【摘 要】
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目的:构建T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3基因及其融合蛋白真核表达载体,并对TIM-3基因进行生物信息学分析.方法:采用Trizol法从人外周血单个核细胞提取总mRNA,利用两步法RT-PCR技
【机 构】
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广西壮族自治区人民医院检验科,华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科
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目的:构建T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3基因及其融合蛋白真核表达载体,并对TIM-3基因进行生物信息学分析.方法:采用Trizol法从人外周血单个核细胞提取总mRNA,利用两步法RT-PCR技术扩增TIM-3及其胞外(结构)域基因片段和人IgGl Fc基因片段.并将他们分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,通过PCR及测序进行鉴定.序列分析后将TIM-3胞外(结构)域基因片段亚克隆到已经克隆了人IgGl Fc基因片段真核表达载体pcDAN3.1(+)上；并通过PCR及双酶切进行鉴定.应用生物信息学初步分析TIM-3基因的物理化学性质、蛋白质结构域、功能.结果:成功从PBMC中提取并逆转录的cDNA扩增出TIM-3及其胞外(结构)域基因和人IgGl Fc基因；经PCR、酶切鉴定、测序分析表明它们与GenBank提供的序列信息完全相同.生物信息学分析结果表明TIM-3蛋白为稳定亲水性蛋白,有1个跨膜螺旋结构,相对分子量是33.4KD,等电点pI为5.54.该蛋白含约32.56％的α-螺旋,8.27％的延伸链,49.17％的不规则卷曲,1段21个氨基酸组成的信号肽.TIM-3蛋白亚细胞定位于内质网、高尔基体、液泡、细胞膜上.功能分析预测TIM-3蛋白具有受体和信号转导功能.结论:成功构建TIM-3基因及其融合蛋白真核表达载体,并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析.了解TIM-3基因的性质特征,为进一步研究该基因奠定基础.
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