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【摘 要】目的：观察姜黄素对人子宫内膜癌细胞株增殖和迁移能力的影响并探讨其可能机制。方法：用姜黄素处理子宫内膜癌细胞株HEC-1B细胞，ATP敏感钾通道（KATP）开放剂二氮嗪预处理细胞。实验分为对照组、不同浓度姜黄素组、二氮嗪组和二氮嗪+ 姜黄素组。采用MTT检测细胞增殖，体外划痕和Transwell小孔实验检测HEC-1B细胞的迁移侵袭力。结果：姜黄素以浓度和剂量依赖的方式抑制了HEC-1B细胞的增殖（均P<0.05）。与对照组比较，姜黄素处理组抑制HEC-1B细胞向向划痕区生长的速度，显著降低了HEC-1B细胞划痕修复率（均P<0.05）。KATP通道开放剂二氮嗪逆转了姜黄素抑制人子宫内膜癌细胞增殖和迁移的作用。结论：姜黄素抑制了子宫内膜癌细胞的增殖和迁移能力，其机制与姜黄素抑制KATP通道有关。
【关键词】姜黄素；ATP；子宫内膜癌
【文章编号】1004-7484（2014）07-4158-02
子宫内膜癌（endometrial carcinoma）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，大约占女性肿瘤疾病的6-7%[1]。因此寻找到新的有效的抑制高子宫内膜癌增殖、侵袭和迁移能力的途径和方法具有十分重要的意义。研究表明姜黄素对多种肿瘤细胞均具有抑制作用[2]。ATP敏感钾通道（ATP-sensitive K+ channels， KATP）在肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移中发挥了关键作用[3]。因此本研究观察了姜黄素对人子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响并探讨KATP通道在其中的作用，为子宫内膜癌的治疗提供新的线索。
1材料和方法
1.1材料
姜黄素、线粒体ATP敏感钾通道开放剂二氮嗪、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）和四甲基偶氮唑盐（MTT）均购自Sigma公司；DMEM培养基购自Invitrogen公司，胎牛血清购自杭州四季青公司；电子天平（Satorius，日本）；CO2细胞培养箱（Becton-Dickinson，美国），低温高速离心机（Ependorff，美国）。
1.2实验方法
1.2.1人子宫内膜癌细胞株培养和分组
用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养人子宫内膜癌细胞株HEC-1B细胞（购于中国医学科学院细胞中心），培养于37℃、相对湿度90%、5% CO2 培养箱中培，细胞呈贴壁生长。实验分为对照组、姜黄素处理组（10、50和100 μmol/L）、
ATP敏感钾通道开放剂二氮嗪组：100μmol/L二氮嗪敷育细胞、二氮嗪 + 姜黄素组：用100 μmol/L 二氮嗪预敷育细胞30min后，用100μmol/L的姜黄素敷育细胞48 h。姜黄素用DMSO溶解，DMSO在培养液中的浓度控制在1‰以内。
1.2.2 MTT实验
取对数生长期的HEC-1B细胞，按2×103个细胞/孔接种于96孔培养板，培养24h。用DMSO溶解姜黄素，加入DMEM培养液稀释。细胞贴壁后，加入终浓度分别为10、50和100μmol/L的姜黄素，每组设3个复孔。培养12、24和48h后，加入10μL MTT（5 mg/mL），继续培养4h后吸去培养液，加入0.1mL DMSO。在Bio-Rad550酶联免疫检测仪上检测波长为570nm的吸光度（A）值。细胞增殖抑制率=（对照组A值-实验组A值/对照组A值）×100%。
1.2.3细胞划痕实验
将HEC-1B细胞接种于12孔细胞培养板中，当细胞生长达到约80%的融合度时，用200μL移液器的枪头沿着细胞培养板的底部划“一”字型的横线，将培养基更换为无血清的培养基，倒置显微镜下在不同时间点观察细胞的迁移情况，记录并测量细胞从迁移起点到迁移最远端之间的距离，用这个距离反映细胞迁移的速度，并计算划痕修复率。实验重复3次，取其平均值。
1.2.4 Transwell实验
将Transwell培养小室插入到24孔细胞培养板中，取2×106个HEC-1B细胞，用200μL无血清的DMEM培养基制备成细胞悬液。将细胞悬液缓慢加入到Transwell小室的上层，小室的下层中加入含胎牛血清（20%）的DMEM培养基作为趋化因子，37℃、相对湿度90%、5% CO2 培养箱中培养24h。将Transwell培养小室取出，吸出小室中培养基，小心擦去上层细胞，PBS洗3次，倒置晾干。室温下10%中性甲醇固定10 min，倒置晾干， 结晶紫（0.1%）染色5 min，清水漂洗数次，倒置晾干后，用刀片揭膜，封片。显微镜下观察结果，随机计数选取6个视野，计数结晶紫染色阳性的细胞数，即为穿膜细胞数。
3讨论
子宫内膜癌又称为子宫体癌，是妇科常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于子宫颈癌。子宫内膜癌的病理类型可分为腺癌、鳞腺癌、腺角化癌和透明细胞癌。目前研究认为子宫内膜癌是一种激素依赖性肿瘤，它的发生发展与雌激素的长期刺激及缺乏孕激素的有效拮抗高度相关[4]。子宫内膜癌复发率高，生存率低，治疗的效果不理想。
近年来研究发现姜黄素具有抗肿瘤的作用，能抑制多种肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡分化，是一种有开发前景的天然抗肿瘤新药。由于姜黄素其抗肿瘤谱较广、副作用小，因此被美国国立癌症所列为第三代肿瘤化学预防药。
恶性肿瘤细胞的迁移和侵袭能力是肿瘤转移的细胞学基础，也是导致患者其他器官受损甚至死亡的主要原因。抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，是治疗恶性肿瘤的重要措施。本研究的结果显示姜黄素以浓度和剂量依赖的方式抑制了人子宫内膜癌细胞株HEC-1B细胞的增殖，降低了其侵袭迁移能力。这些结果表明姜黄素能抑制子宫内膜癌的增殖和迁移，是子宫内膜癌的一种有效的治疗手段。
研究表明ATP 敏感钾通道的开放可引起细胞线粒体膜的去极化，抑制细胞色素C 从线粒体释放到胞质，抑制线粒体途径的细胞凋亡。本研究结果显示KATP通道开放剂二氮嗪逆转了姜黄素抑制人子宫内膜癌细胞增殖和迁移的作用。这表明姜黄素抑制人子宫内膜癌细胞增殖和迁移其机制可能与姜黄素抑制ATP敏感钾通道有关。
总之，姜黄素抑制人子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，而其机制可能与姜黄素抑制ATP敏感钾通道有关。但是姜黄素如何影响人子宫内膜癌内信号转导通路及其具体环节还需要进一步研究。
参考文献
[1] 陈亚玲.早期子宫内膜癌的治疗方法探究[J].中国医药导报，2012，9（3）：86-89
[2] 孙永，方泰惠，周静，周鸣鸣，徐斌.姜黄素对乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞增殖、侵袭的影响及其机制探讨[J].山东医药，2011，51（14）：66-67
[3] 胡红玲，张珍祥，赵建平，江涛，徐永健.缺氧肺动脉平滑肌细胞中线粒体ATP敏感钾通道开放对细胞色素C的分布及细胞增殖的作用[N].生理学报，2006，58（3）： 262-268
[4] 王淑芳，冯玉珍，霍新龙.MicroRNA在子宫内膜癌发生、发展及临床诊治中的研究[J].中国医药导报，2013，10（6）：52-55
【关键词】姜黄素；ATP；子宫内膜癌
【文章编号】1004-7484（2014）07-4158-02
子宫内膜癌（endometrial carcinoma）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，大约占女性肿瘤疾病的6-7%[1]。因此寻找到新的有效的抑制高子宫内膜癌增殖、侵袭和迁移能力的途径和方法具有十分重要的意义。研究表明姜黄素对多种肿瘤细胞均具有抑制作用[2]。ATP敏感钾通道（ATP-sensitive K+ channels， KATP）在肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移中发挥了关键作用[3]。因此本研究观察了姜黄素对人子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响并探讨KATP通道在其中的作用，为子宫内膜癌的治疗提供新的线索。
1材料和方法
1.1材料
姜黄素、线粒体ATP敏感钾通道开放剂二氮嗪、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）和四甲基偶氮唑盐（MTT）均购自Sigma公司；DMEM培养基购自Invitrogen公司，胎牛血清购自杭州四季青公司；电子天平（Satorius，日本）；CO2细胞培养箱（Becton-Dickinson，美国），低温高速离心机（Ependorff，美国）。
1.2实验方法
1.2.1人子宫内膜癌细胞株培养和分组
用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养人子宫内膜癌细胞株HEC-1B细胞（购于中国医学科学院细胞中心），培养于37℃、相对湿度90%、5% CO2 培养箱中培，细胞呈贴壁生长。实验分为对照组、姜黄素处理组（10、50和100 μmol/L）、
ATP敏感钾通道开放剂二氮嗪组：100μmol/L二氮嗪敷育细胞、二氮嗪 + 姜黄素组：用100 μmol/L 二氮嗪预敷育细胞30min后，用100μmol/L的姜黄素敷育细胞48 h。姜黄素用DMSO溶解，DMSO在培养液中的浓度控制在1‰以内。
1.2.2 MTT实验
取对数生长期的HEC-1B细胞，按2×103个细胞/孔接种于96孔培养板，培养24h。用DMSO溶解姜黄素，加入DMEM培养液稀释。细胞贴壁后，加入终浓度分别为10、50和100μmol/L的姜黄素，每组设3个复孔。培养12、24和48h后，加入10μL MTT（5 mg/mL），继续培养4h后吸去培养液，加入0.1mL DMSO。在Bio-Rad550酶联免疫检测仪上检测波长为570nm的吸光度（A）值。细胞增殖抑制率=（对照组A值-实验组A值/对照组A值）×100%。
1.2.3细胞划痕实验
将HEC-1B细胞接种于12孔细胞培养板中，当细胞生长达到约80%的融合度时，用200μL移液器的枪头沿着细胞培养板的底部划“一”字型的横线，将培养基更换为无血清的培养基，倒置显微镜下在不同时间点观察细胞的迁移情况，记录并测量细胞从迁移起点到迁移最远端之间的距离，用这个距离反映细胞迁移的速度，并计算划痕修复率。实验重复3次，取其平均值。
1.2.4 Transwell实验
将Transwell培养小室插入到24孔细胞培养板中，取2×106个HEC-1B细胞，用200μL无血清的DMEM培养基制备成细胞悬液。将细胞悬液缓慢加入到Transwell小室的上层，小室的下层中加入含胎牛血清（20%）的DMEM培养基作为趋化因子，37℃、相对湿度90%、5% CO2 培养箱中培养24h。将Transwell培养小室取出，吸出小室中培养基，小心擦去上层细胞，PBS洗3次，倒置晾干。室温下10%中性甲醇固定10 min，倒置晾干， 结晶紫（0.1%）染色5 min，清水漂洗数次，倒置晾干后，用刀片揭膜，封片。显微镜下观察结果，随机计数选取6个视野，计数结晶紫染色阳性的细胞数，即为穿膜细胞数。
3讨论
子宫内膜癌又称为子宫体癌，是妇科常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于子宫颈癌。子宫内膜癌的病理类型可分为腺癌、鳞腺癌、腺角化癌和透明细胞癌。目前研究认为子宫内膜癌是一种激素依赖性肿瘤，它的发生发展与雌激素的长期刺激及缺乏孕激素的有效拮抗高度相关[4]。子宫内膜癌复发率高，生存率低，治疗的效果不理想。
近年来研究发现姜黄素具有抗肿瘤的作用，能抑制多种肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡分化，是一种有开发前景的天然抗肿瘤新药。由于姜黄素其抗肿瘤谱较广、副作用小，因此被美国国立癌症所列为第三代肿瘤化学预防药。
恶性肿瘤细胞的迁移和侵袭能力是肿瘤转移的细胞学基础，也是导致患者其他器官受损甚至死亡的主要原因。抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，是治疗恶性肿瘤的重要措施。本研究的结果显示姜黄素以浓度和剂量依赖的方式抑制了人子宫内膜癌细胞株HEC-1B细胞的增殖，降低了其侵袭迁移能力。这些结果表明姜黄素能抑制子宫内膜癌的增殖和迁移，是子宫内膜癌的一种有效的治疗手段。
研究表明ATP 敏感钾通道的开放可引起细胞线粒体膜的去极化，抑制细胞色素C 从线粒体释放到胞质，抑制线粒体途径的细胞凋亡。本研究结果显示KATP通道开放剂二氮嗪逆转了姜黄素抑制人子宫内膜癌细胞增殖和迁移的作用。这表明姜黄素抑制人子宫内膜癌细胞增殖和迁移其机制可能与姜黄素抑制ATP敏感钾通道有关。
总之，姜黄素抑制人子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，而其机制可能与姜黄素抑制ATP敏感钾通道有关。但是姜黄素如何影响人子宫内膜癌内信号转导通路及其具体环节还需要进一步研究。
参考文献
[1] 陈亚玲.早期子宫内膜癌的治疗方法探究[J].中国医药导报，2012，9（3）：86-89
[2] 孙永，方泰惠，周静，周鸣鸣，徐斌.姜黄素对乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞增殖、侵袭的影响及其机制探讨[J].山东医药，2011，51（14）：66-67
[3] 胡红玲，张珍祥，赵建平，江涛，徐永健.缺氧肺动脉平滑肌细胞中线粒体ATP敏感钾通道开放对细胞色素C的分布及细胞增殖的作用[N].生理学报，2006，58（3）： 262-268
[4] 王淑芳，冯玉珍，霍新龙.MicroRNA在子宫内膜癌发生、发展及临床诊治中的研究[J].中国医药导报，2013，10（6）：52-55