉棒孢霉叶斑病是云南香蕉产区的主要叶斑病之一，对云南香蕉产量和品质影响较大，今后应加强对该病害的防控研究，以控制其发生危害。
4结论
香蕉棒孢霉叶斑病病原菌与不同寄主作物来源的多主棒孢菌菌株间的生物学特性存在明显差异，该病原菌菌丝生长温度范围较宽，偏好高温，但适应的pH较窄，病原菌菌丝仅在接近中性的条件下生长；病原菌产孢的关键因子是培养基营养成分和光照条件。
（责任编辑 麻小燕）
关键词：香蕉叶斑病；多主棒孢菌；生物学特性；云南省
中图分類号：S432.4 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）03-0481-07
0引言
[研究意义]香蕉棒孢霉叶斑病是云南香蕉产区的主要叶斑病害之一，该病病原菌为多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（Berk&Curt）Wei]（桑利伟，2007），以温度高、湿度大的7-9月发生较严重，受害严重的蕉园病叶发生率在75%以上，且病害有逐年加重的趋势，严重影响了香蕉的产量和品质。香蕉棒孢霉叶斑病病害症状主要表现为：发病初期，在叶片上形成黄褐色的水浸状斑点，病斑稍凹陷，后期中央为灰白色的褐色病斑，呈半透明，产生黄色晕圈，叶面上有灰褐色霉层，病斑形状为椭圆形至圆形，或呈不规则状，最后整张叶片干枯、死亡。目前，对香蕉棒孢霉叶斑病的研究主要集中在病害发生及病原鉴定等方面，尚缺乏针对其病原菌生物学特性的系统研究。因此，明确香蕉棒孢霉叶斑病病原菌的生物学特性，对有针对性地开展病害防治具有重要意义。[前人研究进展]多主棒孢菌最早由魏景超（1982）报道定名。张贺等（2007）报道，多主棒孢菌是一个复杂的病原菌群体，来源于不同区域或同一区域不同寄主间的多主棒孢菌生物学特性存在差异。该病原菌侵染范围较广，侵染力强，能侵染70多种作物（关国经等，2000；李明远等，2001；邹庆道等，2002；张贺等，2007；张丽丽等，2008；罗霓等，2009；陈旭玉等，2012），引起叶斑、茎秆、果实腐烂等病害症状。Blazaquez于1969年报道该病原菌在香蕉上发生危害；桑利伟（2007）对海南岛的香蕉真菌病害进行调查与鉴定时发现，在海南岛有香蕉棒孢霉叶斑病发生；林善海等（2011）报道在广西香蕉主产区有香蕉棒孢霉叶斑病发生，并对香蕉棒孢霉叶斑病菌进行了分离鉴定。[本研究切入点]目前，关于香蕉棒孢霉叶斑病病原菌的生物学特性研究尚无文献报道。[拟解决的关键问题]在对云南省香蕉棒孢霉叶斑病病原菌进行单孢分离、形态特征观察及致病性测定的基础上，研究在不同培养基、碳源、氮源、温度、pH和光照条件下病原菌的生物学特性，旨在为香蕉棒孢霉叶斑病的综合防治提供科学依据。
1材料与方法
1.1标样采集及病原菌菌株分离
从云南省香蕉种植区西双版纳州打洛县采集发病巴西蕉叶片，取病斑病健交界处组织作为分离材料，采用常规组织分离法分离病原菌（方中达，2001），置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，28℃生化培养箱恒温培养2 d，纯化菌丝2次，待菌丝产孢后用单孢分离法挑取单孢至PDA斜面培养基上于4℃冰箱保存，供鉴定和生物学特性测定。
1.2病原菌形态特征观察
单孢菌株转接至PDA培养基上于28℃生化培养箱恒温培养7 d后，观察病原菌菌落形状、颜色、菌丝疏密程度等。培养15 d后，光学显微镜下观察病原菌形态特征，并测量计算分生孢子大小。
1.3病原菌致病性测定
采用针刺接种法，将病原菌菌丝块接种于温室内种植的健康巴西蕉叶片（接种7-8张叶片）上，以纯PDA培养基接种为对照，重复4次。接种叶片先用70%酒精进行表面消毒，然后用灭菌大头针将接种部位刺伤，再把PDA培养基上培养15 d的病原菌菌饼（直径为5 mm）接种于刺伤部位，用灭菌湿棉球保湿接种部位48 h，定期观察病害发生情况，发病后，取病健交界处叶片组织分离病原菌，对分离获得的病原菌进行形态特征观察。
1.4病原菌生物学特性测定
1.4.1不同营养成分培养基对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 参照刘秀娟等（1996）、方中达（2001）的方法配制黑麦琼脂培养基（MAS）、燕麦琼脂培养基（OA）、PDA培养基、玉米琼脂培养基（CMA）、胡萝卜琼脂培养基（cA）和马铃薯蔗糖培养基（PSA）等6种供试培养基。接种方法：病原菌在PDA培养基上培养7 d后，用直径为5mm的灭菌打孔器打取菌龄大小一致的菌丝块，菌丝块面向下接种于备用的6种培养基中间，每处理重复4次。置28℃恒温培养箱培养7和1 5 d后，分别用十字交叉法测量计算菌落大小，显微镜检测10×10倍下的孢子数，每处理检测10个显微镜视野，每处理重复4次。
1.4.2不同温度对病原菌菌丝生长的影响 参照肖仲久和李小霞（2013）的方法，测定病原菌菌丝在5、10、15、20、25、28、30、35和40℃等9个温度下的生长情况，每处理重复4次，方法同1.4.1。
1.4.3不同pH对病原菌菌丝生长的影响 采用PDA培养基，测定病原菌菌丝在培养基pH 5、6、7、8、9和10等6个梯度（PDA培养基灭菌后冷却至60℃左右时，用1 mol/L 0.1%NaOH和HCl溶液调配灭菌培养基pH）下的生长情况（唐爽爽等，2014），每处理重复4次，方法同1.4.1。 1.4.4不同碳源对病原菌菌丝生长的影响 以剔除碳源后的查氏（Czapek）培养基为基础培养基，分别配制成含蔗糖、D一麦芽糖、葡萄糖、甘露醇和乳糖等5种碳源的固体培养基，对照为不加碳源查氏培养基。测定不同碳源对菌丝生长的影响，每处理重复4次，方法同1.4.1。
1.4.5不同氮源对病原菌菌丝生长的影响 以剔除氮源后的查氏（czapek）培养基为基础培养基，分别配制成含蛋白胨、酵母浸粉、硝酸钠、磷酸氢二铵和脲等5种氮源的固体培养基，对照为不加氮源查氏培养基。测定不同氮源对病原菌菌丝生长的影响，每处理重复4次，方法同1.4.1。
1.4.6不同光照条件对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 设24 h黑暗、24 h光照和12 h黑暗+12 h光照交替等3种光照条件处理，测定不同光照条件对病原菌菌丝生长的影响，每处理重复4次，方法同1.4.1。
1.4.7病原菌菌丝致死温度和时间测定 综合参照张贺等（2007）、孙志峰等（2008）、杨永利等（2015）的方法，病原菌在PDA培养基上培养7 d后，无菌环境下分别用100 mL无菌水将每个培养基中的菌丝制成菌悬液，各取10 mL菌悬液装入灭菌试管并塞上试管塞，在40、45、50、55、60、65和70℃的恒温水浴锅中分别水浴处理5、10和15 min，水浴过程中缓慢摇动试管。处理结束后降至室温，用移液枪取0.2 mL不同处理的菌悬液涂布于PDA培养基上，于28℃生化培养箱中恒温培养72 h后，观察培养基上有无菌落生长，以未经过温度处理的菌悬液为对照，每处理重复4次。
1.4.8病原菌分生孢子致死温度和时间测定 病原菌在PDA培养基上培养15 d后，于10×10倍显微镜下配制浓度为每个视野10～15个孢子的悬浮液，取10 mL分生孢子悬浮液装入灭菌试管并塞上试管塞，在40、45、50、55、60、65和70℃的恒温水浴锅中分别处理5、10和15 min，水浴过程中缓慢摇动试管，浴后立即取出降至室温（张贺等，2007；孙志峰等，2008；杨永利等，2015），用移液枪取0.2 mL不同处理的菌悬液涂布于PDA培养基上，于28℃生化培养箱中恒温培养72 h后，观察培养基上有无菌落生长，以未经过温度处理的孢子悬浮液为对照，每处理重复4次。
1.5统计分析
采用Excel 2003进行数据分析和多重比较。
2结果与分析
2.1病原菌形态特征描述
在PDA培养基上，病原菌菌落疏展，灰色至灰褐色，呈毛发状或细绒毛状，气生菌丝茂盛，菌落中央颜色较边缘深并隆起（图1-A），菌落背面中央呈黑褐色（图1-B）。分生孢子梗单生或数根丛生，直立或弯曲，不分枝，褐色，光滑，具1-7个隔膜。菌丝有分隔，浅褐色，有隔膜。分生孢子顶生、单生，浅褐色，棍棒状至圆筒形，直或稍弯，顶端渐尖细，基部平切具孢脐，大小（30-220）gmx（10-20）um（图1-C）。结合其菌落特征及戚佩坤（2000）、林善海等（2011）关于该菌的特征描述，鉴定该菌为多主棒孢菌[C. cas-siicola（Berk&Curt）Wei]。
2.2病原菌致病性测定结果
接种病原菌3 d后开始巴西蕉叶片表现发病症状，接种部位呈黄褐色水浸状斑点，后期逐渐扩展成圆形至椭圆形褐色病斑，周围有黄色晕圈，中央灰白色、半透明，后期病部可见灰黑色霉层（图2-A）。接种病原菌后的表现症状与大田自然发生症状（图2-B）相似，并从接种发病病斑组织病健交界处能再次分离到与供试病原菌菌落形态、分生孢子形态一致的菌株，对照叶片无发病症状。
2.3病原菌生物学特性测定结果
2.3.1不同营养成分培养基对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 由图3可知，病原菌在供试6种培养基上均能较好地生长，其中最适培养基为PDA培养基，其次是MAS培养基，二者的菌落直径显著大于其他培养基上的菌落直径（P<0.05，下同），随后是OA和PSA培养基，但在OA培养基上病原菌菌丝稀疏、颜色浅，在CMA和CA培养基上病原菌生长速度稍慢。培养基对病原菌产孢量影响亦较大，其中产孢最适培养基为CMA培养基，其产孢量显著多于其他培养基的产孢量，其次为CA培养基，在OA、MAS、PSA和PDA培养基上产孢均较少。
2.3.2不同温度对病原菌菌丝生长的影响 试验结果（图4）表明，温度对病原菌菌丝生长有显著影响，10～40℃下病原菌均能长出菌丝，但生长差异明显，25～35℃时病原菌菌丝生长良好，其中在28℃下菌落直径最大，显著大于其他温度（30℃除外）条件下的菌落直径，28℃为菌丝的最适生长温度。
2.3.3不同pH对病原菌菌丝生长的影响 试验结果（图5）表明，不同pH对病原菌菌丝生长影响较大，菌丝仅在pH 6～8能生长，最适为pH 7。
2.3.4不同碳源对病原菌菌丝生长的影响 试验结果（图6）表明，病原菌菌丝在乳糖和甘露醇培养基上生长最快，二者的菌落直径显著大于其他碳源培养基上的菌落直徑，其次为D一麦芽糖、蔗糖和葡萄糖，在无碳源的培养基上病原菌虽然可以生长，但菌丝较稀疏、颜色较浅。
2.3.5不同氮源对病原菌菌丝生长的影响 试验结果（图7）表明，病原菌菌丝在蛋白胨培养基上生长最快，其菌落直径显著大于其他氮源培养基上的菌落直径，其次为酵母浸粉、磷酸氢二铵和硝酸钠，在无氮源的培养基上病原菌虽然可以生长，但菌丝较稀疏、颜色较浅。
2.3.6不同光照条件对病原菌菌丝生长和产孢量的影响 3种光照条件对病原菌菌丝生长有一定影响，以全黑暗条件下病原菌菌丝生长最快，其菌落直径显著大于其他2种光照条件下的菌落直径；全光照和12 h光暗交替处理对病原菌菌丝生长的影响不明显。不同光照处理对病原菌产孢有显著影响，12 h黑暗+12 h光照交替条件下有利于病原菌产孢，在此光照条件下的产孢量显著多于其他2种光照条件下的产孢量，全黑暗和全光照条件下的产孢量较少。 2.3.7病原菌菌丝的致死温度和时间 病原菌菌丝在7个不同温度梯度（40、45、50、55、60、65和70℃）下分别处理5、10和15 min后，发现40～55℃各处理的病原菌菌丝均能生长，60～70℃各处理的病原菌菌丝均不能生长；经过56、57、58和59℃等4个温度下分别处理5、10和15 min后，56和57℃各处理的病原菌菌丝均能生长，58℃处理15 min及59℃各处理的病原菌菌丝均不能生长，表明病原菌菌丝的致死温度和时间为58℃处理15 min。
2.3.8病原菌分生孢子的致死温度和时间 病原菌分生孢子悬浮液在7个不同温度梯度（40、45、50、55、60、65和70℃）下分别处理5、10和15 min）～，发现40～50℃各处理的病原菌分生孢子悬浮液在PDA培养基上均能形成新的菌落，55～70℃各处理的病原菌分生孢子悬浮液在PDA培养基上均不能形成新的菌落；经过51、52、53和54℃等4个温度下分别处理5、10和15 min后，各处理在PDA培养基上均不能形成新的菌落，表明病原菌分生孢子的致死温度和时间为51℃处理5 min。
3讨论
本研究中，香蕉多主棒孢菌菌丝在10～40℃均能生长，适宜温度为25～35℃，最适温度为28℃，与云南香蕉棒孢霉叶斑病于7～9月温度高、湿度大的季节集中发生流行的规律一致。与黄瓜（刘鸣滔，2005；吴桥，2017）、橡胶树（张贺等，2007；张春霞等，2010）、番木瓜（罗霓等，2009）、广藿香（陈旭玉等，2012）、甜瓜（王爽等，2013）和蔬菜（杨苗，2013）等来源不同或相同地区的不同寄主的多主棒孢菌相比，香蕉多主棒孢菌适应生长的温度范围广，适宜生长的温度高，与杨苗（2013）发现的多主棒孢菌对不同温度的敏感性与寄主来源密切相关、与地理来源不相关的结果一致。本研究结果表明，病原菌菌丝的致死温度和时间为58℃处理15 min，分生孢子的致死温度和时间为51℃处理5 min，与张贺等（2007）报道的橡胶多主棒孢菌菌丝致死温度和时间为60℃处理15 min，分生孢子致死温度和时间为55℃处理5 min，以及关国经等（2006）报道的烤烟多主棒孢菌分生孢子致死温度和时间为55℃处理10 min均有差异，可能与不同的寄主及来源有关。
在3种光照条件下香蕉多主棒孢菌菌丝生长均良好，全黑暗条件下病原菌菌丝生长最快，全光照和12 h光暗交替处理对菌丝生长无显著影响，12 h光暗交替有利于病原菌产孢，说明该病原菌产孢量对光照敏感，与邹庆道等（2002）、张贺等（2007）的报道一致，但与罗霓等（2009）、陈旭玉等（2012）的研究结果存在差异。
香蕉多主棒孢菌对pH较敏感，菌丝仅在接近中性（pH 6-8）的条件下生长，最适pH为7。而黄瓜（刘鸣滔，2005）、橡胶树（张贺等，2007；张春霞等，2010）、番木瓜（罗霓等，2009）和广藿香（陈旭玉等，2012）的多主棒孢菌对pH适应范围较广，在pH 3-11范围内均能生长。本研究中的多主棒孢菌系首次分离自云南蕉园中，通过研究发现，香蕉棒孢霉叶斑病病原菌与不同寄主作物来源的多主棒孢菌菌株问的生物学特性存在明显差異，可能与菌株遗传或生理性差异等有关，具体原因需对病原菌开展进一步研究。香蕉棒孢霉叶斑病是云南香蕉产区的主要叶斑病之一，对云南香蕉产量和品质影响较大，今后应加强对该病害的防控研究，以控制其发生危害。
4结论
香蕉棒孢霉叶斑病病原菌与不同寄主作物来源的多主棒孢菌菌株间的生物学特性存在明显差异，该病原菌菌丝生长温度范围较宽，偏好高温，但适应的pH较窄，病原菌菌丝仅在接近中性的条件下生长；病原菌产孢的关键因子是培养基营养成分和光照条件。
（责任编辑 麻小燕）